一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合課件

1、一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 新生新生(xnshng)(xnshng)大鼠大大鼠大腦皮層混合細(xì)胞的培養(yǎng)和腦皮層混合細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定鑒定 第一頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合一、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)(shyn)目的目的 n通過混合培養(yǎng)傳代的方法純化能得到星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察和相關(guān)的免疫抗原反應(yīng)鑒定(jindng)，旨在建立比較成熟的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 第二頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合二、實(shí)驗(yàn)材料二、實(shí)驗(yàn)材料(cilio)、試劑與器材、試劑與器材 n1H-DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；小牛血清；N2 Supplement；

2、多聚賴氨酸、Hoechst 33258、BrdU；羊抗鼠GFAP抗體、羊抗鼠BrdU抗體；FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗、PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗；FITC標(biāo)記的羊抗鼠-III-Tubulin抗體。 n2 超凈工作臺(tái)；二氧化碳培養(yǎng)箱；低速臺(tái)式離心機(jī)；活細(xì)胞(xbo)工作站；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；電熱恒溫水槽；超聲波清洗機(jī)；立式壓力蒸汽滅菌器。 第三頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合三、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)(shyn)原理原理 混合細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)主要取材于SD大鼠大腦皮層，體外剝離腦膜后機(jī)械吹打(chud)分散成單細(xì)胞懸液接種在血清培養(yǎng)基中，因?yàn)樵囵B(yǎng)過程是

3、將體內(nèi)環(huán)境轉(zhuǎn)變成體外環(huán)境，只有一小部分細(xì)胞成活下來，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞開始成熟、分裂。原代培養(yǎng)約一周左右，細(xì)胞能長滿皿底，細(xì)胞生長狀態(tài)較好。胰酶消化原代培養(yǎng)的混合細(xì)胞并重新接種，大部分神經(jīng)元死亡，在含有血清的培養(yǎng)條件下不斷的傳代導(dǎo)致細(xì)胞種類單一化，即為星形膠質(zhì)細(xì)胞。相對于神經(jīng)元的培養(yǎng)，神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)要簡單，細(xì)胞對環(huán)境的變化要求較小。 第四頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合n神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(dnbi)（GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性胞內(nèi)抗原，而神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（NCAM）是神經(jīng)類細(xì)胞（包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元以及神經(jīng)前體細(xì)胞）表面特異性抗原；微管蛋白（tubulin）是

4、組成神經(jīng)元骨架的重要組成成分和原始神經(jīng)上皮中所表達(dá)的最早的神經(jīng)元標(biāo)志物之一，其中III型微管蛋白（-III-tubulin）作為神經(jīng)元特有標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)研究中。本實(shí)驗(yàn)利用GFAP、NCAM、-III-tubulin分別對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元進(jìn)行特異性抗原染色，鑒定細(xì)胞種類及純度。 第五頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合四、實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)步驟步驟 n取出生48 h以內(nèi)(y ni)的新生大鼠，75%酒精擦拭消毒后斷頭處死，剪開頭部皮膚，外撕，然后剪破顱骨，用眼科鑷沿大腦前方夾斷視神經(jīng)，小心取出大腦放于90 mm塑料培養(yǎng)皿預(yù)冷的無菌Hanks

5、液中。在解剖顯微鏡下用腦科鑷分開左右半球，除去腦膜以及上面的血管，并除去大腦前方的嗅球和下方的下丘腦，將剝離腦膜的大腦皮層轉(zhuǎn)入另一含預(yù)冷Hanks液的塑料培養(yǎng)皿中，清洗2-3次。將清洗后的大腦皮層轉(zhuǎn)到5 ml離心管內(nèi)，加入預(yù)冷的Hanks，巴氏吸管吹打，直至組織塊完全打散，液體成懸液狀。1000-1200 r/min下離心10 min左右。離心三次，最后一次將Hanks換成DMEM。調(diào)整細(xì)胞密度（約4105 /ml），將細(xì)胞接種在包被有0.01% PLL的75 cm3細(xì)胞瓶內(nèi)（培養(yǎng)基為H-DMEM+10% FBS+1%雙抗）。37，5% CO2培養(yǎng)三天，第四天換液。以后每三天換液 。第六頁，共

6、十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】 SD大鼠大腦皮層神經(jīng)類細(xì)胞原代培養(yǎng)第三天時(shí)，培養(yǎng)皿底部有小部分細(xì)胞開始貼壁生長；換液后繼續(xù)培養(yǎng)約6 d左右，細(xì)胞鋪滿皿底，并且出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，上層細(xì)胞形態(tài)比較單一，細(xì)胞呈二極或三極狀，主要為未成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)前體細(xì)胞；下層細(xì)胞呈鋪展?fàn)?，?xì)胞較大，主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞。將混合培養(yǎng)長滿皿底的細(xì)胞胰酶消化后重新接種，得到第一代細(xì)胞，并反復(fù)按此方法將細(xì)胞按1：3進(jìn)行反復(fù)傳代3-4次，因?yàn)樵谟醒鍡l件下神經(jīng)元在體外存活(cn hu)時(shí)間較短且不能分裂，所以隨著細(xì)胞的傳代次數(shù)的增加，神經(jīng)元樣細(xì)胞越來越少，細(xì)胞形態(tài)也越來越單一，

7、同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長的速率越來越快。 第七頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合第八頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合混合細(xì)胞混合細(xì)胞(xbo)(xbo)的鑒定的鑒定 將原代長滿以及傳至第四或第五代的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行GFAP和NCAM免疫化學(xué)染色(rns)，鑒定細(xì)胞種類及細(xì)胞純度。細(xì)胞吸出培養(yǎng)液后，0.01 M PBS（pH7.2）洗兩次，每次5 min。吸去PBS，加入4%多聚甲醛，4冰箱固定過夜。然后PBS洗三次，每次5 min。滴加用PBS + NaN3（0.02%）+ BSA（3%）+ Triton X-100（0.2%)稀釋的mouse ant

8、i-GFAP IgG (1：1000）或者rabbit anti-NCAM IgG（1：500）， 4冰箱過夜后PBS洗三次，每次5 min，再加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠或者山羊抗兔二抗，室溫下作用45 min。吸去二抗，PBS洗三次，每次5 min，加入1 M Hoechst 33258室溫孵育5 min，PBS洗兩次，共5 min，最后50%緩沖甘油（PBS配制）封片，熒光顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞。陰性對照采用PBS代替一抗或者二抗，結(jié)果陰性 。第九頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】 分別對混合培養(yǎng)和不同傳代次數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFA

9、P）和III型微管蛋白（-III-Tubulin）免疫熒光染色鑒定，從表一的結(jié)果可以看到，隨著傳代次數(shù)的增加，GFAP陽性細(xì)胞的比率在逐漸的提高，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞在不斷的純化?；旌吓囵B(yǎng)原代的免疫熒光結(jié)果顯示含有部分神經(jīng)元，同時(shí)在對P4代細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞粘著(zhn zhe)分子（NCAM）和GFAP免疫抗原染色也發(fā)現(xiàn)存在少部分陰性細(xì)胞，可能是由于在分離腦膜時(shí)未去除干凈的少量成纖維細(xì)胞造成的。 第十頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合圖A：原代細(xì)胞GFAP免疫熒光鑒定；圖B：混合(hnh)培養(yǎng)原代-III-Tubulin免疫熒光鑒定; 圖C：P4代細(xì)胞NCAM免疫熒光鑒定；圖D：P4代細(xì)胞GFAP免疫熒光鑒定。 第十一頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存和融合【思考題思考題 】 1 1、如何從混合細(xì)胞中純化星形膠質(zhì)細(xì)胞？、如何從混合細(xì)胞中純化星形膠質(zhì)細(xì)胞？ 2、混合細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的有哪幾種主要的細(xì)胞類型，混合細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的有哪幾種主要的細(xì)胞類型，如何進(jìn)行如何進(jìn)行(jnxng)(jnxng)鑒定？鑒定？ 第十二頁，共十三頁。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)凍存