《分子生物學(xué)論文》doc版

1、分子生物學(xué)論文doc版分子生物學(xué)論文doc版分子生物學(xué)論文基因治療 與基因診斷的研究與發(fā)展摘要：基因診斷與基因治療能夠在比較短的時間從理論設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實，主要是由于分子生物學(xué)的理論及技術(shù)方法，特別是重 組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，使人們可以在實驗室構(gòu)建各種載 體、克隆及分析目標(biāo)基因。所以對疾病能夠深入至分子水平的研究，并已取得了重大 的進展。因此在20世紀(jì)70年代末誕生了基因診斷(gene diagnosis); 隨后于1990年美國實施了第一個基因治療 (gene therapy)的 臨床試驗方案?？梢?，基因診斷和基因治療是現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技 術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合的范例。關(guān)鍵詞：基因治療 基因診斷

2、 重組DNA 1 .引言20世紀(jì)后半葉以來， 由于分子生物學(xué)的崛起，人們進入了合成代謝與代謝調(diào)節(jié)的 研究。這一階段，細(xì)胞內(nèi)兩類重要的生物大分子-蛋白質(zhì)與核酸，成為研究焦點。20世紀(jì)50年代初期發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的a螺旋的二級結(jié)構(gòu)形式；更具里程碑意義的是 1953年提由的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模 型，為揭示遺傳信息傳遞規(guī)律奠定了基礎(chǔ)，是生物化學(xué)發(fā)展 進入分子生物學(xué)時期的重要標(biāo)志。20世紀(jì)70年代，重組DNA技術(shù)的建立不僅促進了對基 因表達調(diào)控機制的研究，使基因操作無所不能，而且使人們 主動改造生物體成為可能?；蛟\斷和基因治療也是重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的重要方面。隨著對各種疑難疾病的深入研究，和分子生

3、物學(xué)日新月 異的發(fā)展，傳統(tǒng)的診斷治療手段無法解決的一些重要問題。通過對生物體在分子水平上的研究，基因診斷與治療的作 用逐漸顯露由來，尤其是許多遺傳疾病。傳統(tǒng)對疾病的診斷主要是以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，如 患者的癥狀、血尿各項指標(biāo)的變化，或物理檢查的異常結(jié)果， 然而表型的改變在許多情況下不是特異的，而且是在疾病發(fā) 生的一定時間后才由現(xiàn)，因此常不能及時作曲明確的診斷。現(xiàn)知各種表型的改變是由基因異常造成的，也就是說基因 的改變是引起疾病的根本原因。基因診斷是指采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來分析受檢者 的莫一特定基因的結(jié)構(gòu)（DNA水平）或功能（RNA水平） 是否異常，以此來對相應(yīng)的疾病進行診斷。基因診斷有時

4、也稱為分子診斷或DNA診斷（DNAdiagnosis）?；蛟\斷是病因的診斷，既特異又靈敏，可以揭示尚未由 現(xiàn)癥狀時與疾病相關(guān)的基因狀態(tài)，從而可以對表型正常的攜 帶者及莫種疾病的易感者作由診斷和預(yù)測，特別對確定有遺 傳疾病家族史的個體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶致病基因的檢 測具有指導(dǎo)意義。2.基因診斷的原理與方法2.1基因診斷的原理 疾病的發(fā)生不僅與基因結(jié)構(gòu)的變異有關(guān)，而且與其表達功能異常有 關(guān)。基因診斷的基本原理就是檢測相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達 功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常。由于DNA的突變、缺失、插入、倒位和基因融合等均可 造成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)變異，因此，可以直接檢測上述的變化或 利用連鎖方法進行分析

5、，這就是DNA診斷。對表達產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量變化的分析為RNA診斷(RNAdiagnosis)。2.2基因診斷的方法 基因診斷是以核酸分子雜交 (nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 為核心發(fā)展起來的多種方法，同時配合 DNA序列分析，近 年新興的基因芯片可能會發(fā)展成為一種很有用的基因診斷 方法。DNA診斷 常用檢測致病基因結(jié)構(gòu)異常的方法有下列幾 種。斑點雜交: 根據(jù)待測DNA樣本與標(biāo)記的 DNA探針雜交的圖譜，可以 判斷目標(biāo)基因或相關(guān)的 DNA片段是否存在，根據(jù)雜交點的 強度可以了解待測基因的數(shù)量。等位基因特異的寡核昔酸探針(al

6、lele-specific oligonucleotide probe, ASO probe ) 雜交：是一種檢測基因點突變的方法，根據(jù)點突變位點上下游核昔酸序列，人工合成約 19個核甘酸長度的片段，突變的堿基 位于當(dāng)中，經(jīng)放射性核素或地高辛標(biāo)記后可作為探針，在嚴(yán) 格雜交條件下，只有該點突變的DNA樣本，才由現(xiàn)雜交點，即使只有一個堿基不配對，也不可能形成雜交點。一般尚合成正?；蛲恍蛄校淮笮〉墓押宋羲崞?作為正常探針。如果受檢的 DNA樣本只能與突變 ASO探針，不與正常 ASO探針雜交，說明受檢二條染色體上的基因都發(fā)生這種突 變，為突變純合子；如果既能與突變ASO探針又能與正常ASO

7、探針雜交，說明一條染色體上的基因發(fā)生突變，另一條染色體上為正常基因，為這種突變基因的雜合子；如果只能 與正常ASO探針雜交，不能與突變 ASO雜交，說明受檢者 不存在該種突變基因，如圖21-1所示。若與PCR方法聯(lián)合應(yīng)用，即 PCR/ASO探針雜交法 (PCR/ASO probe hybridization),是一種檢測基因點突變的簡便方法，先用PCR方法擴增突變點上下游的序列，擴增產(chǎn)物 再與ASO探針雜交，可明確診斷突變的純合子和雜合子。此法對一些已知突變類型的遺傳病，如地中海貧血、苯丙 酮尿癥等純合子和雜合子的診斷很方便。也可分析癌基因如 H-ras和抑癌基因如p53的點突變。單 鏈構(gòu)象

8、多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism, SSCP )分析相同長度的單鏈 DNA因其序列不 同，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)象不盡相同，在非變性 聚丙烯酰胺凝膠電泳時速度就不同，若單鏈DNA用放射性核素標(biāo)記，顯影后即可區(qū)分電泳條帶。一般先設(shè)計引物對突變點所在外顯子進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性成單鏈后進行電泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、靈敏、有效地檢測 DNA突變點， 如圖21-2,此法可用檢測點突變的遺傳疾病， 如苯丙酮尿癥、 血友病等，以及點突變的癌基因和抑癌基因。限制性內(nèi)切酶圖譜 (restriction map)分析，如果DNA 突

9、變后改變了莫一核酸限制性內(nèi)切酶的識別位點，使原來奧 一識別位點消失，或形成了新的識別位點，那么相應(yīng)限制性 內(nèi)切酶片段的長度和數(shù)目會發(fā)生改變。21-3一般基因組 DNA經(jīng)該種限制性內(nèi)切酶水解， 再做Southern 印跡，根據(jù)雜交片段的圖譜，可診斷該點突變，如圖所示。如果用PCR擴增該突變點的外顯子，PCR產(chǎn)物經(jīng)該種酶消化后，進行瓊脂糖電泳，澳乙錠染色后可直接觀察片段的 大小及數(shù)目。此法可用于檢測有些限制性內(nèi)切酶識別位點消失的遺傳 疾病，如鐮狀細(xì)胞貧血?；蚧蛉笔У募膊∪鏰地中海貧血癥，單純性生長激素缺乏癥等。限制性片段長度多態(tài)性( restriction fragment length pol

10、ymorphism ,RFLP )遺傳連鎖分析人群中個體間 DNA的序 列存在差異，據(jù)估計每 100-200個核昔酸中便有1個發(fā)生突 變，這種現(xiàn)象稱為 DNA多態(tài)性。有些DNA多態(tài)性可改變更一限制性內(nèi)切酶的識別位點， 因而產(chǎn)生了 DNA限制性片段長度多態(tài)性。RFLP按孟德爾方式遺傳，在莫一特定的家庭中，如果莫 一致病基因與特定的多態(tài)性片段連鎖，可以遺傳給子代，因 此這一多態(tài)性片段可作為遺傳標(biāo)記，來判斷該家庭成員或胎 兒的基因組中是否攜帶該致病基因，見圖21-4,此法可用于診斷甲型血友病、苯丙酮尿癥、享延頓舞蹈病等。DNA序列分析對致病有關(guān)的DNA片段進行序列測定，是診斷基因異常(已知和未知)最

11、直接和準(zhǔn)確的方法。RNA診斷RNA診斷主要是分析基因的表達功能，檢測轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)和量，以判斷基因轉(zhuǎn)錄效率的高低，以及轉(zhuǎn)錄物的大小。RNA印跡(Northern blot) RNA印跡是檢測基因是否 表達，表達產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的 強度，可以判斷基因表達的效率。RT-PCR是一種檢測基因表達產(chǎn)物 mRNA靈敏的方法， 若與熒光定量 PCR結(jié)合可對RT-PCR產(chǎn)物量進行準(zhǔn)確測定。3.基因診斷的應(yīng)用 3.1遺傳病的預(yù)防 產(chǎn)前診斷產(chǎn)前 診斷可以通過胎兒組織活檢、羊膜腔穿刺、羊膜絨毛樣品及 母體血液循環(huán)中的胎兒細(xì)胞進行?？梢赃M行染色體組型分析，發(fā)現(xiàn)染色體異常，但利用PCR技術(shù)結(jié)合D

12、NA診斷學(xué)方法分析特異基因缺陷更宜推廣。攜帶者測試基因 測試常用于檢由隱性遺傳病攜帶者， 包括遺傳病受累個體家庭的其他成員和有特殊遺傳病死亡 家庭中的危險人群。例如對3個缺失型和1個非缺失型D uchenne假 肥大肌營養(yǎng)不良家系缺失DNA片段P CR定量分析和S RRPCR連鎖分析，對4個家系1 7名成員(患兒5名、 女性親屬7名、男性親屬5名)進行了基因檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 4名女性為致病基因攜帶者，肯定了 7名 女性為非攜帶者，為這些家系提供了可靠的遺傳信息。以上檢測方法簡便易行，利于在臨床實驗室中開展。癥狀前診斷 對于莫些單基因紊亂所引起的綜合征，僅 至晚年才會有明顯表現(xiàn)，例如肝豆?fàn)詈?/p>

13、變性的癥狀前診斷及 干預(yù)治療，應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記對4。個肝豆?fàn)詈俗冃?家系進行單體型連鎖分析，在先證者的8 1例無癥狀同胞 中，檢由1 1例癥狀前患者。對其中8例投用硫酸鋅治療，效果良好，在預(yù)防癥狀由現(xiàn) 的同時，提高了血清銅藍蛋白水平。強調(diào)癥狀前診斷及干預(yù)治療的重要性。遺傳病易感性 多基因遺傳病是由多個易感性基因累加 效應(yīng)引起的遺傳性狀，是由多個易感性基因累加效應(yīng)引起的 遺傳性狀，是多個才會有發(fā)病的機會。比如，有LDL受體基因缺陷的個體同時有高膽固醇血癥， 其冠狀動脈患病率要比單純高膽固醇血癥者高。因此，根據(jù)DNA診斷，做好疾病的早期預(yù)防并注意環(huán)境 衛(wèi)生和個人生活方式，可以達到預(yù)防的目的。

14、3.2 感染性疾病過去對感染性疾病(infectious diseases)的 診斷，一是直接分離檢查病原體，或者對患者血清學(xué)或生物 化學(xué)的分析。有些病原體不容易分離，有些需經(jīng)過長期培養(yǎng)才能獲得。血清學(xué)對病原體抗體的檢測雖然很方便，但是病原體感染 人體后需要間隔一段時間后才由現(xiàn)抗體，并且血清學(xué)檢查只 能確定是否接觸過該種病原體，但不能確定是否有現(xiàn)行感 染，對潛伏病原體的檢查有困難。對感染性疾病的基因診斷具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點。80年代建立的PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對病原體的檢測。一般根據(jù)各病原體特異和保守的序列設(shè)計引物，有的還合成ASO探針，對病原體的 DNA可用PCR技術(shù)直接檢查，而對RN

15、A病毒，則采用 RT-PCRo現(xiàn)在市場已經(jīng)有許多種病原體的測定藥盒供應(yīng)，每一盒包 含擴增莫種病原體的特異引物，所需的酶以及配妥的各種反 應(yīng)試劑，并附有可行的操作方法步驟。,病毒性感染：多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測相應(yīng)的病原體，如 甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可薩 奇病毒、脊髓灰質(zhì)類病毒、腺病毒、 EB病毒、皰疹病毒、 人巨細(xì)胞病毒、乳頭狀病毒 等。最近新發(fā)現(xiàn)的SARS冠狀病毒，在基因組（RNA）序列確 定后，便很快建立了 RT-PCR的基因診斷法。細(xì)菌性感染：可應(yīng)用基因診斷檢測多種致病性的細(xì)菌，如結(jié)核分枝桿菌、痢疾性大腸桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、綠膿桿菌 等。寄生蟲：惡

16、性瘧原蟲、克魯斯錐蟲、利什曼原蟲、血吸蟲、弓形蟲 等都有基因診斷的方法其它：如衣原體、支原體、真菌性感染也均用基因診斷。3.3 惡性腫瘤 分析一些原癌基因的點突變、插入突變、基因擴增、染色體易位和抑癌基因的丟失或突變，可以了解 惡性腫瘤的分子機制，有助于對惡性腫瘤的診斷，對腫瘤治 療及預(yù)后有指導(dǎo)意義。4.基因治療4.1基因治療的定義從基因角度可以理解 為對缺陷的基因進行修復(fù)或?qū)⒄Ｓ泄δ艿幕蛑脫Q或增 補缺陷基因的方法。若從治療角度可以廣義地說是一種基于導(dǎo)入遺傳物質(zhì)以 改變患者細(xì)胞的基因表達從而達到治療或預(yù)防疾病的目標(biāo) 的新措施。導(dǎo)入的基因可以是與缺陷基因相對應(yīng)的有功能的同源基因或與缺陷基因無

17、關(guān)的治療基因?；蛑委熡袃煞N形式，一種是改變體細(xì)胞的基因表達，即體細(xì)胞基因治療(somatic gene therapy),另一種是改變生 殖細(xì)胞的基因表達，即種系基因治療(germline gene therapy), 從理論上講，若對缺陷的生殖細(xì)胞進行矯正，不但當(dāng)代可以 得到根治，而且可以將正常的基因傳給子代。但生殖的生物學(xué)極其復(fù)雜，且尚未清楚，一旦發(fā)生差錯將 給人類帶來不可想象的后果，涉及一系列倫理學(xué)的問題，目 前還不能用于人類。在現(xiàn)有的條件下，基因治療僅限于體細(xì)胞，基因型的改變 只限于莫一類體細(xì)胞，其影響只限于莫個體的當(dāng)代。4.2 基因治療的方式基因治療的方式(type of gene

18、 therapy)主要有3類，一類為基因矯正或置換，即對缺陷基 因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復(fù)，或以 正?；蛟恢脫Q異?；?，因此不涉及基因組的任何改 變，目前尚無體內(nèi)成功的報道。另一類為基因增補，不去除異?；?，而是通過外源基因 的導(dǎo)入，使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因的功能。再有一類為基因封閉，有些基因異常過度表達，如癌基因 或病毒基因可導(dǎo)致疾病，可用反義核酸技術(shù)、核酶或誘餌(decoy)轉(zhuǎn)錄因子來封閉或消除這些有害基因的表達。除上述3大類外，近日發(fā)展其它多種形式，如導(dǎo)入病毒或細(xì)菌來源的所謂 自殺基因”或經(jīng)過改造的條件性復(fù)制病毒， 只能在p53缺陷的腫瘤細(xì)胞繁殖以達到溶

19、解腫瘤細(xì)胞。4.3 導(dǎo)入的方式 導(dǎo)入基因有兩種方式，一種是體外導(dǎo)入 (ex vivo ),即在體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，再將這種基因修飾過的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使這種帶有外源基因的細(xì)胞在體內(nèi) 表達，從而達到治療或預(yù)防的目的。被用于修飾的細(xì)胞可以是自體，同種異體或異種的體細(xì) 胞。合適的細(xì)胞應(yīng)易于從體內(nèi)取由和回輸，能在體外增殖，經(jīng) 得起體外實驗操作，能夠高效表達外源基因，且能在體內(nèi)長 期存活。目前常用的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮 膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、角骯細(xì)胞( keratinocyte)、 多種腫瘤細(xì)胞等。另一種是體內(nèi)導(dǎo)入 (in vivo )，即將外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi) 有關(guān)的組

20、織器官，使其進入相應(yīng)的細(xì)胞并進行表達。4.4 基因治療的臨床試驗?zāi)壳芭R床基因治療試驗的方案已達9百多個，受治療的患者已有數(shù)千例表21-3可見當(dāng)前臨床基因治療(gene therapy)或廣義地稱基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)試驗，有三種類型，即治療性、基因標(biāo)記及非治療 性試驗。后者將腺病毒載體注射于健康自愿者的體內(nèi)，觀察機體對 腺病毒載體的反應(yīng)。這些方案的臨床試驗期(trial phases)極大多數(shù)為I期臨 床試驗，田期者僅僅4個方案。說明基因治療臨床試驗尚處于未成熟階段?；驑?biāo)記 目前常用的基因標(biāo)記方法是將含neoR基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，然后回輸至病人體 內(nèi)，可以

21、很方便地跟蹤這種標(biāo)記細(xì)胞的命運，用來研究許多 其他方法不能回答的體細(xì)胞移植的生物學(xué)問題。美國第一個被批準(zhǔn)基因標(biāo)記的臨床研究計劃是NIH的Rosenberg等的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL )基因標(biāo)記實驗。他將惡性黑色素瘤組織或轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)制成單細(xì)胞懸液，在IL-2的作用下淋巴細(xì)胞可成倍增殖而腫瘤細(xì)胞及其他類 型細(xì)胞則死亡。這種TIL能特異殺傷腫瘤細(xì)胞。先在體外將含有neoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL ,該載體能整合至 TIL的基因組，故子代的 TIL也含有neoR基 因，能在含抗生素 G418的培養(yǎng)液中生長，便于篩選；也可 用PC

22、R檢測neoR基因是否存在，以跟蹤回輸體內(nèi)的TIL的去處。將這種基因修飾過的 TIL注射于黑色素瘤患者，可以研 究TIL在體內(nèi)各組織器官、血循環(huán)細(xì)胞、淋巴結(jié)、腫瘤組織 的分布情況；特別感興趣的是觀察 TIL是否能靶向腫瘤組織； 同時也可以研究 TIL在體內(nèi)存活期的長短；以及了解這種體 外基因修飾過的TIL是否會自主生長和惡變？注射后對人體 是否有害？這些問題的闡明可為基因治療打基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因修飾過的 TIL在體外不會自主增殖，說明沒 有惡變。在注射后的頭3周，用PCR可測由外周血存在著含有neoR基因的單核細(xì)胞，有的長至60d尚可測由。在注射后3d活檢的腫瘤組織也可測由有基因修飾過的TIL

23、的存在。有人對其他細(xì)胞如骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞等 進行標(biāo)記研究。單基因疾病 遺傳性單基因疾病 （monogenic disease或 是 基因治療的理想侯選對象，設(shè)計治療方案時應(yīng)考慮下列幾點 因素：對造成該疾病有關(guān)的基因應(yīng)有較詳細(xì)的了解，并能在實驗室克隆適合真核細(xì)胞表達的有關(guān)基因的cDNA序列，供轉(zhuǎn)導(dǎo)用。經(jīng)有功能基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體細(xì)胞，只要產(chǎn)生較少量原來缺少 的基因產(chǎn)物就能矯正疾病。例如腺昔脫氨酶（ADA ）缺乏的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）, 由于淋巴細(xì)胞缺乏 ADA酶，造成腺昔及dATP的堆積，可破 壞免疫功能，患兒很少活至成年。若淋巴細(xì)胞 ADA恢復(fù)至正常水平的 5%10%即能維持免

24、 疫系統(tǒng)的功能，對病人癥狀就有改善，這是第一個基因臨床 治療的方案。血友病B,是由于凝血因子IX缺乏所致。現(xiàn)知只要因子IX水平達到正常的10%20%就能緩解嚴(yán)重的血友病。對血友病A而言，只要因子皿達正常水平的5%就能緩解癥狀，血友病已開始基因治療臨床試驗。即使導(dǎo)入基因過度表達，對機體應(yīng)無不良作用。有些遺傳疾病是莫些特殊細(xì)胞基因缺損造成的，但那有 關(guān)的細(xì)胞不易取由供體外基因工程操作用。例如Parkinson癥是腦黑質(zhì)細(xì)胞(substantia nigra)的酪氨 酸羥化酶缺乏，不能產(chǎn)生多巴胺(dopamine),給病人注射多 巴胺可減輕癥狀。動物模型試驗表明，將酪胺酸羥化酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成纖維細(xì) 胞，

25、再移植至腦內(nèi)，可以減輕動物模型的異常行為?，F(xiàn)在采用的以正常有功能的同源基因來增補體內(nèi)的缺 乏基因，因此要求增補的基因在病人壽命期間能穩(wěn)定表達， 或重復(fù)治療，所以應(yīng)考慮構(gòu)建能長期持續(xù)穩(wěn)定表達外源基因 的載體，并考慮將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞以望 回輸體內(nèi)后其子代細(xì)胞也含有外源基因。目前應(yīng)用基因治療的單基因疾病已有二十多種。惡性腫瘤惡性腫瘤屬復(fù)雜基因疾病(complex geneticdiseases),可能涉及多種基因的異常，發(fā)病過程是多步驟的， 至今雖有不少有關(guān)的基因被鑒定，但腫瘤發(fā)病的分子機制尚 未清楚，因此治療時應(yīng)選擇何種靶基因不明確，多數(shù)是根據(jù) 不同的環(huán)節(jié)，設(shè)計不同的治療策略，目

26、前臨床惡性腫瘤的基 因治療策略有十余種之多。見表21-4。,免疫基因治療(immunogene theray)分體外轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi) 轉(zhuǎn)導(dǎo)二種。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)將一些能刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子基因，如IL-2、IL-12、IFN- 丫等轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞作為基因工程 瘤苗工 給腫瘤患者注射，宗旨為提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，有利于 被機體免疫系統(tǒng)識別及排斥；由于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因的腫瘤 細(xì)胞在體內(nèi)能持續(xù)不斷分泌細(xì)胞因子，能增強抗腫瘤的特異 免疫和非特異免疫反應(yīng)，在腫瘤局部形成一種較強的抗腫瘤 免疫反應(yīng)微環(huán)境，并能通過局部免疫反應(yīng)，引發(fā)全身的抗腫 瘤免疫機能，此策略已應(yīng)用于多種惡性腫瘤的臨床試驗。本實驗室研究了IL-2基因

27、轉(zhuǎn)導(dǎo)的人肝癌和胃癌細(xì)胞瘤苗”，后者已被中國藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床研究。另一種策略是將細(xì)胞因子基因或MHC I類基因直接體內(nèi)注射于腫瘤局部，以促發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。,自殺基因系統(tǒng) 自殺基因(suicide gene)來源于病毒、 細(xì)菌或真菌，例如單純性皰疹病毒的胸昔激酶( thymidine kinase,TK)基因，能將一種對哺乳動物無毒害的喋吟核昔的 類似物甘昔洛韋(gancilovir, GCV)轉(zhuǎn)變成三磷酸形式，后 者可摻入新合成的 DNA鏈，造成DNA鏈的斷裂和抑制 DNA 聚合酶的活性，從而造成細(xì)胞死亡。所以將HSV-tk基因體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，然后再給患者服 用GCV藥物，腫瘤細(xì)胞表達

28、 TK基因能使無毒的 GCV轉(zhuǎn)變 成有毒的三磷酸 GCV,達到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。,抑癌基因(tumor suppressive gene)抑癌基因p53的突變與多種腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系將野生型（正常）的p53轉(zhuǎn)導(dǎo)p53缺陷的惡性腫瘤，使其能 表達正常的p53產(chǎn)物，后者具有強大的抑制腫瘤細(xì)胞生長和 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，從而達到抗腫瘤效果。,裂解腫瘤病毒（oncolytic virus） 利用基因工程改造過 的腺病毒突變體，如 EIB基因缺失的腺病毒能選擇性在p53缺 陷的惡性腫瘤細(xì)胞中進行復(fù)制、繁殖，并最終殺傷腫瘤 細(xì)胞。而正常細(xì)胞能表達p53,使這種病毒不能復(fù)制和繁殖。病毒性感染目前病

29、毒性感染主要治療對象為人免疫缺 陷病毒（HIV）感染的艾滋病，接受基因治療的患者約4百余例。主要有二種治療策略。增強機體的抗 HIV免疫反應(yīng)抑制HIV的復(fù)制 有人 研究利用反義核酸來封閉 HIV的基因，使 mRNA不能翻譯 蛋白質(zhì)，并發(fā)生降解，或制備有關(guān)的核酶來破壞HIV的mRNA ,使HIV不能復(fù)制繁殖，確切的療效尚不能肯定，許 多科學(xué)家尚在研究其他更有效的抑制HIV復(fù)制的方法。心血管疾病 目前心血管疾病中基因治療最多的臨床方 案為外周血管疾病造成的下肢缺血，及心臟冠狀動脈阻塞造 成的心肌缺血。通過轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）或成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）或血小板衍生生長因子（PDGF）等基因