原創(chuàng)Westernblot轉(zhuǎn)膜整個過程

1、轉(zhuǎn)膜(Trarsmembra n)i 轉(zhuǎn)膜的定義將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體(例如 NC 膜)上，通常有兩種 方法：毛細(xì)管印跡法和 電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有 濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者 的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。前者操 作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。2 轉(zhuǎn)移膜的選擇雜交膜的選擇是決定 Westernblot 成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋 白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于 Westernblot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC)和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白 印跡

2、實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的 蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。 根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同 孔徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。 通常用 0.45m和 0.2 pm 兩種規(guī)格的 NC 膜。大于 20kD 的蛋白可用 0.45 pm 的膜, 小于20kD 的蛋白就要用 0.2pm 的膜了，如用 0.45pm 的膜就會發(fā)生Blowthrough ”的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但

3、 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。最常用于 WesternBlot 的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素(Nitrocellulose,NC )膜和聚 偏二氟乙烯(PolyvinylideneFluoride,PVDF )膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維 素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點相似,主要用于核酸雜交。硝酸纖維素(nitrocellulose,NC )膜：NC 與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活 化，對蛋白質(zhì)的活性影響??；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結(jié) 合在 NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時易丟失；NC 韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(Polyvin

4、ylidenefluoride,PVDF)膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲 醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。膜的選擇主要根據(jù)：p 膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力(也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量)，以 及膜的孔徑(也就是攔截蛋白的大小)；p 不影響后續(xù)的顯色檢測(也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好)；p 如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目 的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。幾種膜的性質(zhì)對比PVDF 膜NC 膜尼龍膜背景低低較高蛋白結(jié)合能力100-200pg/cm280-100pg/cm2400ug/cm2機械強度強干的膜很脆軟而結(jié)實溶劑抗性

5、強差差使用前處理甲醛潤濕緩沖液潤濕緩沖液潤濕價格高較低低3 轉(zhuǎn)膜步驟（以槽式濕轉(zhuǎn)為例）1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙 6 片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。如用 PVDF 膜 需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。（先把 PVDF 膜在甲醇中浸泡約 15s，小于 1min， 然后把膜放在 1X 轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，然后上面鋪 2 層濾紙浸泡）3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕 去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，

6、放入三明治（夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅 面），（因為電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊 放一塊冰來降溫），加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h （電流 350mA，1h30min ）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。4 轉(zhuǎn)膜注意事項1. 泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer 浸泡 20min ；a. 凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜 buffer 中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo) 致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。2. 轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

7、；3. 轉(zhuǎn)膜條件：0.35A/250V/1h/40min/冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱， 注意冷卻）；（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定； 目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短。）4. 其它注意事項：a. 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并 會使膜臟掉。b. 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜 不完全。c. 保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。d. 雞來源的抗體與 PVDF 和尼龍膜有較強的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故 如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜（NC 膜）。5 轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略）轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的TBST （或 PBST）中漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)， 通常分子量最大的 1-2 條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色 液或硬度墨汁染色液對膜進(jìn)行染色， 以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮 藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的 SDS-PAGE 膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 a.麗春紅染色：蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾 次。b.印度墨汁染色：只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A 蛋白探針的