選做實驗-抗菌藥物篩選實驗方法與技術(shù)

1、選做實驗-抗菌藥物篩選實驗方法與技術(shù)v 一個新的化合物或別離提取有效成分是否有抗菌作用，需要一個新的化合物或別離提取有效成分是否有抗菌作用，需要藥理實驗來證實，首先采用體外實驗方法，觀察試驗物對細藥理實驗來證實，首先采用體外實驗方法，觀察試驗物對細菌有無殺滅作用或抑制作用，體外實驗的重要性在于方法簡菌有無殺滅作用或抑制作用，體外實驗的重要性在于方法簡便，用藥量少，短時間內(nèi)能判斷藥物抗菌的廣度和強度，為便，用藥量少，短時間內(nèi)能判斷藥物抗菌的廣度和強度，為深入體外實驗和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。深入體外實驗和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。v 體外實驗是篩選抗菌藥物或測試新藥抗菌性能的重要環(huán)節(jié)。藥物對體外實驗是

2、篩選抗菌藥物或測試新藥抗菌性能的重要環(huán)節(jié)。藥物對細菌代謝的影響、可以使細胞呼吸量減低，或酶系統(tǒng)受到抑制等，細菌代謝的影響、可以使細胞呼吸量減低，或酶系統(tǒng)受到抑制等，因而出現(xiàn)細菌不生長或局部抑制，可借以判斷藥物對細菌有無抗菌因而出現(xiàn)細菌不生長或局部抑制，可借以判斷藥物對細菌有無抗菌作用，或抗菌范圍。體外實驗是細菌與藥物直接接觸，沒有機體諸作用，或抗菌范圍。體外實驗是細菌與藥物直接接觸，沒有機體諸因素參與，故體外和體內(nèi)實驗的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜因素參與，故體外和體內(nèi)實驗的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜合分析進行評價。合分析進行評價。一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?，掌握培養(yǎng)基的制備、高，掌握培

3、養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌、菌種培養(yǎng)、接壓蒸氣滅菌、菌種培養(yǎng)、接種等微生物培養(yǎng)技術(shù)；種等微生物培養(yǎng)技術(shù)；2，掌握化合物抗菌、抑菌，掌握化合物抗菌、抑菌活性篩選技術(shù)；活性篩選技術(shù)；3，掌握微孔板法、抑菌圈，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小濃度測試等根法抗菌最小濃度測試等根本操作技術(shù)。本操作技術(shù)。4，學會使用各種儀器設(shè)，學會使用各種儀器設(shè)備備 。實驗中使用的儀器設(shè)備：實驗中使用的儀器設(shè)備：1，手提式高壓蒸汽滅菌鍋；，手提式高壓蒸汽滅菌鍋；2，超凈工作臺；，超凈工作臺；3，各種移液器；，各種移液器；4，細菌恒溫培養(yǎng)箱；，細菌恒溫培養(yǎng)箱；5，微生物培養(yǎng)搖床；，微生物培養(yǎng)搖床；6，酶標儀；，酶標儀；二、微生

4、物培養(yǎng)基的配制、滅菌與培養(yǎng)二、微生物培養(yǎng)基的配制、滅菌與培養(yǎng)培養(yǎng)基是指利用人工方法將適合微培養(yǎng)基是指利用人工方法將適合微生物生長繁殖成積累代謝產(chǎn)物的各生物生長繁殖成積累代謝產(chǎn)物的各種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制而成的營養(yǎng)基種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微生物的別離、培養(yǎng)質(zhì)。主要用于微生物的別離、培養(yǎng)、鑒定以及菌種保藏等方面。、鑒定以及菌種保藏等方面。培養(yǎng)基一般應(yīng)含有微生物生長繁培養(yǎng)基一般應(yīng)含有微生物生長繁殖所需要的碳源、氮源、能源、無殖所需要的碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水等營養(yǎng)成分。機鹽、生長因子和水等營養(yǎng)成分。此外，為了滿有微生物生長繁殖此外，為了滿有微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的

5、要求，還必須或積累代謝產(chǎn)物的要求，還必須控制培養(yǎng)基的控制培養(yǎng)基的pHpH。培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。和半合成培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基分為按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基?；９腆w培養(yǎng)基是指在液體培養(yǎng)基中參加一定固體培養(yǎng)基是指在液體培養(yǎng)基中參加一定量的凝固劑量的凝固劑( (常加常加1.5%-2%1.5%-2%的瓊脂的瓊脂) )經(jīng)融化冷經(jīng)融化冷凝而成。凝而成。半固體培養(yǎng)這是指在液體培養(yǎng)基中參半固體培養(yǎng)這是指在液體培養(yǎng)基中參加加0.80.8-1-1左右的瓊脂

6、，經(jīng)融化冷凝左右的瓊脂，經(jīng)融化冷凝而成。而成。液體培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中不加凝固液體培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中不加凝固劑瓊脂，培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)。劑瓊脂，培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)。 一根本原理一根本原理v正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學實驗正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學實驗工作的重要根底。由于微生物種類及代謝類型的工作的重要根底。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。多，它們的配方及配制方法雖各有差異。v但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準備，

7、培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培的準備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等根本養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等根本環(huán)節(jié)大致相同。環(huán)節(jié)大致相同。 二實驗過程二實驗過程1 1，液體及固體培養(yǎng)基的配制過程，液體及固體培養(yǎng)基的配制過程 一般培養(yǎng)基的組成一般培養(yǎng)基的組成 牛肉膏牛肉膏 0.5g0.5g蛋白胨蛋白胨 1g1g NaCl 0.5g NaCl 0.5g 瓊脂瓊脂 1.5-2g1.5-2g水水 100ml100mlpH 7.2 pH 7.2 液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。(1)(1)稱量及溶化稱量及溶化 分別稱取蛋白胨、分別稱取蛋白

8、胨、NaClNaCl、牛、牛肉膏置于另一小燒杯中，進行稱量。然后參肉膏置于另一小燒杯中，進行稱量。然后參加少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。加少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。(2)(2)調(diào)調(diào)pH pH 待溶液冷至室溫時，用待溶液冷至室溫時，用0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH溶液調(diào)溶液調(diào)pHpH至至7.27.2。(3)(3)定容定容 將溶液倒入量筒中，補充水將溶液倒入量筒中，補充水量至所需體積。量至所需體積。(4)(4)固體培養(yǎng)基參加所需量的瓊脂，加熱融化，固體培養(yǎng)基參加所需量的瓊脂，加熱融化，補充失水。補充失水。(5)(5)分裝、加塞、包扎。分裝、加塞、包扎。(6)(6)高壓

9、蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌100 Pa100 Pa滅菌滅菌20 min20 min2 2，培養(yǎng)基的分裝，培養(yǎng)基的分裝液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定的量視試管大小及需要而定，假設(shè)所用試管大小為，假設(shè)所用試管大小為1515150 mm150 mm時，液體培養(yǎng)基時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度可分裝至試管高度1/41/4左右左右為宜約為宜約5ml5ml；分裝團體培養(yǎng)基時，在瓊脂分裝團體培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中分裝量為管高試管中分裝量為管高1/5(1/5(約約4-5ml)4-5ml)。3 3，棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎

10、，棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎 1 1試管棉塞的制作試管棉塞的制作 制棉塞時，應(yīng)選用大小、厚薄制棉塞時，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一快，鋪展于左手適中的普通棉花一快，鋪展于左手拇指和食指如成的圓孔上，用右手拇指和食指如成的圓孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口?？?。 將裝好培養(yǎng)基并塞好棉將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成塞或蓋好管帽的試管捆成捆，外捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。4 4，培養(yǎng)

11、基的滅菌，培養(yǎng)基的滅菌 高壓蒸汽滅菌是微生物學實驗、發(fā)酵工業(yè)生高壓蒸汽滅菌是微生物學實驗、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的一種產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的一種滅菌方法。滅菌方法。 1 1翻開滅菌鍋蓋，加適量水；翻開滅菌鍋蓋，加適量水；2 2將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。3 3將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，加將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，加蓋，上下螺栓口對齊，均勻旋緊螺栓，蓋，上下螺栓口對齊，均勻旋緊螺栓，使鍋密閉。使鍋密閉。4 4翻開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn)翻開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn)生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸上生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸

12、上升至所需溫度時，控制熱源，維持所需升至所需溫度時，控制熱源，維持所需壓力和溫度，并開始計時壓力和溫度，并開始計時20 min20 min后停止后停止加熱。加熱。5 5待壓力降至接近待壓力降至接近0 0時，慢慢翻開放時，慢慢翻開放汽閥汽閥( (排汽口排汽口) )，開蓋，立即取出滅菌物，開蓋，立即取出滅菌物品。品。5 5，斜面和平板的制作，斜面和平板的制作 將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒上，使試管，趁熱置于木棒上，使成適當斜度，凝固后即成斜成適當斜度，凝固后即成斜面面( (圖圖1-3)1-3)斜面長度不超過試斜面長度不超過試管長度管長度1/21/2為宜。為宜。

13、平板的制作平板的制作 6 6，斜面培養(yǎng)基接種，斜面培養(yǎng)基接種 斜面培養(yǎng)基接種法一斜面培養(yǎng)基接種法一般不用作別離培養(yǎng)，般不用作別離培養(yǎng)，僅使細菌繁殖為菌種僅使細菌繁殖為菌種傳代或觀察其某些生傳代或觀察其某些生化特性之用?；匦灾谩?(1)(1)接種滅菌接種滅菌 (2) (2)開啟開啟棉塞棉塞 (3) (3)管口滅菌管口滅菌 (4) (4)挑起菌苔挑起菌苔 (5) (5)接種接種 (6) (6)塞好棉塞。塞好棉塞。7 7，液液體體培培養(yǎng)養(yǎng)基基接接種種法法三、微量稀釋法體外抗菌實驗三、微量稀釋法體外抗菌實驗v連續(xù)稀釋法試管稀釋法通常用于測定微生物連續(xù)稀釋法試管稀釋法通常用于測定微生物的最小抑菌濃度

14、的最小抑菌濃度MICMIC，即將微生物的濃度按，即將微生物的濃度按幾何級數(shù)或數(shù)學級數(shù)進行遞減稀釋，然后將不同幾何級數(shù)或數(shù)學級數(shù)進行遞減稀釋，然后將不同濃度的微生物混入含試驗菌的液體培養(yǎng)基或固體濃度的微生物混入含試驗菌的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗菌生長的最低培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗菌生長的最低濃度，即為該微生物的最小抑菌濃度。濃度，即為該微生物的最小抑菌濃度。v微量稀釋法微量稀釋法 此種方法常用于測定細菌對藥物敏此種方法常用于測定細菌對藥物敏感性或新藥對細菌的抗菌活性試驗。一般應(yīng)用感性或新藥對細菌的抗菌活性試驗。一般應(yīng)用9696孔微量稀釋板，孔底呈孔微量稀釋板，孔底呈U

15、 U型，每孔容量為。本法型，每孔容量為。本法操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大批量藥敏試驗。操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大批量藥敏試驗。( (一實驗過程一實驗過程1 1實驗菌的準備。實驗菌的準備。選取大腸桿菌選取大腸桿菌(Escherichia (Escherichia c o l i )c o l i ) 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌、 金 黃 色 葡 萄 球 菌(Staphylicoccus aureus)(Staphylicoccus aureus)、白色葡萄球菌白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)(Staphylococcus albus)、蠟、蠟狀芽孢桿菌菌種在營養(yǎng)

16、瓊脂斜狀芽孢桿菌菌種在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次后，面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次后，再將其接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基再將其接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中中3737培養(yǎng)培養(yǎng)6-12 h6-12 h，冰箱備用，冰箱備用。2 2抗菌化合物的初步篩抗菌化合物的初步篩選，按下表取選，按下表取9696孔培養(yǎng)板一孔培養(yǎng)板一塊，進行編號，將塊，進行編號，將4444種化合種化合物由有機化學研究所其他物由有機化學研究所其他教師和研究生提供用教師和研究生提供用DMSODMSO或蒸餾水配制成或蒸餾水配制成5050mol/mlmol/ml，也可用無菌過濾器過濾后也可用無菌過濾器過濾后放置在滅菌的小離心管中。放置在滅菌的小離心管中。篩

17、選實驗過程篩選實驗過程3 3在超凈工作臺內(nèi)，酒精燈下，在超凈工作臺內(nèi)，酒精燈下，將液體培養(yǎng)的細菌菌種用培養(yǎng)液進將液體培養(yǎng)的細菌菌種用培養(yǎng)液進行稀釋，稀釋度為行稀釋，稀釋度為1 1：10001000或或1:5001:500。用無菌的移液器吸咀經(jīng)過滅菌。用無菌的移液器吸咀經(jīng)過滅菌處理將稀釋的液體菌種處理將稀釋的液體菌種198198l l參參加到除了加到除了A1,B1A1,B1以外的孔內(nèi)，以外的孔內(nèi)，2 2l l各各種 化 合 物 溶 液 種 化 合 物 溶 液 D M S OD M S O 配 置 ，配 置 ，A1,B1,C1,D1A1,B1,C1,D1加加200 200 l l培養(yǎng)液，震培養(yǎng)液，

18、震蕩混合后蕩混合后3737培養(yǎng)培養(yǎng)12h-18h, 12h-18h, 用酶標用酶標儀儀630nm630nm側(cè)吸光度。側(cè)吸光度。DMSODMSO的最終濃度的最終濃度保持在保持在1%1%。每個樣品設(shè)兩個平行孔。每個樣品設(shè)兩個平行孔。96孔細胞培養(yǎng)板加樣安排孔細胞培養(yǎng)板加樣安排1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212A A培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111B B培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111C C培養(yǎng)液培養(yǎng)液

19、200200 l l樣品樣品12121313141415151616171718181919202021212222D D培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品12121313141415151616171718181919202021212222E E菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品23232424252526262727282829293030313132323333F F菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品23232424252526262727282829293030313132323333G G菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l

20、DMSO)樣品樣品34343535363637373838393940404141424243434444H H菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品34343535363637373838393940404141424243434444樣品濃度樣品濃度0.02mmol/ml 0.02mmol/ml 樣品分子量樣品分子量/100.mg /100.mg 用用DMSODMSO配成配成0.5ml0.5ml即可，每次即可，每次實驗用實驗用2 2l l，9696孔板的孔體積孔板的孔體積200200l l，樣品的最終濃度為，樣品的最終濃度為200200mol/Lmol/L，大于，大于該

21、濃度那么無價值。該濃度那么無價值。試驗用樣品試驗用樣品1.1.環(huán)丙沙星環(huán)丙沙星 2.2.2 2,4,4,3-,3-三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 3.3.2,4,42,4,4- -三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 4.4.2,4,22,4,2- -三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 5.5.2,3,4,22,3,4,2- -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 6.6.2,3,4,32,3,4,3- -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 7.7.2,3,4,42,3,4,4- -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 8.8.2,4,22,4,2,4,4- -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 9.9.2,3,4,22,3,4,2,4

22、,4- -五羥基二苯甲酮五羥基二苯甲酮 10.10.丹皮酚丹皮酚 11.11.丹皮酚丹皮酚- -鎳鎳IIII配合物配合物 12.12.丹皮酚丹皮酚- -氧釩氧釩V V配合物配合物 13.13.丹皮酚丹皮酚- -銅銅IIII配合物配合物 14.14.丹皮酚丹皮酚- -鈷鈷IIII配合物配合物 15.15.丹皮酚丹皮酚- -錳錳IIII配合物配合物 16.16.丹皮酚丹皮酚- -鋅鋅IIII配合物配合物 17.17.苯甲基苯甲基-N-N-苯基亞胺苯基亞胺 18.18.3-3-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-N-苯基亞胺苯基亞胺 19.19.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯

23、基亞胺二甲氧基苯基亞胺 20.20.2-2-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-3,5-N-3,5-二苯基亞胺二苯基亞胺 21.21.3,4-3,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-N-苯基亞胺苯基亞胺 22.22.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 23. 4-23. 4-羥基羥基-3-3-甲氧基甲氧基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺24. 24. 苯甲基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 25.25.3,4-3,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺26.26.4

24、-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺27.27.3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺28.28. 2,5-2,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 29.29.2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 30.30. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺31.31.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-3-N-3-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺32.32. 3,5-3,5-二羥

25、基苯甲基二羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 33.33. 4-4-羥基羥基-3-3-甲氧基甲氧基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 34.34.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 35.35.4-4-羥基羥基-3-3-甲氧基苯甲基甲氧基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 36.36. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 37.37. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 38.38. 4-4-

26、磺酸基磺酸基-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯39.39.4-4-磺酸基磺酸基-2-2 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯40.40. 4-4-硝基硝基-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯41.41.4-4-硝基硝基-2-2 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯42.42. 4-4-硝基硝基-2-2 ,5,5 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯43.43.4-4-溴溴-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 44.44.對羥基苯甲酸甲酯對羥基苯甲酸甲酯 篩選數(shù)據(jù)分析篩選數(shù)據(jù)分析 測試的樣品中，測試的樣品中，1 1號樣為市號樣為市場上臨床使用的環(huán)丙沙

27、星，場上臨床使用的環(huán)丙沙星，濃度為濃度為0.005mmol/L0.005mmol/L。其他樣。其他樣品濃度為品濃度為0.02mmol/L0.02mmol/L。 實驗中，以培養(yǎng)基為空白實驗中，以培養(yǎng)基為空白0%0%，以帶菌培養(yǎng)液為對照，以帶菌培養(yǎng)液為對照100%100%。如果酶標儀如果酶標儀630nm630nm測試的結(jié)果中，空白為測試的結(jié)果中，空白為- -0.20.2，空內(nèi)液體呈透明清澈，對照孔的值，空內(nèi)液體呈透明清澈，對照孔的值為為+0.1-0.2+0.1-0.2。如果測試樣品的值也同樣到達如果測試樣品的值也同樣到達-0.2-0.2，說明，說明樣品在樣品在200200mol/Lmol/L具有較

28、好的抗菌活性。具有較好的抗菌活性。如果測試樣品的值在對照孔和空白之間，如果測試樣品的值在對照孔和空白之間，說明樣品在高濃度有抗菌作用，請選取說明樣品在高濃度有抗菌作用，請選取1111個抗菌效果較好的樣品做下面的最小抑菌個抗菌效果較好的樣品做下面的最小抑菌濃度實驗。濃度實驗。篩選數(shù)據(jù)分析篩選數(shù)據(jù)分析 測試的樣品中，測試的樣品中，1 1號樣為市號樣為市場上臨床使用的環(huán)丙沙星，場上臨床使用的環(huán)丙沙星，濃度為濃度為0.005mmol/L0.005mmol/L。其他。其他樣品濃度為樣品濃度為0.02mmol/L0.02mmol/L。 實驗中，以培養(yǎng)基為空白實驗中，以培養(yǎng)基為空白0%0%，以帶菌培養(yǎng)液為對

29、照，以帶菌培養(yǎng)液為對照100%100%。如果酶標儀如果酶標儀630nm630nm測試的結(jié)果中，空白為測試的結(jié)果中，空白為- -0.20.2，空內(nèi)液體呈透明清澈，對照孔的值，空內(nèi)液體呈透明清澈，對照孔的值為為+0.1-0.2+0.1-0.2。如果測試樣品的值也同樣到達如果測試樣品的值也同樣到達-0.2-0.2，說明樣品在說明樣品在200200mol/Lmol/L具有較好的具有較好的抗菌活性。抗菌活性。如果測試樣品的值在對照孔和空白如果測試樣品的值在對照孔和空白之間，說明樣品在高濃度有抗菌作之間，說明樣品在高濃度有抗菌作用，請選取用，請選取1111個抗菌效果較好的樣個抗菌效果較好的樣品做下面的最小

30、抑菌濃度實驗。品做下面的最小抑菌濃度實驗。4 4最小抑菌濃度或最小抑菌濃度或EC50EC50的測試的測試 v操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用MHMH培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，根據(jù)上面篩選試驗選取出來的樣品，在微孔板孔根據(jù)上面篩選試驗選取出來的樣品，在微孔板孔內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋，內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋，然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對照，然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對照，另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對照，試驗完畢另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對照，試驗完畢后，用微量攪拌器震蕩混勻后，置后，用微量攪拌器震蕩混勻后，置

31、3737溫孵溫孵12-12-18h18h，用酶標儀，用酶標儀630nm630nm側(cè)吸光度。側(cè)吸光度。樣品稀釋后的濃度表樣品稀釋后的濃度表A 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，200 M234567891011B 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，100 MC 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，50 MD 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，25 ME 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1，12.5 MF 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1，6.25 MG 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1，3.13 MH 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1，1.56 M二數(shù)據(jù)處理與

32、分析二數(shù)據(jù)處理與分析抗菌藥物的最小抗菌濃度測試結(jié)果抗菌藥物的最小抗菌濃度測試結(jié)果可能出現(xiàn)兩種形式：可能出現(xiàn)兩種形式：1 1，在某一個稀釋的樣品濃度，結(jié)果，在某一個稀釋的樣品濃度，結(jié)果表現(xiàn)出細菌沒有生長，菌液較清表現(xiàn)出細菌沒有生長，菌液較清可與空白培養(yǎng)基比，而下一個稀可與空白培養(yǎng)基比，而下一個稀釋的樣品濃度，菌液中細菌生長比釋的樣品濃度，菌液中細菌生長比較旺盛可與含菌對照比，那么較旺盛可與含菌對照比，那么，這個稀釋的樣品濃度就為該樣品，這個稀釋的樣品濃度就為該樣品抗菌的最小濃度。這種化合物的抗抗菌的最小濃度。這種化合物的抗菌作用可以稱為殺菌作用。菌作用可以稱為殺菌作用。如右表中紅色值中的樣品濃度

33、如右表中紅色值中的樣品濃度就是最小抗菌濃度。就是最小抗菌濃度。培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2013-0.2013樣品樣品1 1值值-0.2094-0.2094樣品樣品2 2值值-0.2066-0.2066培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2027-0.2027樣品樣品1 1值值-0.2102-0.2102樣品樣品2 2值值-0.2103-0.2103培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2005-0.2005樣品樣品1 1值值-0.2068-0.2068樣品樣品2 2值值-0.2112-0.2112培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2106-0.2106樣品樣品1 1值值-0.2054-0.2054樣品樣品2 2值值-0.2022-0.2

34、022菌對照值菌對照值 0.21820.2182樣品樣品1 1值值-0.2028-0.2028樣品樣品2 2值值 0.20870.2087菌對照值菌對照值 0.20680.2068樣品樣品1 1值值-0.2008-0.2008樣品樣品2 2值值 0.21120.2112菌對照值菌對照值 0.21460.2146樣品樣品1 1值值 0.20230.2023樣品樣品2 2值值 0.20880.2088菌對照值菌對照值 0.20330.2033樣品樣品1 1值值 0.20360.2036樣品樣品2 2值值 0.20330.20332 2，實驗中，不同稀釋的樣品，實驗中，不同稀釋的樣品濃度的測試結(jié)果沒

35、有上面的現(xiàn)濃度的測試結(jié)果沒有上面的現(xiàn)象，而是出現(xiàn)規(guī)律性的上升。象，而是出現(xiàn)規(guī)律性的上升。即，這種樣品測出的數(shù)據(jù)是隨即，這種樣品測出的數(shù)據(jù)是隨著樣品濃度的下降而上升，可著樣品濃度的下降而上升，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)畫出一條細菌的以根據(jù)其數(shù)據(jù)畫出一條細菌的生長曲線，如果對照樣的值定生長曲線，如果對照樣的值定為為100%100%，可以從曲線上求出抑，可以從曲線上求出抑制制50%50%時樣品的濃度，所以，時樣品的濃度，所以，我們稱這種我們稱這種 抗菌為抑菌作用抗菌為抑菌作用，說明該化合物不能殺死細菌，說明該化合物不能殺死細菌，但可以抑制其生長。，但可以抑制其生長。培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2013-0.2013樣

36、品樣品1 1值值-0.2194-0.2194樣品樣品2 2值值-0.2166-0.2166培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2027-0.2027樣品樣品1 1值值-0.2082-0.2082樣品樣品2 2值值-0.1893-0.1893培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2005-0.2005樣品樣品1 1值值-0.1694-0.1694樣品樣品2 2值值-0.1002-0.1002培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2106-0.2106樣品樣品1 1值值-0.1268-0.1268樣品樣品2 2值值 0.00220.0022菌對照值菌對照值 0.21820.2182樣品樣品1 1值值-0.0428-0.0428樣品樣品2 2值

37、值 0.05870.0587菌對照值菌對照值 0.20680.2068樣品樣品1 1值值-0.0023-0.0023樣品樣品2 2值值 0.16120.1612菌對照值菌對照值 0.21460.2146樣品樣品1 1值值 0.68040.6804樣品樣品2 2值值 0.20880.2088菌對照值菌對照值 0.20330.2033樣品樣品1 1值值 0.13890.1389樣品樣品2 2值值 0.21330.2133四、瓊脂擴散法四、瓊脂擴散法v 此種方法包括紙片法，杯碟法挖洞法等，它們的共同點均在此種方法包括紙片法，杯碟法挖洞法等，它們的共同點均在平皿瓊脂內(nèi)參加適量測試細菌，按上述方法放置適

38、量藥液在菌平皿瓊脂內(nèi)參加適量測試細菌，按上述方法放置適量藥液在菌層上，藥物在瓊脂四周擴散，經(jīng)孵育后，細菌生長受抑制，出層上，藥物在瓊脂四周擴散，經(jīng)孵育后，細菌生長受抑制，出現(xiàn)抑菌圈，測定抑菌圈直徑，能了解細菌對藥物的敏感程度?，F(xiàn)抑菌圈，測定抑菌圈直徑，能了解細菌對藥物的敏感程度。 v 瓊脂擴散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一般是將化瓊脂擴散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一般是將化合物稀釋后，加如含試驗菌的混菌平板中，由于化合物在瓊脂培合物稀釋后，加如含試驗菌的混菌平板中，由于化合物在瓊脂培養(yǎng)基中的擴散作用，使化合物周圍的試驗菌不能生長，從而產(chǎn)生養(yǎng)基中的擴散作用，使化合物周圍的試驗菌不能生長，從而產(chǎn)生抑菌圈或抑菌帶。根據(jù)抑菌圈或抑菌帶的大小來評價化合物抗菌抑菌圈或