基因打靶技術(shù)

1、 基因打靶（gene targeting）是指外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合在預(yù)定位點(diǎn)，改變細(xì)胞遺傳特性的方法 建立在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）與同源重組技術(shù)基礎(chǔ)之上的基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段1.重組基因載體的構(gòu)建重組基因載體的構(gòu)建2. 導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞3. 篩選篩選4. 檢測(cè)檢測(cè)1.打靶載體的構(gòu)建打靶載體的構(gòu)建u 基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標(biāo)記基因等。u 基因打靶載體：u 基因插入型載體(Gene-insertion vector)：插入型載體中與靶基因同

2、源的區(qū)段中含有特異的酶切位點(diǎn)，線性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾了目標(biāo)基因的功能。u 基因置換型載體(Genereplacement vector)：置換型載體進(jìn)行線性化的酶切位點(diǎn)在引導(dǎo)序列和篩選基因外側(cè)，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進(jìn)行基因大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進(jìn)行基因打靶。打靶。2、外源、外源DNA導(dǎo)入的方式導(dǎo)入的方式外源DNA導(dǎo)人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等 顯微注射每次只能注射一個(gè)細(xì)胞； 電穿孔法可同時(shí)使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1的ES細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；

3、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細(xì)胞有特異的親合力，可用于時(shí)空特異性基因打靶，在人類(lèi)疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿?。?）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection, PNS)解決了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合的鑒別問(wèn)題。l同源重組時(shí)，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。l隨機(jī)整合時(shí)，是在載體的兩端將整個(gè)載體連入染色體內(nèi)。正選擇基因多為neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表達(dá)。負(fù)選擇基因常用HSV-tk基因，在靶基因同源區(qū)之外在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3末端，u在同源重組時(shí)，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，u在隨機(jī)整合時(shí)，

4、所有的序列均保留（包括tk）。（1）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection, PNS) 無(wú)毒的丙氧鳥(niǎo)苷（GANC） 毒性核苷酸 殺死細(xì)胞。同源重組同源重組時(shí)，G418和GANC都有抗性，隨機(jī)整合隨機(jī)整合時(shí)對(duì)G418有抗性，但對(duì)GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無(wú)整合無(wú)整合的將被G418殺死。 用G418作正篩選作正篩選，選出含有neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥(niǎo)苷作負(fù)篩選丙氧鳥(niǎo)苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株。胸苷激酶蛋白（胸苷激酶蛋白（TK）2022-4-12蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新（2）正相選擇法（positive selec

5、tion method）主要程序：將標(biāo)記基因neor的啟動(dòng)子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點(diǎn)同源的序列內(nèi)，將打靶載體轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞， 可能出現(xiàn)下面幾種情況：打靶載體不整合入靶細(xì)胞基因組，將隨傳代而丟失；外源打靶序列隨機(jī)整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動(dòng)子和起始密碼，整合位點(diǎn)周?chē)酂o(wú)啟動(dòng)子，使neor基因的表達(dá)受阻；雖是隨機(jī)整合，但其整合位點(diǎn)側(cè)翼序列在其它基因的啟動(dòng)子能啟動(dòng)neor基因的表達(dá)；外源打靶載體與靶位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的啟動(dòng)子和起始密碼的作用而呈現(xiàn)表達(dá)活性。 因此，如用G418篩選，則抗性細(xì)胞中將只包含后兩種可能情況，根據(jù)這兩種情況下基

6、因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測(cè)出同源重組的克隆。 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 大規(guī)模隨機(jī)基因剔除基因捕獲(gene trapping) 精細(xì)突變的引入 條件性基因打靶打了就走策略 (Hit and Run 法)“標(biāo)記和置換”法 (Tag and Exchange)借助于陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因通常被插入靶基因功能最借助于陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因通常被插入靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過(guò)同源重組刪除靶基因最重關(guān)鍵的外顯子中，或通過(guò)同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實(shí)行靶基因的完全剔除。陽(yáng)性選擇標(biāo)要的功能域，實(shí)行靶基因的完全剔除。陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因常

7、采用記基因常采用-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZlacZ），將其以），將其以正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基因外，通過(guò)分析因外，通過(guò)分析-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表達(dá)的時(shí)空順序。因表達(dá)的時(shí)空順序。 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫(kù)，neo基因插入到ES細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來(lái)。 中靶基因的信息可以通過(guò)篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來(lái)獲得。 在單次實(shí)驗(yàn)中可以獲得數(shù)以百計(jì)的帶有單基因剔除的ES克隆。但此方法的缺點(diǎn)是只能剔除在ES細(xì)胞中表達(dá)的基因。這一方法包括兩次同源重組：第一步（Hit）用插入型載體進(jìn)行同源重組，這樣會(huì)在靶位點(diǎn)插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個(gè)篩選標(biāo)記（如正篩選標(biāo)記基因neo和負(fù)篩選標(biāo)記基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性篩選，富集為數(shù)不多的發(fā)生了染色體內(nèi)重組的克隆。染色體內(nèi)重組去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列，由于負(fù)篩選標(biāo)記基因的消失，細(xì)胞就恢復(fù)了對(duì)負(fù)篩選藥物的抗性，因此，回復(fù)突變體可以在負(fù)選擇培養(yǎng)基中存活下來(lái)?；虼虬屑夹g(shù)的優(yōu)點(diǎn)基因打靶技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有待改進(jìn)之處有