第三章 定點(diǎn)誘變技術(shù)

1、第三章 DNA突變技術(shù) 基因突變包括單個(gè)堿基或片斷的替換，基基因突變包括單個(gè)堿基或片斷的替換，基因片斷的插入與刪除等。因片斷的插入與刪除等。 根據(jù)其特點(diǎn)可將基因突變技術(shù)分兩大類：根據(jù)其特點(diǎn)可將基因突變技術(shù)分兩大類： 1.1.位點(diǎn)特異性突變位點(diǎn)特異性突變 定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變 2.2.隨機(jī)突變隨機(jī)突變 表型篩選表型篩選 隨機(jī)突變 易錯(cuò)PCR法(Error-prone PCR)v降低一種降低一種dNTP的量（降至的量（降至5-10）v加入加入dITP來代替被減少的來代替被減少的dNTPv緩沖液中另加緩沖液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shufflingv外顯子、單基因和基因家族的重組裝外

2、顯子、單基因和基因家族的重組裝v隨機(jī)引物延伸法隨機(jī)引物延伸法v交錯(cuò)延伸法交錯(cuò)延伸法定點(diǎn)突變 點(diǎn)突變堿基堿基刪除、增補(bǔ)和替換刪除、增補(bǔ)和替換易錯(cuò)PCR(epPCR) How DNA shuffling is done in the tubev Random fragmentation of a pool of related genes;v Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);v PCR amplification with primers of reassembled prod

3、ucts How DNA shuffling worksHow DNA shuffling works ？Similar mutants generated byerror-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . . . . . .Single gene shufflinglibrary of point mutantsFamily gene shufflinglibrary of chimerasGenerating chimeras with crossovers of large blocks of sequences一、單基因

4、和基因家族的重組裝一、單基因和基因家族的重組裝X XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesHow DNA shuffling works ？一、單基因和基因家族的重組裝一、單基因和基因家族的重組裝D N A 重組裝的過程磷脂酶熱穩(wěn)定催化活性的分子進(jìn)化

5、磷脂酶熱穩(wěn)定催化活性的分子進(jìn)化（Jae Kwang Song等，等，2000）-葡糖苷酶耐熱性的提高葡糖苷酶耐熱性的提高(Mar a Jesu s Arrizubieta等，等，2000）耐熱耐熱p-硝基苯酯酶的分子進(jìn)化硝基苯酯酶的分子進(jìn)化(Lori Giver等，等，1998） The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573) are shown in red. Two mutations in close prox

6、imity of the active site (Pro511 and Asp908) are shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on the protein surface (Val9 and Gln135) are shown in green. The rest of the substrate binding and active site residues are shown in yellow.牛乳糖酶到巖藻糖苷酶的直接進(jìn)化（JI-HU ZHANG等，1997）二、隨機(jī)引物二、隨機(jī)引

7、物PCR(RPR)和重組裝和重組裝How DNA shuffling works ？多功能氧化酶的定向進(jìn)化多功能氧化酶的定向進(jìn)化（Hikaru Suenaga等等,2001）三、交錯(cuò)延伸三、交錯(cuò)延伸PCR突變法突變法(StEP)How DNA shuffling works ？枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化（Huimin Zhao等，等，1999）進(jìn)化的熱穩(wěn)定性枯草芽孢桿菌蛋白酶進(jìn)化的熱穩(wěn)定性枯草芽孢桿菌蛋白酶E的突變譜系的突變譜系進(jìn)化后的枯草桿菌蛋白酶進(jìn)化后的枯草桿菌蛋白酶E正面反面芽孢桿菌脲酸酶的定向芽孢桿菌脲酸酶的定向 進(jìn)化進(jìn)化（Su-Hua Huan

8、g等等,2004）定點(diǎn)突變的研究意義 1.對調(diào)控區(qū)進(jìn)行突變對調(diào)控區(qū)進(jìn)行突變研究基因結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系研究基因結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系 2. 對編碼基因進(jìn)行突變對編碼基因進(jìn)行突變檢驗(yàn)特定殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、催化活性和配基檢驗(yàn)特定殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、催化活性和配基結(jié)合能力中的作用結(jié)合能力中的作用獲得突變蛋白獲得突變蛋白定點(diǎn)突變的類型定點(diǎn)突變的類型寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變指用含有突變堿基的寡聚指用含有突變堿基的寡聚核苷酸片斷作為引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)核苷酸片斷作為引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制。分子進(jìn)行復(fù)制。盒式突變盒式突變是利用一段人工合成的含基因突變序列的是利用一

9、段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。PCR介導(dǎo)的基因突變介導(dǎo)的基因突變DNA定點(diǎn)突變的種類定點(diǎn)突變的種類寡聚核苷酸介導(dǎo)寡聚核苷酸介導(dǎo)替換、插入、刪除替換、插入、刪除盒式突變盒式突變PCR介導(dǎo)介導(dǎo)寡聚核苷酸介導(dǎo)寡聚核苷酸介導(dǎo)法 在dut+的E. coli中 dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失體中（dut- ） dUTP dUMP dUTP酶酶 dut：dUTPase突變，可導(dǎo)致突變，可導(dǎo)致E. coli內(nèi)內(nèi)dUTP的的量增加，當(dāng)量增加，當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，可在很多應(yīng)該加復(fù)制時(shí)，可在很多應(yīng)該加dTTP的位的位置加入置加入d

10、UTP。 在正常情況下，尿嘧啶在正常情況下，尿嘧啶-糖基化酶糖基化酶(ung+)可以去除摻可以去除摻入入DNA中的尿嘧啶殘基。但中的尿嘧啶殘基。但在在ung-的菌株中，此酶失活。的菌株中，此酶失活。 在大腸桿菌在大腸桿菌dut- ung-菌株菌株中生長的中生長的M13噬菌體的單鏈基噬菌體的單鏈基因組因組DNA中將含有中將含有20-30個(gè)尿個(gè)尿嘧啶殘基。用這些噬菌體感染嘧啶殘基。用這些噬菌體感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去菌株，尿嘧啶被迅速去除，除，DNA鏈遭到破壞，感染鏈遭到破壞，感染力下降約力下降約5個(gè)數(shù)量級。個(gè)數(shù)量級。 此法的成功關(guān)鍵，是要得此法的成功關(guān)鍵，是要得到好的含單鏈模板到好的含單

11、鏈模板DNADNA。無無5-3外切活性外切活性3-5外切活性低外切活性低噬菌粒載體噬菌粒載體（phagemid ）M13K07輔助感染輔助感染產(chǎn)生帶產(chǎn)生帶 U 的單鏈的單鏈 DNA 這種方法得到的突變率太低，約為這種方法得到的突變率太低，約為1-5%。主要原因是含突變。主要原因是含突變位點(diǎn)的雙鏈位點(diǎn)的雙鏈DNA，轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入E.coli后，被其修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)了。后，被其修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)了。盒盒式式定定點(diǎn)點(diǎn)突突變變PCR介導(dǎo)的基因突變介導(dǎo)的基因突變在基因在基因5和和3末端產(chǎn)生突變末端產(chǎn)生突變重疊延伸重疊延伸PCR大引物大引物PCR法法在基因5和3末端產(chǎn)生突變重疊延伸法定點(diǎn)突變技術(shù)的原理示意圖重疊延伸法定

12、點(diǎn)突變技術(shù)的原理示意圖重疊延伸重疊延伸PCR法小結(jié)法小結(jié)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：需要需要2對引物，進(jìn)行對引物，進(jìn)行3次次PCR，并且需要對中，并且需要對中間產(chǎn)物進(jìn)行純化。間產(chǎn)物進(jìn)行純化。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：幾乎沒有特殊限制，而且成功率高，因此運(yùn)幾乎沒有特殊限制，而且成功率高，因此運(yùn)用非常廣泛。用非常廣泛。 同時(shí)利用重疊延伸同時(shí)利用重疊延伸PCR技術(shù)可以對基因中心區(qū)技術(shù)可以對基因中心區(qū)段進(jìn)行取代、段進(jìn)行取代、插入插入、缺失缺失的突變。的突變。大引物大引物PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變介導(dǎo)的定點(diǎn)突變各種點(diǎn)突變方法的比較方法方法寡聚核苷酸寡聚核苷酸介導(dǎo)的突變介導(dǎo)的突變盒式突變盒式突變PCR介導(dǎo)的突變介導(dǎo)的突變優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)保真度高保真

13、度高簡單易行簡單易行突變效率高突變效率高操作簡單操作簡單突變成功率高突變成功率高缺點(diǎn)缺點(diǎn)操作復(fù)雜操作復(fù)雜周期長周期長合成多條引物成本高合成多條引物成本高受到酶切位點(diǎn)的限制受到酶切位點(diǎn)的限制后續(xù)工作復(fù)雜后續(xù)工作復(fù)雜TaqDNA聚合酶保真性偏低聚合酶保真性偏低應(yīng)用產(chǎn)品一步反向一步反向PCR法法Stratagen公司的公司的QuikChange系列試劑盒系列試劑盒SBS Genetech公司的公司的Muta-direct Site Directed Mutagenesis KitStratagen公司的公司的QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit

14、TaKaRa公司的公司的Multipoints Mutagenesis Kit 一種簡便快速的定點(diǎn)突變的方法一種簡便快速的定點(diǎn)突變的方法 Stratagen公司研制的公司研制的Quickchange試劑盒試劑盒,可以雙鏈可以雙鏈DNA質(zhì)粒為模板，只需一對引物，進(jìn)行一次質(zhì)粒為模板，只需一對引物，進(jìn)行一次PCR，在，在12d內(nèi)即可完成點(diǎn)突變過程。內(nèi)即可完成點(diǎn)突變過程。 DpnI識別序列為甲基化的識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次。質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次。 Overview of the QuikChange XL site-directed mutagenesis method.Steps of Muta-direct Site-Directed Mutag