解剖小白鼠實驗

1、細胞原代培養(yǎng)(Cell primary culture)(Cell primary culture)實驗目的實驗目的 了解細胞體外培養(yǎng)的原理、基本方了解細胞體外培養(yǎng)的原理、基本方 法，了解無菌操作方法及注意事項。法，了解無菌操作方法及注意事項。 學習觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長學習觀察體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長 狀況。狀況。實驗原理實驗原理 用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內取出，經(jīng)酶消化要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內取出，經(jīng)酶消化處理，處理

2、，使分散成單個細胞，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。殖。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法 又稱為組織消化分散法組織消化分散法：將妨礙細胞生長的細胞間質去除，使細胞分散，將妨礙細胞生長的細胞間質去除，使細胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 實驗儀器實驗儀器 超凈工作臺超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸 CO2CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 自動雙重純水蒸餾器，純

3、水儀自動雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器 超凈臺 超凈工作臺的工超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾驅動空氣遁過高效濾器，除去空氣中的塵器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。作臺內構成無菌環(huán)境。 濾 器濾器工作原理 CO2CO2培養(yǎng)箱nCO2CO2培養(yǎng)箱設定的條件為培養(yǎng)箱設定的條件為37 37 ，5 5CO2 CO2 。n使用使用CO2CO2培養(yǎng)箱應注意的問題：培養(yǎng)箱應注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需

4、將瓶蓋微松，用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（90 90 ，14 h)14 h)。箱內無菌蒸餾水箱內無菌蒸餾水30003000毫升蒸餾水槽中以毫升蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。保持箱內濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡自動雙重純水蒸餾器 純水儀培 養(yǎng) 板 培養(yǎng)瓶實驗材料實驗材料2 2月月齡的齡的小小鼠鼠實驗試劑實驗試劑 （1 1） 1640-RPMI1640-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)液（2 2） 小牛血清小牛血清（3 3） 青、鏈霉素青、鏈霉素（4 4） PBSPBS液液（5 5） 5 5NaHCO3N

5、aHCO3（6 6） 7575酒精酒精實驗步驟實驗步驟 一、培養(yǎng)前的準備工作一、培養(yǎng)前的準備工作 （1 1） 清洗與消毒清洗與消毒（2 2） 配制溶液配制溶液（3 3） 紫外線消毒紫外線消毒（4 4） 洗手和著裝洗手和著裝（5 5） 進入無菌室進入無菌室 實驗步驟實驗步驟 動動物物細細胞胞原原代代培培養(yǎng)養(yǎng)過過程程圖圖方法與步驟方法與步驟（1 1）動物）動物拉椎處死處死（2 2）取肝及剪碎：）取肝及剪碎：剖開腹部，將，將肝肝臟取出，臟取出，放入小培養(yǎng)皿中，用放入小培養(yǎng)皿中，用PBSPBS液洗滌液洗滌1 1次；將次；將肝肝剪成剪成1mm1mm大小的塊，再用大小的塊，再用PBSPBS液洗滌液洗滌2

6、2次，直次，直到液體澄清。到液體澄清。（3 3）消化及分散組織塊：）消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入將上述清洗過的組織放入試管內，加入的管內，加入的0.250.25胰蛋胰蛋白酶液，白酶液，完全沒過組織完全沒過組織，置，置3737水浴中消化水浴中消化20 20 30min30min，每隔，每隔10min10min搖動一搖動一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，吸去管，吸去胰蛋白酶液，加入胰蛋白酶液，加?ml5ml培養(yǎng)液，用吸管反復吹打組織塊，使其分散成細胞懸液，培養(yǎng)液，用吸管反復吹打組織塊，使其分散成細胞

7、懸液，取上清液至另一取上清液至另一試管中。管中。（4 4）觀察與計數(shù)：）觀察與計數(shù)：從細胞懸液中取出從細胞懸液中取出1 1滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細胞的數(shù)目。看到球型的細胞，證明消化下來細胞，實驗成功。胞的數(shù)目?？吹角蛐偷募毎?，證明消化下來細胞，實驗成功。作業(yè): 1.在細胞培養(yǎng)過程中如何防止污染?無菌操作的幾個注意事項 1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，

8、以免燒焦形成碳膜。 3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。 4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 5、瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。 7、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。 8、在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。 9、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。 超凈臺 超凈工作臺的工超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾驅動空氣遁過高效濾器，除去空氣中的塵器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。作臺內構成無菌環(huán)境。 倒置顯微鏡自動雙重純水蒸餾器 純水儀 培養(yǎng)瓶方法與步驟方法與步驟（1 1）動物）動物拉椎處死處死（2 2）取肝及剪碎：）取肝及剪碎：剖開腹部