新型鴨病毒性肝炎病毒

1、新型鴨病毒性肝炎病毒巢式新型鴨病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR檢測檢測方法的建立及應(yīng)用方法的建立及應(yīng)用報(bào)告人：王梓1.鴨病毒性肝炎 鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染性疾病。鴨病毒性肝炎在臨床上以發(fā)病急、傳播迅速、病程短、高死亡率為主要特征，該病主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨,10口齡以內(nèi)的雛鴨的死亡率高達(dá)90%95%。1.1 DHV的歷史與分布 鴨肝炎病毒(DHV)包括三個(gè)血清型，分別引起型, 型和型鴨病毒性肝炎。其中型鴨病毒性肝炎呈世

2、界性分布。我國流行的鴨病毒性肝炎主要為型鴨病毒性肝炎，近年來陸續(xù)有新型鴨病毒性肝炎發(fā)現(xiàn)三個(gè)型之間無抗原相關(guān)性，沒有交叉保護(hù)和交叉中和作用。DHV最早發(fā)現(xiàn)是在1945年由Levine在美國發(fā)現(xiàn)了型鴨病毒性肝炎。該病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法國、日本、美國和埃及等地流行、在我國廣東、北京、浙江、福建、四川、安徽、廣西、江蘇、山東等地相繼發(fā)生該病、目前幾乎世界范圍內(nèi)主要養(yǎng)鴨地區(qū)均存在該病，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 型鴨病毒性肝炎是1958年首先爆發(fā)于英格蘭諾?？锁唸?，其他地區(qū)未見本病的報(bào)道。型鴨病毒性肝炎是1969年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島地區(qū)。1999年，蘇敬良等和黃安國等在北京和廣

3、西等地在313日齡疑似鴨肝炎的北京鴨和櫻桃谷鴨上分離到兩株與I型和III型DHV無血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的DHV，認(rèn)為出現(xiàn)了新的血清型，并將其命名為新型鴨肝炎病毒。新型鴨病毒性肝炎的基因組與I型結(jié)構(gòu)相似，但比I型DHV基因組稍大。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)高變區(qū)主要存在于VP1和VP3基因、在VP1,VP3基因上存在多個(gè)T細(xì)胞抗原表位和B細(xì)胞抗原表位，VP1基因的變異致使不同血清型DHV抗原性發(fā)生改變。1.2 DHV的生物學(xué)特征 2006年Kim M C報(bào)道了I型DHV的全基因組序列，2007年Tseng C H報(bào)道了DHV-1型變異株全基因組序列，為DHV的研究做出了新的突破。DHV與其他小RNA病毒相比，DH

4、V基因組具有一些特殊的結(jié)構(gòu)特征,TsengC H等建議將I型DHV歸為小RNA病毒科一個(gè)新的獨(dú)立的屬。T.Yun等構(gòu)建出了具有感染性的DHV全長cDNA克隆，為進(jìn)一步揭示DHV基因組的結(jié)構(gòu)和功能及防控該病提供了良好的技術(shù)平臺。I型DHV基因組大小約為7,690nt,編碼2,249aa、具有一個(gè)較大的開放閱讀框(ORF)，在基因組RNA兩端各有一段保守的非編碼區(qū),I型DHV全基因組結(jié)構(gòu)依次為:5UTR(626nt)-VPO-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3UTR (314nt),5UTR內(nèi)含有病毒翻譯起始所必需的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) I型DHV的I

5、RES己報(bào)道具有8個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3UTR內(nèi)含有病毒RNA復(fù)制和翻譯有關(guān)的poly(A)尾。I型DHV的3UTR為314 nt，新型DHV的3UTR為366 nt，均具有典型的小RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)、,I型DHV多聚蛋白具有11個(gè)切割位點(diǎn)，且具有與小RNA病毒相似的切割位點(diǎn)和保守基因序列?；蚪M編碼區(qū)包含結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，分為3種初級前體分子P1,P2,P3,其中，P1前體蛋白裂解為組成病毒衣殼蛋白VP0,VP3和VP1，3種結(jié)構(gòu)蛋白。P2和P3構(gòu)成病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。P2編碼2A1,2A2,2A3,2B和2C 3種非結(jié)構(gòu)蛋白，P3編碼3A,3B,3C和3D 4種非結(jié)構(gòu)蛋白。2.1 非編碼區(qū)

6、I型DHV基因組5UTR長626 nt ,內(nèi)含病毒翻譯起始所必需的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。在各病毒屬不同血清型之間，小RNA病毒IRES元件的序列和二級結(jié)構(gòu)具有保守性，是病毒存活所必需的。小RNA病毒的IRES分為3個(gè)型，I型IRES的病毒包括腸道病毒屬和鼻病毒屬，心臟病毒屬、口瘡病毒屬，雙?？虏《緦俚腎RES屬于II型IRES;甲肝病毒屬的IRES屬于III型IRES。通過對I型DHV的RNA級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，I型DHV的5UTR可能含有II型IRES的頸環(huán)結(jié)構(gòu)而沒有I型的三葉草結(jié)構(gòu)， 據(jù)此推斷I型DHV的5UTR區(qū)域會(huì)形成II型的IRES I型DHV的3UTR長為314-317nt，

7、新型DHV長366nt，這在小RNA病毒基因組中是最長的。有學(xué)者報(bào)道,I型DHV的3UTR形成了5個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，參與病毒的復(fù)制，但它是否與宿主特異性有關(guān)還需進(jìn)一步研究。病毒的3端poly(A)尾作為病毒RNA的負(fù)鏈合成起始位點(diǎn)，其長度與負(fù)鏈RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有關(guān)。2.2 編碼區(qū) DHV包含一個(gè)大的ORF，編碼一個(gè)多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，從而分解成P1、P2和P3產(chǎn)物，P1、P2和P3又進(jìn)一步分別分解為VP0 -VP3 -VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D、I型DHV的多聚蛋白的切割位點(diǎn)預(yù)測的結(jié)果是:VP0/VP3和3C

8、/3D的切割位點(diǎn)為：Q/G;2A3/2B,2B/2C ,2C/3A,3A/ 3B以及3B/ 3C的切割位點(diǎn)為Q/S；VP3/VP1的切割位點(diǎn)為Q/M。多聚蛋白水解產(chǎn)生的多膚數(shù)量主要由以下因素決定: (1)基因組是否存在L蛋白。 (2)VP0是否水解為VP4和VP2。 (3)2A蛋白的數(shù)量。其也是小RNA病毒的基因組在 不同的種屬之間存在的差異所在。 小RNA病毒的基因組在不同的種屬間雖然存在差異，但是在病毒復(fù)制過程中具有相似的功能、,L蛋白作為前導(dǎo)蛋白;2A是蛋白酶，參與多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成關(guān)閉;2B蛋白作為宿主范圍的決定因子;2C蛋白是小RNA病毒中的保守序列，與病毒RNA合成相

9、關(guān);3A蛋白與病毒毒力有關(guān);3B蛋白即VPg，是共價(jià)結(jié)合于正鏈和負(fù)鏈RNA 5末端的蛋白引物;3C蛋白構(gòu)成大部分多聚蛋白，3C蛋白在病毒加工處理過程和RNA復(fù)制中產(chǎn)生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一個(gè)半胱氨酸作為親核作用的活性位點(diǎn).3D蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶。 2.2.1結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白: P1區(qū)編碼病毒的殼體蛋白，包括VP0,VP3,VP1基因，核苷酸序列全長2193 nt、 I型DHV VP0的N末端缺少GxxxS/T基因序列，因此其N末端可能未被十四烷基化，VP0不被蛋白酶切割為VP2和VP4。試驗(yàn)證明，殼體蛋白含有多個(gè)類似于其他小RNA病毒的核心結(jié)構(gòu)，即八鏈反向平行桶結(jié)構(gòu)，與

10、其相連的環(huán)形結(jié)構(gòu)位于殼粒表面，這在免疫學(xué)中占有重要作用。I型DHV的VP3與人腸道病毒(Humanparechovirus, HPeV)一樣，N一末端有一段殘基豐富區(qū)延伸出來，長度約20aa,這段區(qū)域在HPeV中具有很強(qiáng)的免疫原性但它在I型DHV是否也具有同樣的功能還未見報(bào)道。(1)VPl基因基因: 小RNA病毒中VP1蛋白作為主要的宿主保護(hù)蛋白，具有特異性抗原中和位點(diǎn)，VP1蛋白多暴露于病毒表面，是決定病毒抗原性的主要成分，它能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。I型DHV與其他小RNA病毒之間衣殼蛋白的氨基酸序列差異主要存在于VP1的兩端。何內(nèi)婭通過對華南地區(qū)分離到的I型和新型DHV的VP1氨基酸序列

11、比對分析表明:VP1包括了大部分的插入與缺失片段和高變異區(qū)，高變區(qū)主要分布在46 -64,95-149,180-223位，尤其是C末端，存在點(diǎn)突變或連續(xù)變異。在第145-146位，15株新型DHV毒株比3株I型DHV多2個(gè)氨基酸(G和G)。I型DHV和新型DHV的VP1蛋白不存在小RNA病毒科保守的RG D基序(Arg-Gly-Asp(RGD) ,而I型DHV相應(yīng)序列為SGD，而新型DHV為QSD，這表明DHV的病毒吸機(jī)制和復(fù)制能力存在差異還有待于進(jìn)一研究。(2)VP3基因基因: VP3蛋白的N末端具有免疫原性，VP3的N端以及連接鏈的環(huán)，特別是B-C,E-F及G-H環(huán)的序列差異顯著、何內(nèi)婭通

12、過對華南地區(qū)分離到的I型和新型DHV與參考毒株進(jìn)行VP3基因的變異分析，結(jié)果顯示，I型DHV和新型DHV的VP3基因不同點(diǎn)在于:第三位I型(R) 新型(K)，第15位I型(N) 新型(S)(除了臺灣新型)，第20位I型(P)新型(S)，第22位I型(V) 新型(I)，第39,40位I型(IA) 新型(VT)，第45、69位I型(T,I) 新型(A/V , V)，第78位第107位為I型和新型DHV變異最多處，第125,126位I型(MT) 新型(LL)，第143到第234位I型和新型DHV存在不連續(xù)的多位點(diǎn)不同，這些變異區(qū)是否影響I型和新型DHV的致病機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。 2.2.2非結(jié)構(gòu)蛋

13、白非結(jié)構(gòu)蛋白: (1)P2非結(jié)構(gòu)蛋白: 小RNA病毒中，P2區(qū)長2271nt,I型DHV推測具有多達(dá)3種不同的2A蛋白，分別是2A1 ,2A2和2A3以及2B,2C。DHV的2A2蛋白是小RNA病毒多聚蛋白中的1個(gè)新蛋白，由161aa組成，可能參與病毒與宿主細(xì)胞之間相互作用，推測與病毒復(fù)制有關(guān)。2A3蛋白由124aa組成，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域。2A3蛋白可能在控制細(xì)胞生長方面起作用，目前關(guān)于小RNA病毒2B和2C蛋白的具體功能還不清楚。(2)P3非結(jié)構(gòu)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白: P3區(qū)編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是3A ,3B ,3C和3D。據(jù)報(bào)道，小RNA病毒科的病毒,3A蛋白與病毒毒力有關(guān)。3BVPg蛋白包含

14、34個(gè)as，這在小RNA病毒中是最大的3B蛋白，并且與其他小RNA病毒的3B蛋白序列一致性很低，DHV的L(亮氨酸)被小RNA病毒KP基序中的K(賴氨酸)所取代，但是該蛋白第3位酪氨酸Tyr (Y)殘基卻很保守，它在VPg與基因組5末端尿嘧啶的附著過程中起重要作用。DHV的3C蛋白酶是催化裂解小RNA病毒多聚蛋白中非結(jié)構(gòu)蛋白部分的關(guān)鍵酶，具有絲氨酸蛋白酶和半膚氨酸蛋白酶雙重特性，病毒編碼的3C蛋白酶完成多聚蛋白的大多數(shù)切割，通常發(fā)生在谷氨酞胺和甘氨酸之間的膚鍵( Gln-Gly ) ,最終產(chǎn)生11個(gè)終末產(chǎn)物。DHV的3D蛋白是依賴RNA的RNA聚合酶( RNA-dependent RNA po

15、lymerase),3D蛋白在病毒RNA復(fù)制中起主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及復(fù)制作用。2.新型鴨病毒性肝炎病毒巢式新型鴨病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR檢檢測方法的建立及應(yīng)用測方法的建立及應(yīng)用 近年來，DVH在世界各地不斷發(fā)生，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，養(yǎng)鴨比較集中的地區(qū)均遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的威脅，由于新型鴨病毒性肝炎病毒(N-DHV)的存在，許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)I型鴨病毒性肝炎病毒(DHV- I)免疫鴨群暴發(fā)鴨肝炎的報(bào)道，嚴(yán)重制約了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，不少學(xué)者己從發(fā)病鴨群中分離到工型鴨肝炎病毒的變異株(新型毒株,N-DHV),2007年，有學(xué)者先后證實(shí)新型DHV也具有典型的DHV I基因組結(jié)構(gòu)，但其與DHV

16、-I在序列上存在顯著差異，且新型DHV均不與DHV- I產(chǎn)生交叉反應(yīng)。因此，加強(qiáng)N-DHV病原診斷技術(shù)的研究對預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)選取新型DHV與傳統(tǒng)工型DHV差異序列區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了N-DHV檢測的逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR方法，旨在為新型鴨病毒性肝炎的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的分子生物學(xué)檢測方法。2.1 材料和方法材料和方法 2. 1.1 病毒病毒 N-DHV、DHV-、鴨病毒性腸炎病毒(DEV)、鴨細(xì)小病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV )、傳染性法氏囊病毒(IBDV)均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。 2.1.2主要試劑主要試劑 Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、

17、Ribonuclease Inhibitor購自生工生物工程(上海)有限公司;Ex Taq酶、pMD18-T克隆載體及其他限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。 2.1.32.1.3引物的設(shè)計(jì)與合成引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)己發(fā)表的N-DHV基因組序列，選取N-DHV與DHV- I差異序列區(qū)設(shè)計(jì)引物，利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)合成了2對引物，引物序列如下: 第1輪擴(kuò)增引物: 上游引物:ygpl 5-TUTUCCTUAUAAUCUUUATA-3; 下游引物:ygp2 5-CCUAAAUTUUAUATTAUUTG3; 第2輪擴(kuò)增引物:

18、上游引物:ygp3 5-CAUCCACAUCCAUCUACAACr3; 下游引物:ygp4 5-TTUCTCTUCUUTATCCTUCC-3。 2.1.42.1.4病毒基因組病毒基因組RNARNA的提取的提取 按Trizol試劑使用說明提取N-DHV基因組RNA，并提取其他幾種病毒的DNA或RNA。 2.1.5 RT-PCR2.1.5 RT-PCR反應(yīng)反應(yīng) 2.1.5.1反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按20L,體系操作，反轉(zhuǎn)錄條件為42作用60 min后，95 5 min滅活反應(yīng)。 2.1.5.2 PCR反應(yīng)最適模板用量的確立 分別以2,4,6,8,10,12L反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，保持其他試

19、劑濃度及反應(yīng)條件不變，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳模板用量。 2.1.5.3 PCR反應(yīng)最適引物用量的確立 在50L PCR反應(yīng)體系中分別加入不同用量的引物，上下游引物(20 mol/L)分別入0.1,0.3,0.5, 0.7, 1,1.2L對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物用量。 2.1.5.4 PCR反應(yīng)最適退火溫度的確立 PCR反應(yīng)的退火溫度分別取 50, 52, 54, 56, 58，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。 2.1.5.5第1輪PLR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)按50L體系進(jìn)行，根據(jù)本試驗(yàn)確定的最適模板用量為10L，最適引物用量為0. 5

20、L，最適退火溫度為54，確定PCR反應(yīng)體系為:0. 5L Ex Taq(5 U/L)、5 L 10 X Ex Taq Buffer 5L dNTP(2. 5mmol/L）、上下游引物ygp1、ygp2（20mo1/L)各0. 5、10L cDNA，加水至50L。PCR反應(yīng)條件為:944 min;94 45s、54 45s、，72 60s、30個(gè)循環(huán);72 10 min。 2.1.5.6第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)按50L ，體系進(jìn)行，模板為第1輪PCR產(chǎn)物1L，最適引物用量為0. 5L，最適退火溫度為5 4，確定PCR反應(yīng)體系為:0. 5 LEx Taq(5 U/pL)、5 L 10XEx

21、 Taq Buffer 5LdNTP (2. 5 mmol/L)、上下游引物ygp3、ygp4 (20 mol/L)各0. 5L，加水至50L。PCR反應(yīng)條件同2.1.5.5 2.62.6擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定 首先取擴(kuò)增產(chǎn)物5L在10 g/L二的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于4過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)12 h后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，利用EcoR/Hind雙酶切鑒定，陽性的克隆送生工公司進(jìn)行測序鑒定。將測序結(jié)果與N-D H V毒

22、株序列進(jìn)行同源性比較。 2.7 PCR2.7 PCR特異性試驗(yàn)特異性試驗(yàn) 分別提取N-DHV、DHV- ,NDV,IBDV、健康鴨肝組織的RNA, DEV、DPV的DNA，用己建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。 2.8 PCR2.8 PCR敏感性試驗(yàn)敏感性試驗(yàn) N-DHV標(biāo)準(zhǔn)毒株提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當(dāng)于含有10、1、0.1 L、10、1、0. 1、0.01pg RNA的含量，分別進(jìn)行RT-PCR檢測，確定其敏感性。在第2輪PCR中，利用上而不同的病毒RNA濃度進(jìn)行的RT-PL R產(chǎn)物1 L為模板，進(jìn)行巢式PCR檢測，反應(yīng)程序不變，確定巢式PCR的敏感性。 2

23、.9 PCR2.9 PCR重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的巢式RT-PCR檢測方法，對N-DHV 、DHV- I 、NDV、IBDV、DEV、 DPV、健康鴨肝組織及檢測為新型鴨病毒性肝炎陽性病料3份和陰性病料3份，重復(fù)檢測3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 2. 10初步應(yīng)用臨床樣品檢測 取疑似送檢病料21份，利用建立的RT-PCR檢測方法進(jìn)行檢測，對擴(kuò)增產(chǎn)物全部進(jìn)行測序鑒定，并利用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定 3.1.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過10g/L二瓊脂糖凝膠電泳，第1,2輪擴(kuò)增產(chǎn)物在位于706、502 bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶，

24、與預(yù)期大小相符。 M：DL2000 DNA Markcr1 、4： 是2對引物的空白對照2：第1輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3：第2輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物 3.1.2克隆載體的酶切鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，根據(jù)病毒基因組的序列結(jié)構(gòu)，利用EcoR和Hind進(jìn)行雙酶切鑒定。M：DL200CDNA Markcr1 , 2：第1,2輪擴(kuò)增產(chǎn)物重組質(zhì)粒的 EcoR和Hind的雙酶切產(chǎn)物 3. 1. 3擴(kuò)增產(chǎn)物的測序鑒定 挑取雙酶切鑒定正確的陽性菌液送生工公司測序。DNA測序結(jié)果表明，插入到T載體的基因片段的核普酸序列為N-DHV。 3.2特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用設(shè)計(jì)的第1輪引物對N-DHV擴(kuò)增出了70

25、6 bp的目的基因片段，而DHV-、NDV , IBDV、健康鴨肝組織、DEV,DPV均未擴(kuò)增出目的片段(圖3)。取PCR產(chǎn)物各1 L為模板，利用第2輪引物進(jìn)行巢式PCR檢測，結(jié)果N-D H V出現(xiàn)502bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而D H V-、NDV、IBDV、健康鴨肝組織、DEVDPV均未擴(kuò)增出目的片段(圖4)。第1輪擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)M：DL2000 DNAMarKer1: N-DHV2: DHV-3: NDV4: IBDV5: 健康鴨的肝組織6. DEV7. DPV（圖3）第2輪擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)M.:DL2000 DNAMarker1:N-DHV;2:DHV-;3: NDV4: IBDV5.健康鴨

26、肝組織6. DEV7. DPV（圖4） 3.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果 2種引物敏感性試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物取5L經(jīng)10 g/L二瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約706 ,502 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與各自的預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出第1輪引物的RT-PCR檢測靈敏度可以達(dá)到10 pg RNA，而第2輪引物的RT-PCR檢測靈敏度可以達(dá)到0. 1 p RNA。第1輪擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)M：DL2000 DNAMarKer17： 10、1,0.1L、10、1、0. 1、0. 01pg RNA第2輪擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)M：DL2000 DNAMarKer17： 10、1,0.1L、10、1、0. 1、0. 01pg

27、 RNA 3.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定可靠的。 3.5臨床樣品檢測結(jié)果 用建立的N-DHV巢式RT-PCR檢測方法，共檢測了21份在不同地采集的鴨病料。檢出陽性樣品3份，對陽性樣品PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行克隆與序列分析，結(jié)果均為N-DHV。4. 討論討論 由于N-DHV在自然條件下感染成年鴨后，感染者可長期帶毒和排毒而不出現(xiàn)臨床癥狀，在這些情況下，病鴨組織中病毒含量較低，而且組織樣品中因含有大量的蛋白和脂類等可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增很難見到擴(kuò)增片段。巢氏PCR(nested PCR)是PCR的一種改良模式，是指利用2對PLR引物進(jìn)

28、行2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。首先對靶DNA進(jìn)行第1步擴(kuò)增，然后從第1次反應(yīng)產(chǎn)物中取出少量作為反應(yīng)模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，第2次PCR引物與第1次反應(yīng)產(chǎn)物的序列互補(bǔ)，第2次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物。 由于巢式PCR反應(yīng)有2次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，增加了檢測的敏感性;又有2對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。巢式RT-PCR技術(shù)通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR和巢式PCR的2次擴(kuò)增，首次反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移有助于稀釋掉那些最初可能存在于樣品中的抑制物，大大提高了檢測的靈敏度，避免了樣品檢測過程中的假陰性問題。巢式RT-PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速高效等特點(diǎn)，為鴨病毒型肝炎

29、的早期診斷提供了新的模式。 本試驗(yàn)參考UenBank中己發(fā)表DHV-I和幾株N-DHV的基因組序列，經(jīng)過多重序列 比對分析。選取DHV- I與N-DHV序列變化差異明顯區(qū)設(shè)計(jì)合成2對新型鴨病毒性肝炎的特異性引物，建立了N-DHV檢測的巢式RT-PCR檢測方法， 該方法只對N-DHV能夠特異性地?cái)U(kuò)增出706 bp和502 bp的目的片段，而對NDV、IBDV、DEV、DPV的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性，該方法第1次擴(kuò)增的敏感性為10 pg，第2次擴(kuò)增的敏感性達(dá)到0. 1Pg，敏感性提高了100倍，具有良好的敏感性。在21份臨床樣品的檢測過程中，利用第1輪RT-PCR檢測出陽性樣品2份，而

30、利用巢式RT-PLR檢測時(shí)可以檢出陽性樣品3份，將所有陽性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序后，序列分析結(jié)果顯示均是N-D H V，說明建立的巢式RT-PLR檢測方法更為敏感、特異，可以用于原始病料中N-DHV的快速低含量檢測，顯示出了良好的應(yīng)用前景。因此，本研究建立的巢式RT-PCR方法將為國內(nèi)新型鴨病毒性肝炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡單快速的分子生物學(xué)診斷方法。鴨鴨 病病 毒毒 性性 肝肝 炎炎 與與 鴨鴨 瘟瘟 鴨病毒性肝炎是引起雛鴨傳播迅速和高度致死的傳染病，病原為鴨肝炎病毒。鴨病毒性肝炎有 3 種血清型，在我國流行的主要為 I 型。一般多發(fā)于15周齡的雛鴨, 對成年鴨沒有影響。對氯仿、乙

31、醚、胰蛋白酶和pH值3的環(huán)境均有抵抗力。在 56加熱60分鐘仍可存活，但加熱至62，30分鐘即被滅活。病毒在1%福爾馬林或 2%氫氧化鈉中2小時(shí)、在 2%漂白粉溶液中3小時(shí)、 0.2%福爾馬林37，30分鐘均可使病毒滅活。 鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的急性、高度死亡率的傳染病，又稱為鴨病毒性腸炎，俗稱 “大頭瘟”鴨瘟病毒是皰疹病毒， 病毒粒子呈球形。病毒對外界抵抗力不強(qiáng)。病毒對乙醚和氯仿敏感。病毒在pH值7 9時(shí)，經(jīng)6小時(shí)不減低毒力，在pH值3和11時(shí)，病毒迅速滅活。各種年齡和品種的鴨均可感染，但鴨瘟流行時(shí)，成年鴨發(fā)病和死亡較嚴(yán)重，1月齡以下的雛鴨發(fā)病較少。本病于全年各季均可發(fā)生， 但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通過消化道傳播，也可通過交配、眼結(jié)膜和呼吸道而傳播。 鴨病毒性肝炎臨床上主要表現(xiàn)為雛鴨突然發(fā)病，身體側(cè)翻仰臥，頭向后背雙腳痙攣后蹬，角弓反張。主要病變在肝臟，肝臟腫大，質(zhì)脆，色暗或發(fā)黃，肝臟表面有大小不等