實(shí)驗(yàn)九 new 微絲的觀察-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)的觀察動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)的觀察（鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法）（鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 了解鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲結(jié)構(gòu)的原理。 2 觀察微絲束應(yīng)力纖維在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的分布。 3 學(xué)習(xí)細(xì)胞固定，穿透，染色等技術(shù)。 4 鞏固熒光顯微鏡的使用技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理 Actin-Tracker Green是一種Actin綠色熒光探針，可以用于培養(yǎng)細(xì)胞或組織切片的Actin特異性熒光染色。 Actin-Tracker Green探針為熒光染料FITC標(biāo)記的毒蕈肽(phalloidin)，即phalloidin-FITC，其分子量約為1251.4，最大激發(fā)波長(zhǎng)為496nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為516n

2、m。 可以用于細(xì)胞或組織內(nèi)的微絲(microfilament)的熒光檢測(cè)。 使用時(shí)的推薦稀釋比例為1:200。如果每個(gè)片子需要使用200l染色工作液，每個(gè)包裝的本產(chǎn)品足夠用于200個(gè)片子 的染色。主要儀器與溶液 主要儀器 熒光顯微鏡、移液器1000ul 和100ul) 資料：細(xì)胞爬片，兩人一孔。 溶液 PBS配制的3.7%甲醛溶液。 0.1% Triton X-100的PBS洗滌液 含有5%BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1:200的比例稀釋Actin-Tracker Green實(shí)驗(yàn)步驟 a a 用用PBSPBS洗滌細(xì)胞或組織切片洗滌細(xì)胞或組織切片2 2次。每次次。每次0

3、.4ml.0.4ml. b.b.棄去洗滌液，用棄去洗滌液，用PBSPBS配制的配制的3.7%3.7%甲醛溶液室溫固甲醛溶液室溫固定細(xì)胞或組織切片約定細(xì)胞或組織切片約1010分鐘。留意：甲醇可以破分鐘。留意：甲醇可以破壞壞actinactin蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。并且盡量使用不含甲醇的甲醛。每孔并且盡量使用不含甲醇的甲醛。每孔0.2 ml.0.2 ml. c.c.棄去固定液，用含棄去固定液，用含0.1% Triton X-1000.1% Triton X-100的的PBSPBS洗洗滌滌2-42-4次，每次約次，每次約5 5分鐘。每次分鐘。每次0.

4、2 ml.0.2 ml. d d 棄去洗滌液，把棄去洗滌液，把Actin-tracker GreenActin-tracker Green染色工染色工作液按照每個(gè)片子約作液按照每個(gè)片子約100l100l的比例滴加到片子上，的比例滴加到片子上，室溫避光孵育室溫避光孵育3030分鐘。分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟 e. 用含用含0.1% Triton X-100的的PBS洗洗2-4次，每次次，每次約約5分鐘。每次分鐘。每次200ul。 f. 在載玻片上加一滴在載玻片上加一滴PBS, 反扣蓋玻片生長(zhǎng)有細(xì)反扣蓋玻片生長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝下），隨后可以用熒光顯微鏡進(jìn)行觀胞的一面朝下），隨后可以用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。察。 為長(zhǎng)期保存，可以在片子自然干燥后封片并于為長(zhǎng)期保存，可以在片子自然干燥后封片并于4避光保存，保存時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)避光保存，保存時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月左右。個(gè)月左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光顯微鏡 激光共聚焦顯微鏡 顯示的細(xì)胞中的微絲分布作業(yè) 1 為什么不能使用細(xì)胞松弛素B標(biāo)記微絲結(jié)構(gòu)？ 2 Triton-x 100溶液處理細(xì)胞的作用是什么？ 3 本實(shí)驗(yàn)中能使用甲醇固定細(xì)胞嗎？為什么？ 4 動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)