外源基因的表達及其優(yōu)化策略研究

1、 DNA之旅的視頻動畫第七章第七章 外源基因的表達及其優(yōu)化策略外源基因的表達及其優(yōu)化策略第七章第七章 外源基因的表達及其優(yōu)化策略外源基因的表達及其優(yōu)化策略第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素 第二節(jié)外源基因在原核細胞中的表達第二節(jié)外源基因在原核細胞中的表達 第三節(jié)外源基因在真核細胞中的表達第三節(jié)外源基因在真核細胞中的表達第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素基因表達：基因表達： 從從DNA分子有序地將其所承載的遺傳信息分子有序地將其所承載的遺傳信息,通過密碼子通過密碼子和反密碼子系統(tǒng)和反密碼子系統(tǒng),轉變由特定氨基酸順序構成的多肽或蛋白轉變由特定氨基酸順序構

2、成的多肽或蛋白質分子過程，從而決定生物有機體遺傳表型。質分子過程，從而決定生物有機體遺傳表型。 影響外源基因在受體細胞中表達的因素主要有哪些？影響外源基因在受體細胞中表達的因素主要有哪些？ 第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素閱讀框架閱讀框架 順式作用元件順式作用元件翻譯過程翻譯過程 表達體系表達體系第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素一一 、閱讀框架對轉基因表達、閱讀框架對轉基因表達的影響的影響閱讀框架的概念：是基因的編碼區(qū)，包含從起始密碼子至翻譯終止密碼子之間的cDNA序列。 第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素二二 順式作用元件

3、對基因表達的影響順式作用元件對基因表達的影響 順式作用元件的概念：是在轉錄水平上對基因表達有調順式作用元件的概念：是在轉錄水平上對基因表達有調節(jié)活性的節(jié)活性的DNA序列，包括啟動子、增強子、沉默子和衰減序列，包括啟動子、增強子、沉默子和衰減子等，多位于基因旁側或內含子中，一般只調節(jié)與其處于子等，多位于基因旁側或內含子中，一般只調節(jié)與其處于同一個同一個DNA分子上的基因。分子上的基因。 順式作用元件是如何調控基因轉錄階段的？順式作用元件是如何調控基因轉錄階段的？第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素（一）順式作用元件對基因轉錄起始的調控基因轉錄起始的調控基因轉錄起始的調控概念概

4、念特點特點啟動子啟動子增強子增強子沉默子沉默子是RNA 聚合酶識別、結合并起始轉錄的一段DNA序列，其長度隨生物種類不同而異序列特異性；方向性；位置特異性；種屬特異性是遠距離調節(jié)啟動子并提高轉錄效率的一段DNA序列，由多個元件組成，每個元件可與一種或多種轉錄調控因子結合遠距離調節(jié)啟動子以降低轉錄效率的一段DNA序列，是調節(jié)基因表達的順式作用負調控元件雙向作用；提高轉錄效率；無位置效應；遠距離作用；組織特異性；無基因特異性雙向作用；無位置效應；遠距離調控（二）順式作用元件對基因轉錄終止的調控基因轉錄終止的調控基因轉錄終止的調控概念概念特點特點終止子終止子衰減子衰減子是為轉錄提供終止信號的一段DN

5、A序列，是基因表達的順勢作用負調控原件作用是：使mRNA得長度限制到最小并提高其穩(wěn)定性；特點是與位置有關，距離外源基因保持合適距離才能獲得較好的表達。原核生物基因表達調控的精細調節(jié)裝置，是基因表達的順勢作用負調控原件利用了原核生物轉錄與翻譯相偶聯(lián)的特性，依賴自身的特征序列和相應的RNA二級結構，對基因轉錄進行開關式的微調作用第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素（三）順式作用元件對DNA結構的影響1、核基質結合區(qū)：是存在于真核細胞染色質中的一段與核基質特意結合的DNA序列2、絕緣子：在真核生物基因組中，絕緣子既是基因表達的調控元件，也是一種邊界元件3、基因座控制區(qū)（LCR）：

6、也是調節(jié)基因表達的一個重要順式作用元件，其作用機制是通過改變其相鄰基因的染色質結構，導致這些基因被轉錄第一節(jié)影響外源基因表達的因素第一節(jié)影響外源基因表達的因素 三、翻譯過程對表達的影響三、翻譯過程對表達的影響 1、翻譯起始對基因表達的影響翻譯起始對基因表達的影響 翻譯起始是如何影響原核生物和真核生物的？ 2、密碼子偏愛性對基因表達的影響密碼子偏愛性對基因表達的影響 不同密碼子的翻譯起始效率對比從圖中，我們可以看到從圖中，我們可以看到所有所有64種起始密碼子的種起始密碼子的翻譯起始效率的對比，翻譯起始效率的對比，其中效果最佳的前五個其中效果最佳的前五個密碼子是：密碼子是：AUGGUGUUGCUG

7、AUA。效果最差的五種密碼子效果最差的五種密碼子是：是：CCUUCCCAGUCUCUU3 、翻譯翻譯終止對基因表達的影響終止對基因表達的影響翻譯終止是如何影響原核生物和真核生物的？翻譯終止是如何影響原核生物和真核生物的？原核生物中多肽鏈的釋放由釋放因子原核生物中多肽鏈的釋放由釋放因子RF1和和RF2所控所控制，制，RF1識別終止密碼子識別終止密碼子UAA、UAG,RF2識別終止密碼子識別終止密碼子UAA、UGA。而真核生物中，三個終止密碼子均有一個。而真核生物中，三個終止密碼子均有一個釋放因子釋放因子eRF所識別。所識別。 第二節(jié)第二節(jié) 外源基因在原核細胞中的表達外源基因在原核細胞中的表達原核

8、生物基因表達與調控的特點原核生物基因表達與調控的特點原核生物基因表達載體的組成特征原核生物基因表達載體的組成特征原核生物基因表達一般以操縱子為單位啟動子特征：作用要強；必須表現(xiàn)最低水平的基礎轉錄活性；啟動子具有簡便和廉價的可誘導性原核生物只有一種RNA聚合酶，識別原核生物的啟動子，催化所有RNA的合成特征：SD序列與起始密碼子的間距對翻譯起始效率影響較大；mRNA-rRNA的互補區(qū)域越長，基因翻譯的概率越大；SD序列與起始密碼子之間的堿基組成也影響翻譯的起始效率；SD序列所在的翻譯起始區(qū)應避免出現(xiàn)二級結構，否則降低翻譯的起始效率。原核生物無核膜，轉錄和翻譯過程是偶聯(lián)的終止子 是表達載體必不可少

9、的元件，即可避免高水平轉錄對高拷貝質粒穩(wěn)定性的影響，又可使得轉錄出的mRNA盡可能短，以提高mRNA的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質的表達水平原核生物基因一般不含內含子，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉錄后加工系統(tǒng)選擇標記基因，通過各種方法將表達載體轉移到受體菌時，只有少部分細菌能接受并穩(wěn)定保持載體原核生物基因表達的調控主要在轉錄水平，這種控制比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢復制子 是一段包含復制起始位點和反式因子作用區(qū)在內的DNA片段第二節(jié)第二節(jié) 外源基因在原核細胞中的表達外源基因在原核細胞中的表達優(yōu)點缺點大腸桿菌受體系統(tǒng)1.缺乏對真核生物蛋白質的復性功能；2. 缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng)；3. 內源

10、性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白真核與原核 生物結構上存在差別。1.缺乏對真核生物蛋白質的復性功能；2. 缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng)；3. 內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白真核與原核 生物結構上存在差別芽孢桿菌受體系統(tǒng)鏈霉菌受體系統(tǒng)藍藻受體系統(tǒng)三 原核表達的受體系統(tǒng)第二節(jié)第二節(jié) 外源基因在原核細胞中的表達外源基因在原核細胞中的表達四、四、 優(yōu)化外源基因在原核細胞中表達的策略優(yōu)化外源基因在原核細胞中表達的策略 原原核核細細胞胞中中表表達達策策略略轉 錄 水轉 錄 水平平翻 譯 水翻 譯 水平平提高目標提高目標產(chǎn)物的穩(wěn)產(chǎn)物的穩(wěn)定性定性質粒的拷質粒的拷貝數(shù)貝數(shù)宿主菌的宿主菌的選擇

11、選擇培養(yǎng)條件的培養(yǎng)條件的優(yōu)化優(yōu)化啟動子啟動子終止子終止子mRNA的的穩(wěn)定性穩(wěn)定性優(yōu) 化 起優(yōu) 化 起始 翻 譯始 翻 譯區(qū)區(qū)翻 譯 的翻 譯 的終止終止密 碼 子密 碼 子的選擇的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基環(huán)境因素對環(huán)境因素對受體菌生長受體菌生長的影響的影響誘導時間和誘導時間和誘導劑量誘導劑量第三節(jié)第三節(jié) 外源基因在真核細胞中的表達外源基因在真核細胞中的表達一一 、真核生物、真核生物基因表達與調控的特點基因表達與調控的特點二二 、真核生物、真核生物基因表達載體的組成特征基因表達載體的組成特征基因組DNA的存在形式可影響基因表達原核DNA序列 轉錄與翻譯不偶聯(lián) 啟動子調控是多層次的 增強子終止子內含子具有

12、組織和細胞類型特異性 選擇標記基因，對信號分子反應不同PloyA加尾信號一一 、真核生物基因表達與調控的特點、真核生物基因表達與調控的特點第三節(jié)第三節(jié) 外源基因在真核細胞中的表達外源基因在真核細胞中的表達 二、真核生物基因表達載體的組成特征二、真核生物基因表達載體的組成特征 第三節(jié)第三節(jié) 外源基因在真核細胞中的表達外源基因在真核細胞中的表達 根據(jù)啟動子的功能和作用方式不同，真核基因的表達載體根據(jù)啟動子的功能和作用方式不同，真核基因的表達載體的啟動子可以分為幾種類型，每一種類型的優(yōu)缺點是什么？的啟動子可以分為幾種類型，每一種類型的優(yōu)缺點是什么？三、真核表達的受體系統(tǒng)三、真核表達的受體系統(tǒng) 按照宿

13、主細胞的不同，常用外源基因的真核受體系統(tǒng)可大按照宿主細胞的不同，常用外源基因的真核受體系統(tǒng)可大致分為酵母、職務、昆蟲和哺乳動物等受體系統(tǒng)。致分為酵母、職務、昆蟲和哺乳動物等受體系統(tǒng)。 每種受體的系統(tǒng)的特征如下表：每種受體的系統(tǒng)的特征如下表：酵母受體系統(tǒng)全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便；能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)；大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、

14、成本低廉本低廉；不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內毒素，美國不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GRAS）；酵母菌是最簡單的真核模式生物酵母菌是最簡單的真核模式生物。植物受體系統(tǒng)昆蟲細胞受體系統(tǒng)哺乳動物受體系統(tǒng)第三節(jié)第三節(jié) 外源基因在真核細胞中的表達外源基因在真核細胞中的表達四四 優(yōu)化外源基因在真核細胞中表達的策略優(yōu)化外源基因在真核細胞中表達的策略真核細胞真核細胞轉錄水平翻譯水平防止外源基因額失活多基因策略選擇啟動子，利用增強子，使用內含子添加5UTR和3UTR;優(yōu)化起始密碼周邊序列；改造編碼區(qū)減少位置效應；提高基因表達多個基因一起轉入

15、受體細胞原核細胞原核細胞轉錄水平翻譯水平提高目標產(chǎn)物的穩(wěn)定性質粒的拷貝數(shù)宿主菌的選擇培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇啟動子；終止子；mRNA的穩(wěn)定性優(yōu)化翻譯起始區(qū)；翻譯的終止；密碼子的選擇利用蛋白轉運系統(tǒng)；利用基因蛋白酶缺陷基因菌株作為受體；基因共表達；改造蛋白質序列；降低培養(yǎng)溫度；目的蛋白做疏水性修飾；構建融合蛋白；多拷貝串聯(lián)；優(yōu)化培養(yǎng)條件強啟動子的利用；高表達載體的利用表達載體必須與宿主相匹配培養(yǎng)基；環(huán)境因素與受體菌生長的影響；誘導時間和誘導劑量第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化第一節(jié)第一節(jié) 重組蛋白質分離純化方法選擇的基本原則重組蛋白質分離純化方法選擇的基本原則利用轉基

16、因大腸桿菌、酵母或動植物表達外源基因所合成的目標蛋白的分離、純化包括兩大步驟：一是初步分離獲得粗提物；二是粗提物的進一步提純。具體應用時，需要根據(jù)外源基因表達目標蛋白的形式和性質，采用不同的分離、純化策略和方法。第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化一一 、純化、純化策略的制定策略的制定1、根據(jù)表達蛋白質的性質和在受體細胞中位置制定分離純化策略 種類分離純化策略分泌型表達重組蛋白先沉淀、超過濾進行濃縮在純化天然蛋白采用高容量/低溶解層析過程腹肌蛋白質重組蛋白表8-3部分融合系統(tǒng)中標簽蛋白特異性蛋白酶裂解位點切除標簽蛋白第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因

17、表達產(chǎn)物的分離純化2 、制定合理的純化步驟、制定合理的純化步驟 盡管在純化中純化步驟不是考慮的重點，但是純化順序也明顯影響純化的結果。第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 二 、層析類型的選擇應針對重組蛋白的性質選擇層析類型，幾乎所有蛋白質的理化性質均會影響層析類型的選擇。1 、離子交換層析的選擇離子交換層析選擇的影響因素？等電點；交換基團和介質的種類、pH、離子強度等吸附和洗脫條件第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 2 、親和層系的選擇一般選擇親和力適中、特異性較強、解離常數(shù)介于10-8-10-4之間的配體。3 、疏水作用層析和反

18、向層析的選擇請問疏水作用層析和反向層析區(qū)別與聯(lián)系？聯(lián)系：均是利用蛋白質疏水性的差異來分離純化蛋白質的；區(qū)別：疏水作用層析通常在水溶性中進行，蛋白在分離過程中仍保持其天然構象；反作用層析則是在有機相中進行，蛋白經(jīng)過反向流動相與固定相的作用有時會發(fā)生部分變性。第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 4、凝膠層析的選擇主要根據(jù)蛋白質的相對分子質量和體積差異進行分離，它的應用主要有兩個方面：一是用于蛋白質脫鹽和更換緩沖液；二是用于蛋白質分析的分級分離。5、徑向層析的選擇發(fā)展起來較晚的一種集層析分離和膜分離于一體的一種復合技術，在流量和負荷量方面顯示出極大的優(yōu)越性。第八章第八

19、章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 四 、合適分離純化介質的選擇1 、分離純化蛋白質的材料理想的蛋白質分離純化應具有以下幾個方面的性質：對目標蛋白具有較高的分離效率；在分離純化過程中不會造成目標蛋白的變性；化學性能和機械性能穩(wěn)定，重復性好；價格低廉，成本低。第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 2、層析介質要求：合適的機械穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性；顆粒和孔結構的可控制性；表面功能化的簡單性3、蛋白質純化支持介質要求：具有疏水性、中和電荷、低的非特異性結合特性第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 五、分離純化過程的規(guī)模蛋白質分離純化規(guī)模取決于所選生物材料的數(shù)量和研究者或生產(chǎn)者的目的。第八章第八章 外源基因表達產(chǎn)物的分離純化外源基因表達產(chǎn)物的分離純化 第二節(jié)第二節(jié) 不同表達形式的蛋白質分離純化蛋白質分離不同表達形式的蛋白質分離純化蛋白質分離一、分離純化的一般步驟步驟具體做法發(fā)酵液的預處理改變發(fā)酵液物理性狀和改善固液分離特性細胞分離沉降法和過濾法細胞破碎變性劑裂解法；超聲破碎法；