人體寄生蟲分子生物學與免疫學研究進展

1、“動物學研究動物學研究”系列講座系列講座程程 喆喆廈廈 門門 大大 學學 生生 命命 科科 學學 學學 院院 1 1 概述：概述： 人體寄生蟲學定義人體寄生蟲學定義 人體寄生蟲學（人體寄生蟲學（human parasitology）是研究與）是研究與人體健康有關的寄生蟲的形態(tài)、生活史、致病、實驗人體健康有關的寄生蟲的形態(tài)、生活史、致病、實驗診斷方法、流行因素與防治措施的科學，是預防醫(yī)學診斷方法、流行因素與防治措施的科學，是預防醫(yī)學和臨床醫(yī)學的一門基礎學科。和臨床醫(yī)學的一門基礎學科。 按動物分類系統(tǒng)分類，人體寄生蟲隸屬于動物界的五個門：按動物分類系統(tǒng)分類，人體寄生蟲隸屬于動物界的五個門：原生動物

2、門原生動物門（Phylum Protozoa)原蟲原蟲扁形動物門扁形動物門（Phylum Platyhelminthes)吸蟲、絳蟲吸蟲、絳蟲線形動物門線形動物門（Phylum Nemathelminthes)蛔蟲蛔蟲棘頭動物門棘頭動物門（Phylum Acanthocephala)棘頭蟲棘頭蟲節(jié)肢動物門節(jié)肢動物門 (Phylum Arthropoda)醫(yī)學昆蟲醫(yī)學昆蟲 習慣上分為：原蟲、蠕蟲習慣上分為：原蟲、蠕蟲(吸蟲、絳蟲、線蟲吸蟲、絳蟲、線蟲)、醫(yī)、醫(yī)學昆蟲三大類。學昆蟲三大類。2 2 人體寄生蟲分類人體寄生蟲分類現(xiàn)代熱帶病現(xiàn)代熱帶病 （WHO 2000）u 瘧疾瘧疾 （malaria）

3、 感染人數(shù)感染人數(shù)4億億4.9億；每年死亡人數(shù)億；每年死亡人數(shù)220250萬。萬。 u 血吸蟲病血吸蟲病 （schistosomiasis） 流行于流行于76個國家，個國家，5億億6億人口受威脅，億人口受威脅， 2 億人億人感染，每年死亡人口感染，每年死亡人口50100萬。萬。 u 絲蟲病絲蟲?。馨秃捅P尾絲蟲?。馨秃捅P尾絲蟲病 filariasis) 流行于流行于80多個國家，多個國家，1.45億人感染。億人感染。 3 3 寄生蟲的危害性寄生蟲的危害性l利什曼病利什曼病（leishmaniasis）現(xiàn)感染人口）現(xiàn)感染人口1200萬人萬人l錐蟲?。ǚ侵藓兔乐掊F蟲錐蟲?。ǚ侵藓兔乐掊F蟲 try

4、panosomiasis） 單單美洲錐蟲感染者單單美洲錐蟲感染者1800萬。萬。l麻風病麻風病 （leprosy）l結核病結核病 （tuberculosis）l登革熱登革熱 （date-fever）媒介昆蟲傳染的疾病媒介昆蟲傳染的疾病 4 4 背景：背景： 動物寄生蟲的分子生物學研究始于動物寄生蟲的分子生物學研究始于20世紀世紀90年代中期，雖然起步較晚，但進展極快。近年代中期，雖然起步較晚，但進展極快。近10年年來，研究廣度已涉及所有重要的寄生原蟲，并已來，研究廣度已涉及所有重要的寄生原蟲，并已擴展到了具有重要公共衛(wèi)生意義的部分寄生蠕蟲，擴展到了具有重要公共衛(wèi)生意義的部分寄生蠕蟲，研究深度已

5、進入寄生蟲的基因序列測定分析、分研究深度已進入寄生蟲的基因序列測定分析、分類比對鑒定、診斷方法的建立和免疫學研究領域，類比對鑒定、診斷方法的建立和免疫學研究領域，建立了近建立了近50種寄生蟲的種寄生蟲的cDNA文庫。文庫。 5 5 意義：意義： 揭示生命科學的規(guī)律。揭示生命科學的規(guī)律。 為動物寄生蟲病的研究和防控工作展示了新為動物寄生蟲病的研究和防控工作展示了新的前景。的前景。1. 1. 寄生蟲的基因組成和特點寄生蟲的基因組成和特點 相對于高等脊椎動物相對于高等脊椎動物, ,寄生蟲基因組除了核寄生蟲基因組除了核( (染染色體色體)DNA)DNA之外之外, ,還有線粒體還有線粒體(mitocho

6、ndrian)DNA(mitochondrian)DNA、動基體動基體(kineto-plast)DNA(kineto-plast)DNA（利什曼原蟲，分類和利什曼原蟲，分類和臨床診斷）臨床診斷）和質體和質體(plastid)DNA (plastid)DNA （頂復門寄生蟲，（頂復門寄生蟲，如：瘧原蟲、弓形蟲、巴貝蟲和艾美球蟲，分類和臨床如：瘧原蟲、弓形蟲、巴貝蟲和艾美球蟲，分類和臨床診斷）診斷）等。在一些低等的寄生原蟲中等。在一些低等的寄生原蟲中, ,甚至沒有甚至沒有成型的線粒體成型的線粒體DNA,DNA,如某些阿米巴除了染色體如某些阿米巴除了染色體DNADNA外外, ,只有類似細菌質粒的環(huán)

7、狀只有類似細菌質粒的環(huán)狀DNADNA和胞質和胞質DNADNA?；蚪M大小基因組大小: :寄生蟲染色體基因組的大小差別較大寄生蟲染色體基因組的大小差別較大, ,其中其中, ,微孢子蟲微孢子蟲MicrosporidiaMicrosporidia基因組的大小不到基因組的大小不到10 Mb,10 Mb,在整個真核生物中最小在整個真核生物中最小; ;血吸蟲基因組為血吸蟲基因組為270 Mb,270 Mb,相當于人類基因組的相當于人類基因組的1/101/10重復序列：高度、中度和單拷貝重復序列重復序列：高度、中度和單拷貝重復序列, , 不同的不同的寄生蟲重復序列所占的比例不同寄生蟲重復序列所占的比例不同堿

8、基含量堿基含量: :寄生蟲基因組堿基寄生蟲基因組堿基G+CG+C含量在含量在30% - 40%30% - 40%之之間間,AT,AT含量豐富含量豐富線粒體線粒體DNADNA： 線粒體線粒體DNADNA具有母系遺傳和快速進化的特點具有母系遺傳和快速進化的特點, ,較染色體較染色體DNADNA更易更易反映種、株乃至型間差異反映種、株乃至型間差異, ,由于具有較好的穩(wěn)定性由于具有較好的穩(wěn)定性, ,因此通常被因此通常被用來評價物種的種系發(fā)生。目前已對血吸蟲、惡性瘧原蟲、弓用來評價物種的種系發(fā)生。目前已對血吸蟲、惡性瘧原蟲、弓形蟲、單殖吸蟲形蟲、單殖吸蟲( (Microcotyle sebastis,

9、G. thymalli, G. salaris, Microcotyle sebastis, G. thymalli, G. salaris, G. derjavin-oidesG. derjavin-oides) )、血吸蟲、血吸蟲( (S. japonicum, S. mekongi, S. S. japonicum, S. mekongi, S. mansoni, S.haematobium, S. spindalemansoni, S.haematobium, S. spindale) )、肝片吸蟲、肝片吸蟲Fasciola Fasciola hepaticahepatica、衛(wèi)氏并殖

10、吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲ParagonimuswestermaniParagonimuswestermani及絳蟲及絳蟲( (Hymenolepis diminuta,Taenia asiatica, T. solium, T. crassiceps, Hymenolepis diminuta,Taenia asiatica, T. solium, T. crassiceps, E. multilocularis, E. granulosusE. multilocularis, E. granulosus) )等多種寄生蟲的全線粒體基因等多種寄生蟲的全線粒體基因組作了測序分析組作了測序分析(Litt

11、lewoodet al., 2006; Valles& Boore, (Littlewoodet al., 2006; Valles& Boore, 2006; Parket al., 2007; Plaisanceetal., 2007; 2006; Parket al., 2007; Plaisanceetal., 2007; Huyseetal., 2007Huyseetal., 2007、2008)2008)。2.2.寄生蟲基因組測序現(xiàn)狀寄生蟲基因組測序現(xiàn)狀目前寄生蟲基因組測出的序列主要分目前寄生蟲基因組測出的序列主要分3 3類類: :A.A.完整或接近完整的基因組序列

12、完整或接近完整的基因組序列, ,主要是可讀框區(qū)主要是可讀框區(qū)的重復序列的重復序列, ,通常用重疊群通常用重疊群(contigs)(contigs)表示表示; ; B.B.基因組測序序列標簽基因組測序序列標簽(GSSs),(GSSs),主要有瀏覽基因組主要有瀏覽基因組序列產(chǎn)生或隨機克隆、細菌人工載體序列產(chǎn)生或隨機克隆、細菌人工載體(BAC)(BAC)末末端序列端序列, ,用來擴增大片段的用來擴增大片段的DNADNA（200 kb200 kb左右左右););C.C.表達序列標簽表達序列標簽(ESTs),(ESTs),由由mRNAmRNA轉錄產(chǎn)生的轉錄產(chǎn)生的cDNA,cDNA,并擴增后進行的測定序列

13、。并擴增后進行的測定序列。已經(jīng)完成基因組測序的寄生蟲包括惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲已經(jīng)完成基因組測序的寄生蟲包括惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲P. yoeliiP. yoelii、馬來布魯線蟲、馬來布魯線蟲Brugia malayiBrugia malayi、克氏錐蟲、克氏錐蟲T. cruziT. cruzi、小隱孢子蟲、小隱孢子蟲Cryptosporidium parvumCryptosporidium parvum及岡及岡比亞按蚊比亞按蚊Anopheles gambiaeAnopheles gambiae等的基因組全序列等的基因組全序列意義： 基因組分析過程中發(fā)現(xiàn)了大約基因組分析過程中發(fā)現(xiàn)了大約200

14、200種蛋白的基因，種蛋白的基因，這些蛋白質參與了免疫逃避。以前的研究顯示，在某這些蛋白質參與了免疫逃避。以前的研究顯示，在某種復雜的掩護機制之下，寄生蟲通過在細胞表面表達種復雜的掩護機制之下，寄生蟲通過在細胞表面表達不同的蛋白質來逃避宿主的免疫反應。不同的蛋白質來逃避宿主的免疫反應。 發(fā)現(xiàn)編碼參與代謝途徑蛋白的基因，蟲體存在而發(fā)現(xiàn)編碼參與代謝途徑蛋白的基因，蟲體存在而人體不存在的特有途徑中的基因是潛在的藥物靶標。人體不存在的特有途徑中的基因是潛在的藥物靶標。 比較惡性瘧原蟲與瘧原蟲其他種的序列，可以闡比較惡性瘧原蟲與瘧原蟲其他種的序列，可以闡明特定株特異性的基因和生理過程?；蛘弑容^惡明特定株

15、特異性的基因和生理過程?；蛘弑容^惡性瘧原蟲不同株的序列，可以快速地鑒定與免疫、性瘧原蟲不同株的序列，可以快速地鑒定與免疫、發(fā)病機制和人侵有關的變異。發(fā)病機制和人侵有關的變異。 通過功能基因組高通量技術進行大規(guī)模的實驗。通過功能基因組高通量技術進行大規(guī)模的實驗。設計設計DNADNA微陣列檢測基因的表達。例如，分離不微陣列檢測基因的表達。例如，分離不同時期的同時期的DNADNA微陣列，確定基因的表達變化，對微陣列，確定基因的表達變化，對于特別重要的基因可用敲除或修飾的方法來確定于特別重要的基因可用敲除或修飾的方法來確定功能。功能?？菔襄F蟲枯氏錐蟲DNA復制和修復機器復制和修復機器 ;布氏錐蟲布氏錐

16、蟲代謝的途徑和一些細胞生物學代謝的途徑和一些細胞生物學 ;碩大利什曼原蟲碩大利什曼原蟲不尋常的基因表達等問題；不尋常的基因表達等問題；基因組都是單倍體，長度從基因組都是單倍體，長度從25到到55Mb大小不等；大小不等；多數(shù)基因都以長且定向的聚集方式組合在一起，多數(shù)基因都以長且定向的聚集方式組合在一起，暗示主要是以多順反子地形式進行轉錄，隨后被暗示主要是以多順反子地形式進行轉錄，隨后被切割成單獨的切割成單獨的mRNA分子。分子。 在三個基因組中很少發(fā)現(xiàn)表達轉錄因子在三個基因組中很少發(fā)現(xiàn)表達轉錄因子的基因存在，但高表達一些含有的基因存在，但高表達一些含有RNA結合結合基序的蛋白質。這些觀察結果支持

17、了先前基序的蛋白質。這些觀察結果支持了先前的觀點，就是錐蟲基因表達的調(diào)控主要發(fā)的觀點，就是錐蟲基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉錄后水平。生在轉錄后水平。缺乏轉錄水平的精確調(diào)控帶來了一個有趣缺乏轉錄水平的精確調(diào)控帶來了一個有趣的結果：的結果： 只有通過基因的復制或擴增來增只有通過基因的復制或擴增來增加表達水平的提高。加表達水平的提高。 從從DNA復制和修復的角度來看，錐蟲類和復制和修復的角度來看，錐蟲類和真核生物的其他生物區(qū)別很大?；蚪M不包含真核生物的其他生物區(qū)別很大。基因組不包含牽涉到應對氧脅迫的基因；復制起始裝置更像牽涉到應對氧脅迫的基因；復制起始裝置更像古菌，而非真核生物（生物學和進化學上的興

18、古菌，而非真核生物（生物學和進化學上的興趣趣 ）。）。 錐蟲類特異性蛋白激酶，類細菌的線粒體錐蟲類特異性蛋白激酶，類細菌的線粒體DNA聚合酶，以及特殊的表面蛋白修飾都可以聚合酶，以及特殊的表面蛋白修飾都可以作為潛在的藥物靶位點。作為潛在的藥物靶位點。 編碼基因編碼基因13469個個,其中有首次發(fā)現(xiàn)的與血吸其中有首次發(fā)現(xiàn)的與血吸蟲感染宿主密切相關的彈力蛋白酶基因。日本血蟲感染宿主密切相關的彈力蛋白酶基因。日本血吸蟲一方面丟失了很多與營養(yǎng)代謝相關的基因吸蟲一方面丟失了很多與營養(yǎng)代謝相關的基因,如脂肪酸、氨基酸、膽固醇和性激素合成基因等如脂肪酸、氨基酸、膽固醇和性激素合成基因等,這些營養(yǎng)物質必須從哺

19、乳動物宿主獲得這些營養(yǎng)物質必須從哺乳動物宿主獲得;另一方另一方面面,擴充了許多有利于蛋白消化的酶類基因家族擴充了許多有利于蛋白消化的酶類基因家族的成員。的成員。 與宿主相互作用蛋白。與宿主相互作用蛋白。Wellcome Trust Sanger Institute原蟲：瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲、孢子蟲原蟲：瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲、孢子蟲蠕蟲：包括蛔蟲、肝包蟲、馬來絲蟲，捻轉血矛線蟲，管圓線蟲蠕蟲：包括蛔蟲、肝包蟲、馬來絲蟲，捻轉血矛線蟲，管圓線蟲 絳蟲丟失了絳蟲丟失了homeobox 基因和一些干細基因和一些干細胞關鍵基因如胞關鍵基因如piwi蛋白基因，同時也發(fā)現(xiàn)熱蛋白基因，

20、同時也發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白休克蛋白70和其他一些抗原基因存在種特異和其他一些抗原基因存在種特異性擴增。性擴增。 比較結果發(fā)現(xiàn)，絳蟲存在特異的解毒途比較結果發(fā)現(xiàn)，絳蟲存在特異的解毒途徑，以及依賴宿主營養(yǎng)物質的代謝方式。確徑，以及依賴宿主營養(yǎng)物質的代謝方式。確定了現(xiàn)有藥物可能的作用靶點，為研發(fā)高效定了現(xiàn)有藥物可能的作用靶點，為研發(fā)高效新疫苗和新藥物提供理論支持，給有效預防新疫苗和新藥物提供理論支持，給有效預防和控制絳蟲病帶來新的希望。和控制絳蟲病帶來新的希望。 第三代測序技術第三代測序技術 它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，是化學法測序的2萬倍。 它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身

21、的延續(xù)性，一個反應就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。 精度高，達到99.9999%。 定義：定義：微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA),DNA(microsatellite DNA),又稱短小串連重又稱短小串連重復序列復序列(short tandem repeats,STR)(short tandem repeats,STR)或簡單重復序或簡單重復序列列(simple repeats sequence,SRS(simple repeats sequence,SRS或或SSR)SSR)。相對于。相對于衛(wèi)星序列和小衛(wèi)星

22、序列衛(wèi)星序列和小衛(wèi)星序列, ,微衛(wèi)星的重復序列更短微衛(wèi)星的重復序列更短, ,一般一般只有只有1 bp6 bp1 bp6 bp、長度僅為幾百個、長度僅為幾百個bpbp的位點。微衛(wèi)星的位點。微衛(wèi)星重復類型有兩種重復類型有兩種, ,即單核苷酸即單核苷酸(A/T(A/T、C/GC/G等等) )和和4 4種二核種二核苷酸苷酸(AT/TA(AT/TA、AG/TCAG/TC、TG/ACTG/AC、CG/GC)CG/GC)。AC/TGAC/TG約占約占50%50%以上以上, ,三、四核苷酸重復類型和其他類型的要少一些。三、四核苷酸重復類型和其他類型的要少一些。 優(yōu)點：優(yōu)點： 微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNADNA具有具有R

23、FLPRFLP、SSLPSSLP、RAPDRAPD等遺傳標記技術等遺傳標記技術無法比擬的優(yōu)勢無法比擬的優(yōu)勢 種類分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性、重組率低種類分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性、重組率低, , 在群體中變異范圍大、長度多態(tài)性豐富、高度個在群體中變異范圍大、長度多態(tài)性豐富、高度個體特異性、基因組中且分布比較均勻體特異性、基因組中且分布比較均勻 基因片段小、容易操作基因片段小、容易操作 遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律、能提供眾多有高度遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律、能提供眾多有高度遺傳信息的新的多態(tài)性標記遺傳信息的新的多態(tài)性標記意義：意義：微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNADNA多態(tài)性標記被應用于動植物遺傳育種、遺多態(tài)

24、性標記被應用于動植物遺傳育種、遺傳圖譜的構建、群體遺傳學研究、疾病相關基因、傳圖譜的構建、群體遺傳學研究、疾病相關基因、免疫和遺傳變異機制的研究。免疫和遺傳變異機制的研究。寄生蟲微衛(wèi)星寄生蟲微衛(wèi)星DNA 寄生蟲與宿主在進化過程中的相互關寄生蟲與宿主在進化過程中的相互關系系, ,為闡明寄生蟲的進化史提供更有價值為闡明寄生蟲的進化史提供更有價值的依據(jù)的依據(jù); ;宿主對寄生蟲免疫機制宿主對寄生蟲免疫機制; ;抗藥性蟲抗藥性蟲株的變異機制及寄生蟲藥物的篩選株的變異機制及寄生蟲藥物的篩選; ;影響影響寄生蟲流行和傳播的因素寄生蟲流行和傳播的因素, ,這些因素如何這些因素如何導致變異等方面。導致變異等方面

25、。 定義：定義： 反式剪接最早發(fā)現(xiàn)于錐蟲反式剪接最早發(fā)現(xiàn)于錐蟲(Trypanosome)(Trypanosome)可變表可變表面糖蛋白面糖蛋白(VSG)(VSG)基因中?；蛑?。VSGVSG基因轉錄后成熟基因轉錄后成熟mRNA mRNA 55端端35 bp35 bp是其基因中沒有的是其基因中沒有的, ,這段序列來自另外這段序列來自另外一基因的小外顯子一基因的小外顯子(mini exon)(mini exon)或或SL (spliced SL (spliced leader),leader),這段外來的序列與這段外來的序列與VSGVSG的的mRNA 5mRNA 5端接合端接合形成成熟的形成成熟的

26、mRNAmRNA。這種由來自不同基因。這種由來自不同基因mRNAmRNA通過通過剪接形成成熟剪接形成成熟mRNAmRNA的剪接方式稱為反式剪接。的剪接方式稱為反式剪接。SL反式剪接廣泛存在于低等真核生物中,雖然各種生物體SL RNA長度,SL DNA長度,SL基因拷貝數(shù)不盡相同,但SL RNA及SL反式剪接的現(xiàn)象已被廣泛證明,而且越來越多的研究者在關注和應用這一生物現(xiàn)象。反式剪接與順式剪接有相似之處也有不同之處。相同的是它們中反式剪接與順式剪接有相似之處也有不同之處。相同的是它們中都存在典型的剪接位點都存在典型的剪接位點, ,都需要同樣的都需要同樣的snRNPsnRNP來參與。來參與。特點：特

27、點：SL RNASL RNA長約長約100 bp,100 bp,其中有一其中有一SmSm樣蛋白結合位點樣蛋白結合位點, SL RNA, SL RNA的的SmSm樣蛋白結合位點樣蛋白結合位點和和U6 SnRNAU6 SnRNA堿基配對可在體外進行堿基配對可在體外進行, ,推測這一反應可能吸引推測這一反應可能吸引SL RNASL RNA于剪接于剪接體中體中, ,從而觸發(fā)了這一反式剪接的進行。二級結構還有兩個莖環(huán)結構。從而觸發(fā)了這一反式剪接的進行。二級結構還有兩個莖環(huán)結構。SL RNASL RNA高度甲基化形成帽子結構。突變高度甲基化形成帽子結構。突變SL RNASL RNA失去高度甲基化形成帽子結

28、構失去高度甲基化形成帽子結構的能力的能力, ,會導致不能正常地完成反式剪接。會導致不能正常地完成反式剪接。反式剪接中至少兩步需要有反式剪接中至少兩步需要有SRSR蛋白的參與蛋白的參與, ,在在U2 SnRNPU2 SnRNP加到加到33端受體之前和端受體之前和之后之后,SR,SR蛋白發(fā)揮重要作用。主要是通過蛋白發(fā)揮重要作用。主要是通過SRSR蛋白的蛋白的RSRS區(qū)磷酸化來觸發(fā)已和區(qū)磷酸化來觸發(fā)已和U2 SnRNPU2 SnRNP結合的結合的SL RNASL RNA反式剪接。反式剪接。意義：意義： 應用應用SLSL保守序列作為基因標簽來獲得功能性基因或保守序列作為基因標簽來獲得功能性基因或構建構

29、建SL cDNASL cDNA文庫。文庫。SL cDNASL cDNA文庫的構建和分析可能文庫的構建和分析可能為寄生蟲免疫功能基因的為寄生蟲免疫功能基因的篩選篩選，以及研究寄生蟲的，以及研究寄生蟲的階段特異性表達提供了更加方便、快捷的手段。階段特異性表達提供了更加方便、快捷的手段。 SL RNA SL RNA反式剪接可作為一種重要的修復反式剪接可作為一種重要的修復RNARNA外顯外顯子突變的方法子突變的方法, ,將正?；蚧蚓哂蓄愃乒δ艿幕鶎⒄；蚧蚓哂蓄愃乒δ艿幕蚱芜B接到因片段連接到SLSL序列上序列上, ,在在SLSL的引導下將正常的的引導下將正常的RNARNA序列經(jīng)反式剪接換下突變

30、的部分序列經(jīng)反式剪接換下突變的部分, ,達到修復達到修復的目的。的目的。 原核生物不存在的細胞核原核生物不存在的細胞核, ,沒有沒有mRNAmRNA的后加工過程的后加工過程; ;真核生物有細胞核真核生物有細胞核, ,轉錄初始轉錄初始mRNAmRNA要經(jīng)過一系列的后要經(jīng)過一系列的后加工過程。而在低等真核生物中的初始加工過程。而在低等真核生物中的初始mRNAmRNA經(jīng)反式經(jīng)反式剪接在剪接在55端加上含有高度甲基化的帽子結構端加上含有高度甲基化的帽子結構(cap4)(cap4)的的SL RNA,SL RNA,似乎與典型真核生物中似乎與典型真核生物中55端帽化很相似端帽化很相似, ,從進化角度從進化角

31、度, ,這種反式剪接是一種進化過度形式這種反式剪接是一種進化過度形式, ,這這種形式是從原始的一共同祖先進化而來種形式是從原始的一共同祖先進化而來, ,還是不同的還是不同的群體各自進化而來還有待進一步研究。群體各自進化而來還有待進一步研究。RNARNA干擾技術簡介干擾技術簡介RNARNA干擾干擾(RNA interference, RNAi)(RNA interference, RNAi)是一種在真是一種在真核生物中普遍存在的自身防御反應核生物中普遍存在的自身防御反應, ,是內(nèi)源或是內(nèi)源或外源性雙鏈外源性雙鏈RNA (double stranded RNA, RNA (double stran

32、ded RNA, dsRNA)dsRNA)引起細胞內(nèi)有效的特異基因關閉或基因引起細胞內(nèi)有效的特異基因關閉或基因沉默現(xiàn)象。沉默現(xiàn)象。1. dsRNA1. dsRNA被被RNARNA酶酶家族中的雙鏈家族中的雙鏈RNARNA特特異性核酸內(nèi)切酶異性核酸內(nèi)切酶DicerDicer特異性識別特異性識別, ,隨隨后降解為后降解為21232123個核苷酸長度的個核苷酸長度的33末末端突出端突出2 2個核苷酸的個核苷酸的siRNA ( small siRNA ( small interfering RNA)interfering RNA)。2. siRNA2. siRNA生成后融入一大分子多蛋白復生成后融入一大

33、分子多蛋白復合體合體RNARNA誘導沉默復合體誘導沉默復合體(RISC), (RISC), siRNAsiRNA隨即解鏈為正義鏈和反義鏈。隨即解鏈為正義鏈和反義鏈。3. 3. 若目的若目的mRNAmRNA中有部分序列與中有部分序列與siRNAsiRNA的的反義鏈互補反義鏈互補, ,則則siRNAsiRNA的反義鏈可與之的反義鏈可與之互補配對并將互補配對并將mRNAmRNA在互補區(qū)的中間部在互補區(qū)的中間部分降解分降解, ,從而引起轉錄后的基因沉默。從而引起轉錄后的基因沉默。dsRNA /siRNAdsRNA /siRNA介導途徑介導途徑RNAiRNAi技術的特點技術的特點高穩(wěn)定性高穩(wěn)定性以以33

34、端突出端突出TTTT堿基的堿基的dsRNAdsRNA尤為穩(wěn)尤為穩(wěn)定定, ,無需象反義核酸那樣進行廣泛的化學修飾以無需象反義核酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期。提高半衰期。高度專一性高度專一性即即dsRNAdsRNA具有高度的特異性具有高度的特異性, ,它只它只能引起與能引起與dsRNAdsRNA同源的基因表達活性大幅度降低同源的基因表達活性大幅度降低, ,即即RNAiRNAi有同源基因依賴性。有同源基因依賴性。siRNAsiRNA除正義鏈除正義鏈33端端的的3 3個堿基在序列識別中不起主要作用外個堿基在序列識別中不起主要作用外, ,其他單其他單個堿基改變就可能使個堿基改變就可能使RNAiR

35、NAi失效失效, ,而針對同源基因而針對同源基因共有序列的共有序列的RNAiRNAi則導致同源基因共同失活。則導致同源基因共同失活。RNAiRNAi技術的特點技術的特點高效性高效性RNAiRNAi機制中存在催化或放大的步驟機制中存在催化或放大的步驟, ,少量的少量的dsRNAdsRNA分子就能完全抑制相應基因的表達分子就能完全抑制相應基因的表達, ,能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下研究能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下研究目標基因目標基因, ,比基因敲除更簡單比基因敲除更簡單, ,更快捷。而且更快捷。而且, ,那那些在胚胎中敲除后導致死亡的基因些在胚胎中敲除后導致死亡的基因, ,也可以利

36、用也可以利用RNAiRNAi的方法在培養(yǎng)細胞中進行研究。的方法在培養(yǎng)細胞中進行研究。高穿透性高穿透性RNAiRNAi抑制基因表達的效應可以穿抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限過細胞界限, ,在不同細胞間長距離傳遞和維持在不同細胞間長距離傳遞和維持, ,在線蟲中干擾效應甚至可以傳到后代去。在線蟲中干擾效應甚至可以傳到后代去。RNAiRNAi技術鑒定技術鑒定布氏錐蟲基因布氏錐蟲基因功能功能定義：定義：miRNAmiRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小是一類內(nèi)源性非編碼的小RNARNA，在動物中來源于，在動物中來源于長度約長度約70 bp70 bp90 bp90 bp的前體。前體經(jīng)過雙鏈的前體。前體經(jīng)過雙鏈

37、RNARNA特特異性的異性的RNase-DroshaRNase-Drosha及及RNase-DicerRNase-Dicer和和AGOAGO作用，作用，最終形成最終形成18 nt18 nt22 nt22 nt長度的成熟，然后通過與靶長度的成熟，然后通過與靶mRNA 3mRNA 3端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)(UTR)(UTR)結合導致靶基因翻譯阻結合導致靶基因翻譯阻遏或者降解，實現(xiàn)轉錄后抑制調(diào)控。遏或者降解，實現(xiàn)轉錄后抑制調(diào)控。 1993年在秀麗新桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)MicroRNA(miRNA)lin-4以及l(fā)et-7，發(fā)現(xiàn)為寄生蟲的轉錄后調(diào)控研究提供了新的契機。miRNAmiRNA和和siRNAsiR

38、NA之間的關系之間的關系MiRNAMiRNA：是非編碼的單鏈小分子：是非編碼的單鏈小分子RNARNA，在進化上高度保守，通過，在進化上高度保守，通過翻譯抑制調(diào)控基因表達而不影響轉錄本的穩(wěn)定性；翻譯抑制調(diào)控基因表達而不影響轉錄本的穩(wěn)定性；miRNAsmiRNAs通常通常是由較大的（是由較大的（707090 nt90 nt）的莖環(huán)結構（發(fā)夾結構）前體經(jīng)）的莖環(huán)結構（發(fā)夾結構）前體經(jīng)DicerDicer酶切割得到的。酶切割得到的。miRNAsmiRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中，則廣泛存在于哺乳動物細胞中，從理論上推測可能參與多種調(diào)控作用。從理論上推測可能參與多種調(diào)控作用。 siRNAsiRNA：

39、針對編碼區(qū)的雙鏈小分子：針對編碼區(qū)的雙鏈小分子RNARNA，每個轉錄本都可能有很，每個轉錄本都可能有很多個多個siRNAssiRNAs，是通過降解目標靶，在轉錄后調(diào)控基因表達。也，是通過降解目標靶，在轉錄后調(diào)控基因表達。也要經(jīng)要經(jīng)DicerDicer酶切割酶切割dsRNAdsRNA得到。哺乳動物細胞中還沒有找到內(nèi)源得到。哺乳動物細胞中還沒有找到內(nèi)源siRNAsiRNA。血吸蟲血吸蟲Micro RNAMicro RNAXueXue等在日本血吸蟲中發(fā)現(xiàn)了等在日本血吸蟲中發(fā)現(xiàn)了5 5種新的種新的miRNAmiRNA，其中，其中4 4種具有保守性的種具有保守性的miRNA(sja-let-7miRNA

40、(sja-let-7，sja-miR-71sja-miR-71，sja-miR-125sja-miR-125和和sja-bantam)sja-bantam)，1 1種種(sja-miR-new1)(sja-miR-new1)為血吸蟲特有。對這為血吸蟲特有。對這5 5種新的種新的miRNAmiRNA在日本血吸蟲在日本血吸蟲6 6個發(fā)個發(fā)育期中表達情況的分析表明，這些育期中表達情況的分析表明，這些miRNAmiRNA表現(xiàn)出高度的期特異性。表現(xiàn)出高度的期特異性。 let-7let-7：高度的期特異性；毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的：高度的期特異性；毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的1212倍，在倍，

41、在尾蚴期達到高峰。因此，推測尾蚴期達到高峰。因此，推測let-7let-7在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的發(fā)育調(diào)控相關。發(fā)育調(diào)控相關。 sja-miR-71sja-miR-71、sja-bantamsja-bantam：毛蚴期開始表達，尾蚴期達到高峰。而尾蚴：毛蚴期開始表達，尾蚴期達到高峰。而尾蚴是血吸蟲的感染期，當尾蚴進入宿主動物細胞后，是血吸蟲的感染期，當尾蚴進入宿主動物細胞后，sja-miR-71sja-miR-71的表達立的表達立刻降到最低水平然后進入童蟲期，并在此后的生命活動過程中始終保持刻降到最低水平然后進入童蟲期，并在此后的生命活動過程中始終保持在較低

42、的水平。在較低的水平。sja-miR-71sja-miR-71在尾蚴期的表達量高于童蟲期近在尾蚴期的表達量高于童蟲期近10001000倍，倍，sja-bantamsja-bantam高達高達500500倍。表達量的變化與生活周期變化相關，與性別無倍。表達量的變化與生活周期變化相關，與性別無關。關。藍氏賈第鞭毛蟲藍氏賈第鞭毛蟲Micro RNAMicro RNA藍氏賈第鞭毛蟲是藍氏賈第鞭毛蟲是miRNAmiRNA研究中第一個經(jīng)過克隆和實驗驗證的原蟲。研究中第一個經(jīng)過克隆和實驗驗證的原蟲?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，藍氏賈第鞭毛蟲的至少現(xiàn)在已經(jīng)明確，藍氏賈第鞭毛蟲的至少4 4種種miRNAmiRNA來源于細胞內(nèi)

43、來源于細胞內(nèi)的小核仁的小核仁RNA(Small nucleolar RNARNA(Small nucleolar RNA，snoRNA)snoRNA)。起源于起源于snoRNAsnoRNA的具有的具有miRNAmiRNA功能的小功能的小RNARNA的發(fā)現(xiàn)擴展了寄生原蟲的發(fā)現(xiàn)擴展了寄生原蟲的調(diào)節(jié)性小的調(diào)節(jié)性小RNARNA的來源。該研究首次提出的來源。該研究首次提出miRNAmiRNA來源于來源于snoRNAsnoRNA，而不是由而不是由miRNAmiRNA基因本身編碼，意味著在基因本身編碼，意味著在miRNAmiRNA介導的基因沉介導的基因沉默過程中很可能有我們尚未發(fā)現(xiàn)的新途徑。這種現(xiàn)象也意味默

44、過程中很可能有我們尚未發(fā)現(xiàn)的新途徑。這種現(xiàn)象也意味著在寄生蟲和宿主中起源于其它含量豐富的著在寄生蟲和宿主中起源于其它含量豐富的RNARNA分子分子( (如如rRNArRNA，tRNAtRNA和和snRNA)snRNA)并且與并且與AGOAGO相關的小相關的小RNARNA很可能也具有調(diào)節(jié)基因很可能也具有調(diào)節(jié)基因表達的功能。表達的功能。AGOAGO蛋白在賈第鞭毛蟲發(fā)育過程中起重要作用，它可以特異性蛋白在賈第鞭毛蟲發(fā)育過程中起重要作用，它可以特異性地與地與m(7)G-m(7)G-帽子結合，從而協(xié)助帽子結合，從而協(xié)助miRNAmiRNA介導的轉錄抑制調(diào)控。介導的轉錄抑制調(diào)控。在在DicerDicer的

45、作用下，的作用下，snoRNA GlsR17snoRNA GlsR17被加工為被加工為26 nt26 nt大小的大小的miRNA(miR2)miRNA(miR2)。熒光素酶。熒光素酶(Luciferase)(Luciferase)基因在其基因在其3 3端包含端包含6 6個與個與miR2miR2作用位點一致的序列，將該酶的作用位點一致的序列，將該酶的mRNAmRNA與人工合成與人工合成的的miR2miR2共同溫育，則導致熒光素酶的表達量下降共同溫育，則導致熒光素酶的表達量下降40%40%，而，而mRNAmRNA的穩(wěn)定性并不受影響。因此，的穩(wěn)定性并不受影響。因此，miRNAmiRNA的轉錄調(diào)控很可

46、能的轉錄調(diào)控很可能是通過翻譯阻遏而不是是通過翻譯阻遏而不是mRNAmRNA降解完成的。降解完成的。另一方面，另一方面，DicerDicer基因的沉默則會導致細胞中基因的沉默則會導致細胞中snoRNAsnoRNA不能被分不能被分解，相應解，相應miRNAmiRNA在細胞中的含量急劇降低。同時變異表面糖在細胞中的含量急劇降低。同時變異表面糖蛋白蛋白(Variant surface glycoprotein(Variant surface glycoprotein，VSG)VSG)表達不受限制，表達不受限制，由單一表達變成多表達，表明調(diào)節(jié)藍氏賈第蟲的抗原變異由單一表達變成多表達，表明調(diào)節(jié)藍氏賈第蟲的

47、抗原變異是是miRNAmiRNA的沉默調(diào)節(jié)功能之一。的沉默調(diào)節(jié)功能之一。定義：定義：熱激蛋白（熱激蛋白（Heat shock proteinsHeat shock proteins，HSPsHSPs）是指所有原核生物）是指所有原核生物和真核生物在生長發(fā)育或受到不同理化及病理因素刺激時，和真核生物在生長發(fā)育或受到不同理化及病理因素刺激時，機體內(nèi)新合成或表達量增加的一組蛋白質家族，屬非分泌機體內(nèi)新合成或表達量增加的一組蛋白質家族，屬非分泌型蛋白質。熱激蛋白是物種種系發(fā)生中結構和功能最為保型蛋白質。熱激蛋白是物種種系發(fā)生中結構和功能最為保守的一類蛋白質，同時也是分子伴侶（守的一類蛋白質，同時也是分子

48、伴侶（Molecular Molecular chaperonechaperone）中最重要的一類蛋白。熱激蛋白的主要生物）中最重要的一類蛋白。熱激蛋白的主要生物學功能是幫助相關蛋白質的折疊（學功能是幫助相關蛋白質的折疊（FoldingFolding）、移位）、移位（TranslocationTranslocation）、復性（）、復性（RenaturationRenaturation）和降解）和降解（DegradationDegradation），以保護生物體細胞免受內(nèi)外不良因素），以保護生物體細胞免受內(nèi)外不良因素的損害。的損害。作用機理：作用機理：熱激蛋白通常在細胞應激時產(chǎn)生，其表達非常迅

49、速。應激因熱激蛋白通常在細胞應激時產(chǎn)生，其表達非常迅速。應激因素包括高溫、缺氧、缺血、素包括高溫、缺氧、缺血、Ca2+Ca2+含量增高、癌癥和局部損含量增高、癌癥和局部損傷感染等多種有害因素，這些因素引發(fā)細胞的應激反應，傷感染等多種有害因素，這些因素引發(fā)細胞的應激反應，使原本在正常情況下以單體形式與阻遏蛋白結合而不能結使原本在正常情況下以單體形式與阻遏蛋白結合而不能結合到熱激元件（合到熱激元件（Heat shock elementHeat shock element，HSEHSE，即在熱激蛋，即在熱激蛋白基因轉錄中起調(diào)控作用的白基因轉錄中起調(diào)控作用的DNADNA序列）上的熱激因子序列）上的熱激

50、因子（Heatshock factorHeatshock factor，HSFHSF，可識別熱激元件）受刺激而，可識別熱激元件）受刺激而與阻遏蛋白分離，與熱激元件特異結合，從而啟動基因轉與阻遏蛋白分離，與熱激元件特異結合，從而啟動基因轉錄。錄。寄生蟲寄生蟲HSPHSP：在寄生蟲感染宿主過程中，宿主因寄生蟲的入侵而處于應在寄生蟲感染宿主過程中，宿主因寄生蟲的入侵而處于應激狀態(tài)，產(chǎn)生對蟲體入侵起保護作用的激狀態(tài)，產(chǎn)生對蟲體入侵起保護作用的HSPsHSPs。而寄生。而寄生蟲在入侵宿主的過程中，由于環(huán)境溫度和理化條件的蟲在入侵宿主的過程中，由于環(huán)境溫度和理化條件的改變，生理和免疫因素的作用，使寄生蟲蟲

51、體也處于改變，生理和免疫因素的作用，使寄生蟲蟲體也處于應激狀態(tài)，產(chǎn)生參與寄生蟲分化、增強寄生蟲毒力及應激狀態(tài)，產(chǎn)生參與寄生蟲分化、增強寄生蟲毒力及逃避宿主免疫作用的逃避宿主免疫作用的HSPsHSPs。多數(shù)寄生蟲的。多數(shù)寄生蟲的HSPsHSPs可作為可作為免疫優(yōu)勢抗原，誘導宿主產(chǎn)生抗體。近年來對寄生蟲免疫優(yōu)勢抗原，誘導宿主產(chǎn)生抗體。近年來對寄生蟲HSPsHSPs的研究熱點主要集中在原蟲、線蟲、吸蟲等的的研究熱點主要集中在原蟲、線蟲、吸蟲等的HSP90HSP90、HSP70HSP70和和HSP60HSP60上，也部分涉及上，也部分涉及sHSPsHSP。應用：應用：HSPsHSPs的許多特性顯示其具有廣闊的應用前景，如的許多特性顯示其具有廣闊的應用前景，如HSP70HSP70可可以作為一個潛在的亞單位疫苗佐劑協(xié)同對抗瘧原蟲的以作為一個潛在的