Midkine特異的shRNA對(duì)胃腫瘤細(xì)胞BGC823增殖及凋亡的影響(精)

1、Midkine特異的shRNA對(duì)胃腫瘤細(xì)胞BGC823增殖及凋亡的影響作者：王慶苓，黃亞紅，柳 紅，侯亞義【摘要】目的研究 shRNA 干擾 midkine 對(duì)胃腫瘤細(xì)胞 BGC823 曾殖能力及凋亡的影響。方法 構(gòu)建 midkine 基因的特異性小 RNA 干擾質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體 2000 轉(zhuǎn)染 BGC82 細(xì)胞，運(yùn)用 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，PI 染色檢測(cè)細(xì)胞凋 亡情況。結(jié)果成功轉(zhuǎn)染重組體的 BGC82SB 胞增殖明顯受到抑制（P0.01）細(xì)胞 形成克隆數(shù)明顯降低（P0.01），并且有明顯的亞二倍體峰出現(xiàn)（P0.05）。結(jié)論 針對(duì) midkine 基因的特異性小 RNA 干擾質(zhì)粒在體

2、外能有效抑制人胃癌細(xì)胞 BGC823 midkine 表達(dá)，細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡增加，為midkine 基因靶向治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】midkine;shRNA;胃腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡Abstract: Objective To in vestigate the effect of kno ckdow n of midk ine (MK)expressi on by shRNA on cell proliferati on and apoptosis of human gastric carci nomacell BGC823. Methods Specific sh

3、RNA plasmids to midki ne were con structed, andwere the n tran sfected in to BGC823 by lipofectamin 2000. The cell proliferati on wasevaluated by CCK-8 kit, and the apoptosis was determ ined by flow cytometric an alysis.Results The recomb inant plasmid express ing midk ine shRNA effectively inhibite

4、dBGC823 cell proliferation (P0.01) and decreased clone formati on (P0.01) and significa ntly promoted cell apoptosis with the emerge nee of sub-diploid peak (P0.05).Con clusi on shRNA plasmids targeti ng MK gene can in hibit the growth of huma ngastric cancer cells by attenuating cell proliferation

5、and inducing apoptosis, which mightprovide experime ntal evide nee for gene targeti ng therapy of MK.Key words: midkine; shRNA; gastric cancer cell; cell proliferation; apoptosisMidkine(MK)是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，MK 在多種正常組織中也有表達(dá)， 在小腸黏膜組織高表達(dá)，在肺、結(jié)腸、胃、腎和脾低表達(dá)，在肝臟中沒(méi)有表 達(dá)，MK 在多種腫瘤組織中的表達(dá)比相應(yīng)的癌旁和正常組織高1。在我們前期研究工作2中發(fā)現(xiàn) MK 在

6、中國(guó)胃腫瘤患者的腫瘤組織中高表達(dá)，并與臨床分級(jí) 相關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞系中，MK 具有促纖溶、促血管形成和抗凋亡作用，能誘 導(dǎo) NIH/3T3 細(xì)胞、SW-13 細(xì)胞和 UNUC3 細(xì)胞轉(zhuǎn)化1, 3。胃癌患者的尿液和血 清中的 MK 水平都有所增加4-5，腫瘤切除后血清 MK 水平就會(huì)下降6。這些 資料表明 MK 與胃腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可作為診斷指標(biāo)和治療靶標(biāo)。本研究旨 在以 MK 為靶標(biāo)進(jìn)行干擾，觀察 MK 干擾后胃腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡情況。1 材料和方法10-10-29 16:13:00編輯：studa1.1材料1.1.1 腫瘤細(xì)胞 BGC823 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所。1.1.2 pS

7、ilencer 2.1 U6和 pSilencer 3.1H1 載體 pSilencer 2.1 U6 和pSilencer 3.1H1 載體購(gòu)自 Ambion 公司，pSilencer 2.1 U6的載體含有 U6RNA 聚合酶川啟動(dòng)子;pSilencer 3.1H1 載體含有 H1 RNA 聚合酶川啟動(dòng)子。兩者 都同時(shí)含有氨芐青霉素和 G418 抗性基因，前者可用于在原核細(xì)胞的篩選，后者 則可用于在真核細(xì)胞的篩選。 2 個(gè)載體在購(gòu)買(mǎi)時(shí)呈開(kāi)環(huán)的線狀，兩端分別留有 BamHI 和 Hi nd 川的酶切位點(diǎn)。1.1.3 主要試劑 PI 為南京凱基生物公司產(chǎn)品 ;Llipofectamin 200

8、0 轉(zhuǎn)染試 劑和Opti-MEM 購(gòu)自 Invitrogen 公司；各種限制性內(nèi)切酶、總 RNA 提取試劑盒、 質(zhì)粒抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、核酸電泳試劑均為T(mén)aKaRa 公司產(chǎn)品;PCR 擴(kuò)增試劑為天為時(shí)代公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1 發(fā)夾狀雙鏈 MK-siRNA 基因序列的合成 根據(jù)前面研究中 MK-siRNA 序 列 7設(shè)計(jì)發(fā)夾雙鏈 RNA 基因序列，正義鏈：5 GATCCGTGAAGAAGGCGCGCTCTCAATCAAGAGATGAGCATTGTAGCGCGCCTTCTTCATTTTTTGG 反義鏈：5 AGCTTTTCCAAAAAATGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTC

9、ATCTCTTGAATGAGCATTGTAGCGCGCCTTCTTCACG3。序列由 Ivitrogen 公司合成。合成的 MK 發(fā)夾狀雙鏈 RNA 基因序 列的兩端分別引入 BamHI 和 Hind 川兩個(gè)酶切位點(diǎn)。然后，按照下列方法把合成 的 2 條單鏈DNA 配對(duì)形成雙鏈：以 50 卩 l 去離子分別溶解合成的 2 條單鏈 DNA; 分別取 5 卩 l 溶解的單鏈 DNA 然后加入 40 卩 l 1xDNA 退火溶液 （100 mmol/L 醋酸鉀、 30 mmol/L pH 7.4Hepes、2 mmol/L 醋酸鎂）混合;90 C 3 min，冷卻 至 37C并保溫 1 h，逐步冷卻

10、至室溫，這樣 2 條單鏈 DNA 就配對(duì)形成了雙鏈， 并且其兩端設(shè)計(jì)合成的 BamHI 和 Hind 川黏性末端也暴露出來(lái)了。 -20C保存?zhèn)?用。1.2.2 pSilencer 2.1-U6-mksiRNA和 pSilencer 3.1-H1-mksiRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建 購(gòu)買(mǎi)的 pSilencer 2.1-U6 和 pSilencer 3.1-H1是已經(jīng)含有 BamHI 和Hind 川酶切位點(diǎn)的線形載體，故可以用以下方法連接上述已經(jīng)配對(duì)形成雙鏈的 MK 發(fā)夾狀 RNA 勺基因：1 卩 l MK 發(fā)夾狀 RNA 的基因,6 卩 l ddH2O,1 卩 l10XT4 DNA 連接緩沖液,1 卩

11、I pSilencer 2.1-U6 或 pSilencer 3.1-H1 載體,1 卩 I T4DNA 連接酶(5 U/卩 I)，把上述液體混合均勻， 16C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受 態(tài) E.coli DH5a,隨機(jī)挑取菌落于含 100 mg/L 氨芐青霉素的液體 LB 培養(yǎng)基中 擴(kuò)增細(xì)菌，進(jìn)行測(cè)序，序列正確的即為 pSilencer 2.1-U6-mksiRNA 和pSile ncer 3.1-H1-mksiRNA 質(zhì)粒。對(duì)照質(zhì)粒插入的片段為針對(duì) GFP 的序列，稱(chēng) 為pSilencer 2.1-U6和 pSilencer 3.1-H1 。1.2.3構(gòu)建質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性克隆的篩選 腫瘤細(xì)胞在 24

12、孔板上用 PRMI- 1640培養(yǎng)基，含 10%勺小牛血清和青霉素、鏈霉素在 37C5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)至90%-95%勺細(xì)胞覆蓋率。然后，吸去培養(yǎng)液，用不含青霉素、鏈霉素 和小牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)基洗 1 次。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染按 Lipofectamin 2000 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染操作說(shuō)明進(jìn)行操作，質(zhì)粒用量為 0.8 卩 g,轉(zhuǎn)染后 37E5% CO2 下培養(yǎng) 72 h。1.2.4總 RNA 提取、Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)RNA 提取按照 TRIzol 試劑盒操作指南進(jìn)行，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳

13、 檢測(cè)提取的總 RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄依照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，總反應(yīng)體系為 25 卩 l，反轉(zhuǎn)錄條件為 42C反應(yīng) 60 min， PCR 引物：MK (385 bp，28 個(gè)循環(huán))，上游的弓 I 物： 5 AAAAAAGCTTATGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGA 游 G 3引物：5 AAAAGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCQGTc3iri (280 bp，28 個(gè)循環(huán))，上游弓 I 物：5 CCACGAAACTACCTTCAACTC 下游弓 I 物：5 TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATQDNA 產(chǎn)物直接取 2 卩 l 力卩入 PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行 PC

14、RT增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4r變性 30 s，55C退火 30 s，72C延 伸 30 s，28 個(gè)循環(huán)后，72T維持 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，取 5 卩 l 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn) 行 1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。1.2.5細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)參照 CCK8-kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，詳細(xì)方法如下：將轉(zhuǎn)染 pSilencer 2.1-U6-mksiRNA 和 pSilencer 3.1-H1- mksiRNA空載體和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液按 100 卩 l/孔加入 96 孔培養(yǎng)板中，每組 孔做 6 個(gè)復(fù)孔。 37E5% CO2 飽和濕度下培養(yǎng)。在 1、2、3、4、5 天，每孔中 加入 1

15、0 卩 l WST-8 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- (2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt，置 37r5% CO2飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng) 4 h ，于酶標(biāo)儀 (HynergyTM HT,BIO-TEK, USA)450 nm 處比 色，獲得光密度(D)值。1.2.6平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將不同處理并對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到 6 孔板， 每種細(xì)胞接種 3 孔， 1 000 個(gè)/孔，以十字方向輕輕晃動(dòng) 6 孔板，使細(xì)胞分散 均勻。在 37C、5% CO2 的培養(yǎng)箱中，靜止培養(yǎng) 71

16、0 天至 6 孔板出現(xiàn)肉眼可 見(jiàn)的克隆7。PBS 小心洗滌細(xì)胞 2 次，甲醇固定 30 s，0.1%結(jié)晶紫液染色 15 min,流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。凝膠成像系統(tǒng)拍照計(jì)數(shù)克隆數(shù)。1.2.7 PI 檢測(cè)亞二倍體峰 不同處理的細(xì)胞，胰酶消化 PBS 洗, 2 000rpm(約 375 g)，離心 5 min，獲得細(xì)胞(107/ml);取 100 卩 l 細(xì)胞懸液，加入 1 ml 70%乙醇(用過(guò)濾除菌的雙蒸水配制)固定 2 h;用 PBS 洗細(xì)胞 2 次，4C,2500 r/min , 5 minX2次;100 卩 l PBS(2% TritonX-100,2%RNaseA)重懸細(xì)胞；加入

17、100 卩 I PI 染液，4C避光顯色 30 min;4C,力卩 300 卩 I PBS;流式細(xì)胞儀（flow cytometer, FCM） 檢測(cè) 8 。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用土s表示，利用 one-way ANOVA 進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析，PvO.05 認(rèn)為差異有顯著性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3 次。2 結(jié)果2.1 MK 干擾后 mRN 表達(dá)水平的檢測(cè) 將構(gòu)建的 pSilencer 2.1-U6-mksiRNA 和pSilencer 3.1-H1-mksiRNA 質(zhì)粒利用 Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染到 BGC823 細(xì) 胞，通過(guò)RT-PCF檢測(cè)雙鏈發(fā)夾RNA對(duì)MK的抑制

18、作用。 pSilencer 2.1-U6- mksiRNA和 pSilencer3.1-H1-mksiRNA 轉(zhuǎn)染 72 h，在 BGC823 細(xì)胞中 MK 的 mRN 表達(dá)水平都明顯降低，而B(niǎo)-actin 的表達(dá)沒(méi)有受到影響。空載體對(duì) MK 和B-actin 的表達(dá)均沒(méi)有影響（圖 1）。2 種質(zhì)粒的干擾效果相比沒(méi)有明顯差別。圖 1 MK 干擾后通過(guò) RT-PCR MK mRN 表達(dá)水平檢測(cè)M DL2000;1： pSilencer3.1-H1-mksiRNA 處理組;2 : pSilencer2.1-U6- mksiRNA處理組;3 : pSilencer3.1-H1 處理組;4 : pSilencer2.1-U6 處理組;5: 未轉(zhuǎn)染細(xì)胞2.2 雙鏈發(fā)夾 MK RNA 寸細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 為檢測(cè)低表達(dá)的 MK 對(duì) BGC823B胞生長(zhǎng)狀況的影響，細(xì)胞存活能力用CCK8-kit 檢測(cè)。在第 1、2、3、4、 5 天,與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了siRNApSilencer 2.1-U6-mksiRNA 和 pSilencer 3.1-H1-mksiRNA 質(zhì)粒的 BGC82 細(xì)胞增殖