在花青素生物合成調(diào)控機(jī)制中土豆StAN11Gene的克隆和特征

1、在花青素生物合成調(diào)控機(jī)制中土豆StAN11 蛋白 基因的克隆和特征摘要：花青素是植物次生代謝的一類產(chǎn)物，決定著土豆塊莖的顏色，花青素的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，涉及了大量的基因，包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因，在此次研究中，從Chieftain土豆品種中克隆來(lái)的一個(gè)WD40重復(fù)蛋白基因StAN11,。StAN11 (HQ599506) 不包括內(nèi)含子，開放閱讀框?yàn)?029bp，編碼342個(gè)AA的蛋白質(zhì)，為了查證它在花青素合成中的作用，StAN11被導(dǎo)入CaMV35S啟動(dòng)子的pCMBIA1304后面，然后再合成的載體利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法被引入到 Désiré品種中，與野生品種的空白對(duì)照

2、相比，轉(zhuǎn)基因塊莖的顏色大大的加深了，這這種顏色的加深與花青素的積累和StAN11 的表達(dá)保持著高度的一致。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植物黃銅-3-羥化酶，二氫黃酮醇還原酶(DFR),花青素合酶（ANS）,類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了只有DFR是增高的，這說(shuō)明StAN11是通過(guò)控制DFR的表達(dá)來(lái)調(diào)控花青素的合成的，以花青素生物合成作為遺傳背景，塊莖中StAN11的過(guò)表達(dá)和可以提高花青素的積累。關(guān)鍵詞： 花青素生物合成，克隆基因轉(zhuǎn)錄，土豆，StAN11引言花青素是從植物中提取的黃酮類色素，決定著植物的顏色，在植物抵抗非生物和生物逆境中起作用，吸引昆蟲授粉，提高種子的傳播效率，它的高抗氧化

3、性常常用于抗癌變，抗誘變，抗菌，抗炎癥，抗動(dòng)脈粥樣硬化。 由結(jié)構(gòu)基因編碼的大量酶對(duì)花青素的生物合成起重要作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有三種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在花青素的合成中，分別是 R2R3MYB, basic helixloophelix (bHLH), and WD40repeat (WDR)proteins，這些轉(zhuǎn)錄蛋白的結(jié)合和相互作用決定這下游基因的表達(dá)，在擬南芥中，花青素的生物合成主要是通過(guò)三元配合物活化DFR和LDOX(無(wú)色花青素雙加氧酶)結(jié)構(gòu)基因來(lái)調(diào)節(jié)，藍(lán)光誘導(dǎo)花青素的積累，在擬南芥種子發(fā)育中茉莉酮酸酯也由 WDrepeat/Myb/bHLH 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)，在土豆中，MYB轉(zhuǎn)錄因子 StMtf

4、1 和StAN2很好的被分離出來(lái)了，并且證明了它們?cè)诨ㄇ嗨氐纳锖铣芍衅鹫{(diào)控作用。近些年與花青素合成有關(guān)的WD40repeat 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥玉米，矮牽?；?，金魚草中很好的表達(dá)出來(lái)了，并且包含了一個(gè)特殊的高度保守的 tryasp（WD）repeat ，但是沒(méi)有固定的酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性.在擬南芥中，TTG1編碼的WD40repeat蛋白被證實(shí)涉及MBW復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，在突變體ttg1缺乏花青素的時(shí)候MBW復(fù)合體控制著花青素的合成和表皮毛和根毛的結(jié)構(gòu)。這個(gè)基因的同源染色體已經(jīng)在其他植物中被鑒定了， 矮牽?；s種的AN11 ，玉米的PAC1 ,紫羅蘭的MtWD401 。 WDR可以提高bHL

5、H 在紫麻 Perilla frutescens中的核定位，可能與MYB的翻譯后調(diào)控有關(guān)，液泡PH的控制，and 種皮表皮的形態(tài)學(xué)特征在P. Hybrid中，大多數(shù)分離的WDrepeat的蛋白在花青素的合成中是必須的。彩色土豆包含大量的花青素，并且是公認(rèn)的有利于人身體健康的抗氧化劑的重要的來(lái)源，隨著花青素高含量土豆價(jià)值的增加和生物技術(shù)的發(fā)展，代謝工程學(xué)通過(guò)過(guò)表達(dá)調(diào)節(jié)基因來(lái)獲得新的土豆品種是一個(gè)廣泛應(yīng)用的方法， Jung的研究說(shuō)明了在土豆中過(guò)表達(dá)調(diào)節(jié)了 StAN2基因，可以提高土豆塊莖中花青素的含量，編碼 WD40重復(fù)蛋白的基因AN11，第一次是在矮牽牛花雜種中發(fā)現(xiàn)的，但是并沒(méi)有在土豆中報(bào)道過(guò)。

6、在這篇報(bào)道中 StAN11從土豆變種Chieftain中分理出來(lái)，它的作用通過(guò)土豆變種Désirée中基因過(guò)表達(dá)來(lái)分析。結(jié)論StAN11是與花青素合成途徑有關(guān)的調(diào)節(jié)基因的同系物 StAN11 的全部CDNA是利用一對(duì)特殊引物通過(guò)基因的折疊來(lái)獲得的，兩個(gè) 1,100bp的片段分別是由土豆cDNA和基因組DNA擴(kuò)展來(lái)的,這些序列被存放在 GenBank。StAN11包括1029bp的開放閱讀框，編碼342個(gè)AA，分子質(zhì)量為32KDa,等電點(diǎn)為4.95，通過(guò)對(duì)cDNA和DNA的比較發(fā)現(xiàn)StAN11沒(méi)有內(nèi)含子， 通過(guò)將StAN11蛋白質(zhì)序列與來(lái)自GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的植物

7、的序列相比發(fā)現(xiàn)它有一段重要的序列與NcWDR(93.86%),PhAN11 (88.63%), MdTTG1 (83.33%), and VvWD40 (80.70%)相似(Figure 1A)。這些基因都參與了花青素合成。對(duì) StAN11 protein 保守序列的分析發(fā)現(xiàn)它包括4中WDrepeat基序(theAA residuesare at 67112, 117162, 165203, and 254294)，和40個(gè)以 TrpAsp結(jié)尾的AA(Figure 1B),在三維結(jié)構(gòu)中, StAN11蛋白包括11條多肽鏈和9個(gè)貝塔發(fā)夾。(Figure 1C).其次，用StAN11構(gòu)造的系統(tǒng)發(fā)生

8、樹是，它的同系蛋白質(zhì)來(lái)自GenBank的12個(gè)物種， StAN11蛋白聚合在一個(gè)來(lái)自葡萄的VvWDR1分化枝上和群體中。 StAN11蛋白的組織表達(dá)模式為了研究StAN11蛋白的組織表達(dá)模式，StAN11蛋白中的mRNA在Chieftai變種的不同的組織中被測(cè)定，方法采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT PCR）技術(shù)，在圖表3中，StAN11轉(zhuǎn)錄物在所有組織中被檢測(cè)到，在塊莖中是高水平，在根中是低水平。1, root; 2, stem; 3, leaf; 4, bud; 5, stolon; 6, mature tuber.StAN11 轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn) 在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，重組載體 pCMBIA13

9、04StAN11的表達(dá) (Figure 4A)，利用PCR檢測(cè)(Figure 4B)，Désirée利用根瘤農(nóng)桿菌作為中介進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植物的再生在圖C，在轉(zhuǎn)染了農(nóng)桿菌后，愈傷組織誘導(dǎo)出莖用了兩周，誘導(dǎo)出根用了四周，在根長(zhǎng)到2-3cm的時(shí)候利用Hyg B選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選育，存活的根種植在溫室里。 共獲得了17個(gè)存活的株系，利用PCR對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因插入，其中6個(gè)株系達(dá)到了預(yù)期的837bp的擴(kuò)增條帶，在Désirée 對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶(Figure 5A)。為了得知StAN11是否在PCR檢測(cè)的陽(yáng)性植株中表達(dá)，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT PC

10、R）技術(shù)處理土豆葉片，StAN11的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因植物中要明顯高于對(duì)照組中的(Figure 5B)。結(jié)果顯示StAN11成功的在6個(gè)株系中過(guò)表達(dá)了。StAN11的過(guò)表達(dá)提高了花青素的積累在轉(zhuǎn)基因土豆莖的表皮中在轉(zhuǎn)基因土豆生長(zhǎng)50天后，莖的顏色與野生的品種相比明顯不同，前一個(gè)是紫色的，后一個(gè)是亮紅的，為了辨清莖的顏色和花青素的聯(lián)系，測(cè)定了莖表皮花青素的的含量，結(jié)果表明在所有轉(zhuǎn)基因株系中花青素的含量要高于空白對(duì)照，大約2-6倍，我們進(jìn)一步測(cè)定了StAN11在轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)水平，qRT-PCR技術(shù)測(cè)定 StAN11的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中以不同水平的增加了，與這些轉(zhuǎn)基因株系中花青素含量是一致的。結(jié)果

11、顯示在轉(zhuǎn)基因土豆莖的表皮中StAN11的過(guò)表達(dá)提高了花青素的積累。StAN11調(diào)控StDFR在土豆中的表達(dá)為了證明StAN11作為一個(gè)調(diào)節(jié)基因在花青素的合成中是如何調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的，我們利用了半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT PCR）技術(shù)測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株2的StF3H,StDFR,StANS,andSt3GT蛋白在葉片和莖中的表達(dá)，結(jié)果顯示與野生品種相比StDFR在轉(zhuǎn)基因株系中顯著增加了，但是StF3H,St3GT, and StANS變化不顯著。表明StDFR是StAN11在花青素合成中的靶蛋白。DISCUSSION近些年，由于花青素對(duì)人體健康的作用，高含量花青素的彩色土豆越來(lái)越受歡迎。彩色土豆

12、的繁殖的需求促進(jìn)了花青素生物合成機(jī)制的研究，隨著檢測(cè)出花青素生物合成中的結(jié)構(gòu)基因，一些調(diào)節(jié)基因像StAN1b (JX848660) and StAN2被分離出來(lái)，這兩個(gè)基因分別屬于bHLHandMYB(轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域)。在這篇報(bào)道中，我們從Chieftain變種中克隆了與花青素生物合成有關(guān)的調(diào)節(jié)基因StAN11，屬于WD40基因家族。一些基因標(biāo)記蛋白表現(xiàn)了高序列一致性，與葡萄品種VvWDR1是近親關(guān)系。 在花青素合成中，WD40蛋白有利于MYB and bHLH中調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用，這些蛋白有典型特征的WD40模序，一個(gè)以TrpAsp結(jié)尾的含40個(gè)AA的序列。在WD40

13、蛋白中基序是一個(gè)串聯(lián)的重復(fù)單位，至少四個(gè)WD40重復(fù)蛋白組成一個(gè)高階和高功能的結(jié)構(gòu)，在這研究中，StAN11包括4個(gè)WD40基序，與其他物種中WD40蛋白在結(jié)構(gòu)中保持一致。 AN11的表達(dá)通常是在特殊組織中，像出現(xiàn)在擬南芥的花芽中，蘋果中的果實(shí)中，StAN11轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在可以在Chieftain所有組織中檢測(cè)得到，但是高水平的表達(dá)在花芽和莖中，這些特異性表達(dá)可能與與基因的功能位點(diǎn)有關(guān)?；ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)節(jié)基因的異常表達(dá)在多種植物中發(fā)現(xiàn)，比如在擬南芥中，轉(zhuǎn)基因葡萄的VvWDR1和蘋果的MdTTG1基因的表達(dá)增加了花青素的含量，土豆中轉(zhuǎn)基因植株Désirée的StAN2的過(guò)表達(dá)加深了

14、莖的顏色，在這篇研究中，在轉(zhuǎn)基因株系中，StAN11的過(guò)表達(dá)有效的增加了花青素的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明StAN11在花青素的合成中起了重要的作用。在轉(zhuǎn)基因植株中常常發(fā)現(xiàn)一些變種，可能是由于導(dǎo)入復(fù)制的數(shù)目，合成的位置，以及轉(zhuǎn)基因的沉默導(dǎo)致的，在四種轉(zhuǎn)基因的株系中，花青素的含量相當(dāng)?shù)牟煌＿@些不同與轉(zhuǎn)基因植株中的StAN11的表達(dá)的不同完全符合。為了證實(shí)StAN11在花青素合成過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制，為了證明 StAN11作為一個(gè)調(diào)節(jié)基因在花青素的合成中是如何調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的，我們利用了半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT PCR）技術(shù)測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株2的StF3H,StDFR,StANS,andSt3GT蛋白在葉

15、片和莖中的表達(dá)，結(jié)果顯示StDFR在轉(zhuǎn)基因株系中顯著增加，StAN11是你通過(guò)調(diào)節(jié)StDFR的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)花青素的合成的，進(jìn)一步證實(shí)了在擬南芥中DFR是MYB/WD40/bHLH調(diào)控復(fù)合物的靶蛋白?？偨Y(jié)，我們利用RTPCR從土豆變種中克隆了一個(gè)WD40重復(fù)蛋白的基因StAN11，結(jié)果表明StAN11與花青素的生物合成的調(diào)控有關(guān)，結(jié)構(gòu)基因StDFR是他的靶蛋白（靶點(diǎn)），這個(gè)研究為花青素含量提高的應(yīng)用提供了證據(jù)，同樣提高了我們的能力去發(fā)現(xiàn)新的生物技術(shù)方法來(lái)利用分子基因的方法繁殖高花青素含量的土豆新品種。MATERIALS AND METHODS將在試管中生長(zhǎng)的土豆塊莖在溫室中種植，自然光照射，一個(gè)月

16、后幼葉提取RNA和DNA，兩個(gè)月后根、莖、葉、芽和塊莖用于StAN11空間表達(dá)的分析。組織培養(yǎng)得來(lái)的土豆變種Désirée的組培苗在24恒溫箱中12h/12h日夜交替培養(yǎng)。組培苗培養(yǎng)四周的莖段作為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的外植體。StAN11 cDNA and 基因組DNA的提取0.1g 的Chieftain葉片用總RNA提取試劑提取其總RNA，在此之前用DNase處理，1%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確定RNA的完整性，260nm的吸收波峰來(lái)測(cè)定RNA的濃度，純度的測(cè)定用A260/A280來(lái)衡量。cDNA的第一條鏈由MMLV反轉(zhuǎn)錄酶從Promega中合成。PCR：cDNA 1ul1*Taq 反應(yīng)

17、buffer2.5mMMgcl2，250nM d NTP，1mM引物，2.5U Taq酶StAN11的cDNA由正向引物(5TCAAAATGGAGAATTCAAGTC3) 和反向引物 (5 TCTTACAGGAAAAATTC AATCAT3 )擴(kuò)增來(lái)的，這些引物根據(jù)PhAN11(U94748),NcWDR (GQ260131), and InWD40 (AB232779)cDNA序列設(shè)計(jì)來(lái)的。擴(kuò)增的程序：945min,9435個(gè)循環(huán)40秒，5240秒，721min,7210min最終延伸。總基因組DNA從土豆的幼葉中利用CTAB法提取，StAN11 DNA序列直接利用特異性引物從總DNA中PC

18、R得來(lái)，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離，在回收的凝膠中獲得目的DNA條帶，然后被克隆進(jìn)pMD19T載體，然后被轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌株完整的細(xì)胞中，白色菌落利用PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆被測(cè)序。StAN11的序列分析將StAN11提交到NCBI中用BLASTP（數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)序列比較）進(jìn)行序列比較分析，利用DNAMAN程序進(jìn)行大量的序列對(duì)比和進(jìn)化分析，利用SMART對(duì)保守區(qū)段進(jìn)行分析，用瑞士模式服務(wù)器進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的分析，AN11蛋白的進(jìn)化樹用利用MEGAv 4.1通過(guò)neighborjoining (NJ)方法構(gòu)造。系統(tǒng)樹 各分支的置信度用自展檢驗(yàn)法（bootstrap test）檢驗(yàn)

19、，共進(jìn)行1000次循環(huán)StAN11的組織表達(dá)分析從變種Chieftain提取根莖葉芽塊莖的RNA ，并且加入NDase，cDNA 的第一條鏈利用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，StAN11 cDNA的反轉(zhuǎn)錄區(qū)域利用AN11S and AN11A引物擴(kuò)增，用引物GAPDHS(5TCAACGAGAATGAATACAAGCCA3 and GAPDHA (5TCGA-CAACA GA AACATCAGCAGT3 )擴(kuò)增的350bp的片段作為RNA的模板，這些引物是利用StGAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）設(shè)計(jì)的。擴(kuò)增的程序：945min,9435個(gè)循環(huán)40秒，5240秒，721min,7210min最終延伸。PC

20、R共擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)。pCMBIA1304StAN11載體的結(jié)構(gòu)用正向引物(5CATGCCATGGAAAATTCAAGTCAAG3限制酶切位點(diǎn))和反向引物(5GAAGATCTTCTTACAG-GAAAAATTCAATCAT3)PCR擴(kuò)增StAN11的ORF.。PCR產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序被確定然后導(dǎo)入pCMBIA1304中，在35S啟動(dòng)子后面，重組載體pCMBIA1304StAN11利用反復(fù)凍融法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌Agrobacterium 菌株GV3101中。Potato 轉(zhuǎn)錄and繁殖將四周的土豆幼苗的0.5-1.0cm的塊莖在Y2培養(yǎng)基（MS+½mg/L6-芐基氨基嘌呤+0.2mg/L-萘乙酸+

21、0.2mg/L2.4-二氯苯氧基乙酸）上，在黑暗環(huán)境中24預(yù)培養(yǎng)2d，然后浸入到攜帶pCMBIA1304StAN11質(zhì)粒的農(nóng)桿菌（光密度OD600=0.6）中懸浮8min，然后在Y2培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d與之前同樣的環(huán)境，然后被感染的塊莖放置在MGT培養(yǎng)基上（MS+0.03mg/L赤霉酸+0.5mg/LN-苯基-N-1.2.3-噻二唑-5-脲+200mg/L頭孢噻扝+10mg/L潮霉素B），在光周期12/12,24的環(huán)境中誘導(dǎo)愈傷組織，四周后從莖段中獲得再生嫩枝，放在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10mg/L潮霉素B，檢測(cè)生根，存活下來(lái)的植株放在溫室中培養(yǎng)。PCR identification o

22、f transgenic plants為了鑒定轉(zhuǎn)基因植株，從在HygB培養(yǎng)基存活的植株和野生品種Désirée中的葉中提取基因組DNA，轉(zhuǎn)基因土豆株系利用PCR來(lái)鑒定，擴(kuò)增的程序：945min,9435個(gè)循環(huán)40秒，5240秒，721min,7210min最終延伸。PCR共擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)。引物(5TTGCCATTGCGTTTTCTAAC3)and(5TCACGGGTTGGGGTTTCTAC3 )。PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)得到的837bp個(gè)片段，包括pCAM-BIA1304載體和 StAN11的ORF的重要序列。 qRTPCR analysis of StAN11 expression利用半定量PCR來(lái)檢測(cè)StAN11的轉(zhuǎn)錄水平，在培養(yǎng)了50