利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)引物

1、利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)引物王少峽1,房蓓2,王虹1(11天津中醫(yī)學(xué)院,天津300193;21天津醫(yī)科大學(xué),天津300074摘要系統(tǒng)介紹利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)引物的各個(gè)步驟:搜尋某基因的所有已發(fā)表序列;對(duì)這些序列進(jìn)行多序列對(duì)比,確定保守區(qū)域;利用專(zhuān)業(yè)軟件設(shè)計(jì)引物;并對(duì)引物進(jìn)行修飾和檢測(cè)等。關(guān)鍵詞生物信息學(xué),引物,多序列對(duì)比中圖分類(lèi)號(hào):R914.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100625687(20040520049203D esign of the pr i m ers with bio i nfor ma tics resourcesW ang Shaox ia1,Fang Bei2,W ang

2、Hong1(1.T ian jin T raditi onal Ch inese M edical Co llege,T ian jin300074;2.T ian jin M edical U n iversity,T ian jin300074 ABSTRACT T h is paper system ically in troduced each step of design ing p ri m ers w ith the b i o info rm atics resou rce:search ing fo r all sequence m em bers of the gene,d

3、o ing m u lti p le sequences alignm en ts,ascertain ing the con servative regi on app rop riately,design ing the p ri m ers w ith the p rofessi onal softw are,em bellish ing and exam in ing the p ri m ers and so on. KEY WOR D S b i o info rm atics,P ri m ers,m u lti p le sequences alignm en ts近年來(lái),生物

4、信息學(xué)的迅速發(fā)展為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)的研究提供了有力的分析工具。生物信息學(xué)在藥物分子設(shè)計(jì)、解密生物芯片技術(shù)所得到的高通量數(shù)據(jù)、病理或藥理的分子生物學(xué)機(jī)制的闡明等諸多研究領(lǐng)域都起到了不可替代的作用1,2。聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(po lym erase chain reacti on, PCR是應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)之一,在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域用于考查疾病的診斷、藥物處理情況下基因表達(dá)的變化、克隆新基因等方面,所設(shè)計(jì)的引物的優(yōu)劣是PCR擴(kuò)增能否成功的關(guān)鍵。生物信息學(xué)也為設(shè)計(jì)引物提供了有力支持。本文系統(tǒng)地論述了利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)引物的各個(gè)步驟,并介紹了在設(shè)計(jì)引物過(guò)程中可能用到的最常見(jiàn)也是最方便的一些免費(fèi)工具

5、和服務(wù)。1搜尋某基因的所有已發(fā)表序列不同的研究人員所用材料的品系或個(gè)體不可能相同,而不同的品系或個(gè)體之間存在著序列多態(tài)性(如單核苷酸多態(tài)性,SN P,在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中也存在著各種誤差(如T aq酶在擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)配、測(cè)序時(shí)的錯(cuò)讀等,所以?xún)H根據(jù)來(lái)源于某一作者的一條基因序列設(shè)計(jì)引物要冒很大的風(fēng)險(xiǎn),必須參考某基因所有已發(fā)表序列。因而搜索感興趣的基因所有已發(fā)表序列是進(jìn)行設(shè)計(jì)引物的第一步。檢索有關(guān)研究基因的最新綜述,從中可能發(fā)現(xiàn)有關(guān)的序列或其在Genbank中的登記號(hào),但一般不可能找到其家族的所有成員序列。另外一種簡(jiǎn)單的方法是利用N CB I開(kāi)發(fā)和維護(hù)的En trez分子檢索系統(tǒng)在序列的注釋中查找關(guān)鍵詞,

6、只需在h ttp: www.ncb i.n l m.n En trez 網(wǎng)頁(yè)中的提問(wèn)框中鍵入關(guān)鍵詞,并在下拉框中選擇搜尋核苷酸序列即可。但由于作者不正規(guī)的縮寫(xiě)及命名的不一致,使得這種方法也帶有很大的局限性。對(duì)于研究模式生物如人、小鼠或大鼠等來(lái)說(shuō),美國(guó)國(guó)立生物信息中心(N CB I提供了一個(gè)方便的工具:U n igene,在h ttp: www.ncb i.n l m.n En trez 網(wǎng)頁(yè)中的提問(wèn)框中鍵入關(guān)鍵詞并在下拉框中選擇U n igene即可查詢(xún),其結(jié)果是非冗余性地包含了來(lái)源于某一物種的某一基因所有序列和相關(guān)的信息,這些序列來(lái)源于不同作者或研究機(jī)構(gòu)。如果所使

7、用的材料是非模式生物,可以用注釋搜索法或從文獻(xiàn)中查到家族的某個(gè)成員,然后根據(jù)這一成員序列使用BLA ST程序(h ttp: www.ncb in l m.n BLA ST ,在整個(gè)GenB ank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之高度同源的序列;再?gòu)乃阉鞯降慕Y(jié)果中選取其中任一條序列,根據(jù)后者再進(jìn)行BLA ST搜索。第二次查詢(xún)的結(jié)果應(yīng)該與第一次查詢(xún)的結(jié)果大部分一致,僅有少部分的不同。最好是將所有該基因的已知序列(包括剛剛查到的都進(jìn)行一次查詢(xún),即采用滾動(dòng)式的查詢(xún)方式,很快便發(fā)現(xiàn)這些查詢(xún)結(jié)果會(huì)穩(wěn)定于一個(gè)范圍,再也找不出新的序列,這個(gè)范圍就是該基因的所有已發(fā)表的序列,實(shí)際上就是多次搜索結(jié)果的并集3。94天

8、津藥學(xué)T ian jinPharm acy2004年10月第16卷第5期收稿日期:2004206225作者簡(jiǎn)介:王少峽,男(1978-,助理研究員,碩士,畢業(yè)于天津師范大學(xué),從事細(xì)胞分子生物學(xué)方面研究。2確定保守區(qū)域在PCR 反應(yīng)退火時(shí),引物與模板的錯(cuò)配,尤其是在3端的錯(cuò)配將導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)的失敗4。所以設(shè)計(jì)的引物必須存在于查找到的所有序列共有的保守區(qū)域內(nèi),以避免上面提到的因多態(tài)性和各種誤差所帶來(lái)的序列不確定性。確定其共有的保守區(qū)域的辦法是將所查到的某一基因的所有核酸序列進(jìn)行多序列對(duì)比(M u lti p le Sequeces A lignm en ts 。最著名的多序列對(duì)比軟件是C lu st

9、al W (h ttp : www .eb i.ac .uk clu stal w,在其結(jié)果中,所有對(duì)比序列的共有區(qū)域便會(huì)呈現(xiàn)出來(lái),見(jiàn)圖1 。3表示在該位點(diǎn)保守圖1大鼠的一氧化氮合成酶(iNOS 基因多序列對(duì)比的部分結(jié)果3使用軟件根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物將某基因的所有序列進(jìn)行多序列對(duì)比,并知曉它們共有的保守區(qū)域后,就可以利用專(zhuān)業(yè)生物軟件或在線(xiàn)服務(wù)來(lái)設(shè)計(jì)引物,它們會(huì)解決在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要考慮的諸多棘手問(wèn)題,如引物長(zhǎng)度,避免形成引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu),3端的堿基及GC 合理含量等4。設(shè)計(jì)引物的軟件有O ligo 6.0、P ri m er 5.0、DNA star 等,也有提供在線(xiàn)服務(wù)的網(wǎng)站,如h ttp

10、 : cb r 2rbc .n rc 2cn rc .gc .ca cgi 2b in p ri m er 32www .cgi 。但有的軟件或服務(wù)支持簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì),有的不支持(只支持特異引物。筆者強(qiáng)烈推薦使用P ri m er 5.0軟件,它支持簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì),界面友好,易學(xué)易用。將在多序列對(duì)比確定保守區(qū)域時(shí)所用的任一條核苷酸序列粘貼至P ri m er 5.0的界面中,修改P ri m er510的參數(shù),命令其在兩個(gè)距離合適(使其PCR 產(chǎn)物大小合適,1501500bp 的保守核苷酸區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì),即保證上下游引物都落在核苷酸鏈上的保守區(qū)域內(nèi)。結(jié)果包括若干有分?jǐn)?shù)的引物對(duì),分?jǐn)?shù)越高的引物對(duì)其

11、特異性越好。如果實(shí)驗(yàn)是從RNA 中用R T 2PCR 擴(kuò)增,則上下游引物最好位于兩個(gè)外顯子上,保證染色體DNA 不影響結(jié)果。假如了解到所研究的基因從屬于一個(gè)基因家族,且這個(gè)家族有較廣范圍的保守區(qū)域,在設(shè)計(jì)引物時(shí)就需考慮另外一個(gè)問(wèn)題:上下游引物不能同時(shí)落在這個(gè)基因家族所共有的保守區(qū)域內(nèi),否則將在做PCR 時(shí)引起家族內(nèi)的擴(kuò)增,而不是特異性的擴(kuò)增我們所關(guān)注的那個(gè)基因。所以,必須利用目的序列與家族內(nèi)的其他序列的差異保守序列來(lái)設(shè)計(jì)引物以避免對(duì)相關(guān)序列的非隨機(jī)引導(dǎo)3。N CB I 提供了一個(gè)了解其家族背景的方法,在h ttp : www .ncb i .n l m .n ih .gov BLA ST 網(wǎng)頁(yè)

12、中提交某基因的氨基酸鏈,即可考察這條序列內(nèi)有沒(méi)有一個(gè)已知的蛋白質(zhì)家族保守區(qū)域。如我們對(duì)“圖1”中的U 26686序列分析后發(fā)現(xiàn)在其序列中存在好幾個(gè)蛋白質(zhì)保守區(qū)域,如NO S 2oxygenase 2euk (400個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)、CysJ (540個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)、NAD 2b inding 21(120個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)等,且廣泛存在,在設(shè)計(jì)引物時(shí)就有必要注意這一點(diǎn)。4引物的修飾與檢測(cè)引物5端添加無(wú)關(guān)序列不會(huì)影響引物特異序列的退火4。如添加克隆PCR 產(chǎn)物時(shí)所需要的限制酶切位點(diǎn)、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記等。設(shè)計(jì)引物最后要做的工作是將上下游引物分別進(jìn)行“短序列”BLA ST (h ttp : ww

13、w .ncb i .n l m .n ih .gov BLA ST 分析,以考察該引物的特異性。即除了與所想要的目的基因序列配對(duì)之外,是否還存在與其他序列配對(duì)并引起擴(kuò)增的可能性,這將極大地規(guī)避實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。專(zhuān)業(yè)設(shè)計(jì)引物軟件不可能有這樣的功能,因?yàn)樗鼈內(nèi)狈?shù)據(jù)庫(kù)的支持5。需要說(shuō)明的是,本文所敘述的設(shè)計(jì)引物的各個(gè)步驟也適用于設(shè)計(jì)篩選c DNA 文庫(kù)或基因芯片上用的雜交探針,只有一點(diǎn)稍有不同,即引物需要兩個(gè)(上下游,而探針只需要一個(gè)。參考文獻(xiàn)1Kaneh isa M .Grand challenges in bi o info rm atics .B i o info rm atics ,1998,14

14、(4:3092M ino ru Kaneh isa ,Peer Bo rk .B i o info rm atics in the po st 2sequenceera .N ature Genetics ,2003,33(s :30505天津藥學(xué)T ian jin Pharm acy 2004年10月第16卷第5期3張學(xué)敏,王宜強(qiáng).靶向新基因的克隆策略理論與方法.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1999.27222764CW D ieffenbach,GS Bvek sler.黃培堂,俞緯源譯.PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南.北京:科學(xué)出版社,1999.9821005AD Baxeuanis,BF O nel

15、lette.李衍達(dá)譯.生物信息學(xué)基因和蛋白質(zhì)分析的實(shí)用指南.北京:清華大學(xué)出版社,2000.148哺乳期抗菌藥物的應(yīng)用李冬冬,張碧玫(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,天津300052摘要母乳喂養(yǎng)對(duì)嬰兒的成長(zhǎng)有利,值得提倡。但乳母在哺乳期需進(jìn)行藥物治療時(shí),對(duì)哺乳產(chǎn)生一定的影響。本文就哺乳期乳母進(jìn)行抗菌藥物治療時(shí)藥物向乳汁轉(zhuǎn)運(yùn)的方式、乳母用藥對(duì)嬰兒安全性的影響及影響因素等相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞抗菌藥物,哺乳期,臨床應(yīng)用中圖分類(lèi)號(hào):R978.1R96913文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100625687(20040520051203哺乳期母體患有妊娠合并癥或其他疾病需藥物治療時(shí),往往會(huì)與哺乳產(chǎn)生矛盾。而幾乎所有的

16、藥物都能通過(guò)血漿乳汁屏障轉(zhuǎn)運(yùn)至乳汁。產(chǎn)后婦女的免疫功能降低,某些組織器官的功能障礙、分娩時(shí)期產(chǎn)道損傷及失血等因素會(huì)降低產(chǎn)婦的防護(hù)功能,故她們對(duì)抗菌藥物的反應(yīng)有所不同,用藥不當(dāng)不僅會(huì)給產(chǎn)婦造成不同程度的損傷,而且還可通過(guò)母乳喂養(yǎng)對(duì)乳兒造成影響1。因此,為確保母嬰健康,本文就哺乳期抗菌藥物的臨床應(yīng)用進(jìn)行論述。1哺乳期婦女用藥時(shí)對(duì)乳兒的影響因素111藥物因素了解藥物特定性能和在人體的分布,對(duì)于確定乳母用藥時(shí)的相關(guān)危險(xiǎn)性是有幫助的。分子量低于200的小分子藥物、半衰期長(zhǎng)、脂溶性高,與蛋白結(jié)合能力弱,以及弱堿性的藥物易通過(guò)血乳屏障。112乳母因素包括乳房細(xì)胞通透性和雙向性及乳汁與血漿之比。在母乳喂養(yǎng)的最

17、初幾天內(nèi),乳房細(xì)胞在一定程度較14d之后的通透性高。乳房具有雙向性,進(jìn)來(lái)的物質(zhì)能夠出去,這樣一種在乳汁中處于高峰的藥物,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后,乳汁中的藥物含量隨即檢測(cè)不到。當(dāng)藥物在母體血漿中處于低谷時(shí),進(jìn)行母乳喂養(yǎng),嬰兒所受的藥物的作用會(huì)明顯減少。乳汁與血漿比值(MP提示藥物在人乳中聚積程度2。如果母體解毒或排泄功能降低,乳汁分泌量多,乳汁成分中脂肪含量多,向乳汁轉(zhuǎn)運(yùn)的藥量也會(huì)相應(yīng)增多,其在乳汁中的藥物濃度可與母體血漿濃度相同或更高3。113乳兒因素藥物的潛在影響與腎臟和肝臟的發(fā)育有關(guān),年齡越小,藥物潛在影響越大。另外,吸吮次數(shù)頻繁、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)較吸吮次數(shù)少、持續(xù)時(shí)間短的嬰兒更容易受母體經(jīng)常用藥的影響

18、。同時(shí)乳兒胃酸的分泌可能破壞許多藥物,因而這些藥物在血漿中不能被檢出。2哺乳期應(yīng)用抗菌藥物的安全性211青霉素類(lèi)其抗菌作用是破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁,使細(xì)菌在繁殖期死亡,而哺乳動(dòng)物無(wú)細(xì)胞壁,所以青霉素對(duì)人體細(xì)胞毒性很低,有效抗菌濃度對(duì)人體幾乎無(wú)影響4。哺乳期尿路感染時(shí),可根據(jù)細(xì)菌藥敏選用青霉素類(lèi)或頭孢菌素類(lèi)。青霉素可使慶大霉素、卡那霉素等失效,故不宜同用。于晶晶5通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算,預(yù)測(cè)出青霉素在乳汁中濃度是乳母血漿中濃度的0.14倍,雖然青霉素在乳汁中濃度極低,但由于乳兒的代謝酶缺乏和酶的活性低,因此仍能引起對(duì)藥物敏感性的增高,應(yīng)引起注意。艾迪羅(氨芐青霉素+丙磺舒則應(yīng)慎用6,因?yàn)楸鞘婵商岣咔嗝顾氐难帩舛?延長(zhǎng)半衰期,而新生兒排泄青霉素速度很慢,更易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。212頭孢菌素類(lèi)除第四代頭孢菌素(頭孢匹羅、頭孢吡肟外,此類(lèi)抗生素與青霉素