基因工程操作程序學習教案

1、會計學1基因工程基因工程(jyn gngchng)操作程序操作程序第一頁，共42頁。補：原核細胞的基因補：原核細胞的基因(jyn)(jyn)結構結構非編碼非編碼(bin m)(bin m)區(qū)區(qū)非編碼非編碼(bin m)(bin m)區(qū)區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子 RNA RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。其結合。 轉錄開始后，轉錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動，并以分子移動，并以DNADNA分子的一條鏈為模板合成

2、分子的一條鏈為模板合成RNARNA。 轉錄完畢后，轉錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來，緊接著鏈釋放出來，緊接著RNARNA聚合聚合酶也從酶也從DNADNA模板鏈上脫落下來。模板鏈上脫落下來。第1頁/共41頁第二頁，共42頁。不能轉錄不能轉錄(zhun l)(zhun l)為信使為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質。編碼蛋白質。：能轉錄相應：能轉錄相應(xingyng)(xingyng)的信的信使使RNARNA，能，能 編碼蛋白質編碼蛋白質 編碼編碼(bin (bin m)m)區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細胞細胞的的 基因基因結構結構有調控遺傳信息表達的核有調控遺傳信息表達的核 苷酸序列，

3、在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的RNARNA聚合酶結合位點。聚合酶結合位點。啟動子啟動子第2頁/共41頁第三頁，共42頁。補：真核細胞的基因補：真核細胞的基因(jyn)(jyn)結結構構編碼編碼(bin (bin m)m)區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結合結合(jih)(jih)位點位點內含子內含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子第3頁/共4

4、1頁第四頁，共42頁。補：真核細胞的基因補：真核細胞的基因(jyn)(jyn)結構結構編碼編碼(bin (bin m)m)區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結合結合(jih)(jih)位點位點內含子內含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子子啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內含子：內含子： 外顯子：外顯子： 第4頁/共41頁第五頁，共42頁。第5頁/共41頁第六頁，共42頁。真核真核細胞細胞的的 基因基因(jy(jyn)n)結

5、構結構編碼編碼(bin (bin m)m)區(qū)區(qū)非編碼非編碼(bin m)(bin m)區(qū)區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，：有調控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結合位點。聚合酶結合位點。非編碼序列：非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內含子包括非編碼區(qū)和內含子第6頁/共41頁第七頁，共42頁。原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質的都由能夠編碼蛋白質的_和具和

6、具有調控作用的有調控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構原核細胞與真核細胞的基因結構(jigu)(jigu)比較比較思思考考(s(skkoo) )編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構胞與真核細胞基因結構(jigu)(jigu)一樣長一樣長嗎？嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼第7頁/共41頁第八頁，共42頁?；蚬こ袒蚬こ?jyn gngchng)(jyn gngchng)基本操作的四個基本操作的四個步驟步驟1 1、目的基因、目的基因(jyn)(jyn)的獲取的獲取2 2、基因、基因(jyn)(jyn)表達載體

7、的構建表達載體的構建3 3、將目的基因導入受體細胞、將目的基因導入受體細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定第8頁/共41頁第九頁，共42頁。一、目的一、目的(md)(md)基因的基因的獲取獲取1 1、目的、目的(md)(md)基因主要是指基因主要是指_編碼編碼(bin m)(bin m)蛋白質的結構蛋白質的結構基因基因請舉出三個以上的例子請舉出三個以上的例子2 2、獲取目的基因的常用方法有哪些、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）從基因文庫中獲?。幕蛭膸熘蝎@取（2 2）利用）利用PCRPCR技術擴增技術擴增（3 3）人工合成）人工合成請閱讀請閱讀P9P9第一和二兩

8、段第一和二兩段第9頁/共41頁第十頁，共42頁?；蛭膸旎蛭膸?基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫（如（如:cDNA文庫）文庫）1.1.基因文庫基因文庫第10頁/共41頁第十一頁，共42頁?；蚪M基因組文庫文庫(wnk)與部分與部分基因文基因文庫庫(wnk)的關系的關系第11頁/共41頁第十二頁，共42頁。2.2.基因文庫的構建基因文庫的構建(u jin)(u jin)方法方法鳥槍法：鳥槍法：供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多(xdu)DNA(xdu)DNA片片段段運載運載(ynzi)(ynzi)體體限制酶限制酶與載體連接與載體連接載入載入受體細胞受體細胞產生特定性狀產生

9、特定性狀導入導入外源外源DNADNA擴增擴增目的基因目的基因分離分離( (直接分離法直接分離法) )( (一一) )從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因第12頁/共41頁第十三頁，共42頁。反轉錄法：反轉錄法：cDNA文庫文庫 以目的基因轉錄成的信以目的基因轉錄成的信使使(xnsh)RNA為模板，為模板，反轉錄成互補的單鏈反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成雙鏈雙鏈DNA，從而獲得所需，從而獲得所需的基因。的基因。目的目的(md)(md)基因的基因的mRNAmRNA雜交雜交(zjio)(zjio)雙鏈雙鏈( (單鏈單鏈RNA/RNA/單鏈單鏈DNA)

10、DNA)單鏈單鏈DNADNA反轉錄酶反轉錄酶核酸酶核酸酶H H2.2.基因文庫的構建方法基因文庫的構建方法DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA DNA （cDNAcDNA）( (目的基因目的基因) )第13頁/共41頁第十四頁，共42頁。上述上述(shngsh)(shngsh)三種目的基因提取的方法有何優(yōu)三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？缺點？優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點鳥槍法鳥槍法反轉錄法反轉錄法根據已知氨基根據已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作簡操作簡便便(jinbi(jinbin)n)廣泛廣泛使用使用工作量大，盲目工作量大，盲目(mngm)(mngm)，分離出來，分離出來的有時并非一個基因的

11、有時并非一個基因專一性強專一性強操作過程麻煩，操作過程麻煩，mRNAmRNA很不穩(wěn)定，要求的技很不穩(wěn)定，要求的技術條件較高術條件較高專一性最強專一性最強僅限于合成核苷酸僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因對較少的簡單基因第14頁/共41頁第十五頁，共42頁。( (二二) )利用利用(lyng)PCR(lyng)PCR技術擴增目技術擴增目的基因的基因第15頁/共41頁第十六頁，共42頁。 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為(chn (chn wi)_wi)_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件條件(tiojin)(tiojin)：_、 _ _、_ _ 、_.

12、_.原理原理(yunl)(yunl)：_方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循為擴增循 環(huán)的次數）環(huán)的次數）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物TaqTaq酶酶指數指數2 2n n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增( (二二) )利用利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因第16頁/共41頁第十七頁，共42頁。過程過程(guchng)(guchng)：a a、DNADNA變性（

13、變性（90-9690-96）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板(mbn)(mbn) 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（復性、退火（復性 25-65 25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物物與與DNADNA模板結合模板結合(jih)(jih)，形成局部，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端端延伸，合成與模板互補延伸，合成與模板互補 的的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈第17頁/共41頁第十八頁，共42頁。第18頁/共41頁第十九頁

14、，共42頁。（3 3）人工合成）人工合成(rn (rn n h chn)n h chn)一、目的基因一、目的基因(jyn)(jyn)的獲取的獲取 條件：如基因比較條件：如基因比較(bji(bji o)o)小，小， 又已知；又已知； 方法：可借助方法：可借助 用化學方法直接人用化學方法直接人 工合成。工合成。核苷酸序列核苷酸序列DNADNA合成儀合成儀第19頁/共41頁第二十頁，共42頁。根據根據(gnj)已知的氨基酸序列合成已知的氨基酸序列合成DNA法法 ： 根據已知蛋白質根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測的氨基酸序列，推測(tuc)(tuc)出相應的信使出相應的信使RNARNA序列，然后按照堿

15、序列，然后按照堿基互補配對原則，推基互補配對原則，推測測(tuc)(tuc)出它的結構出它的結構基因的核苷酸序列，基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成單核苷酸為原料合成目的基因。目的基因。蛋白質的氨基酸序列蛋白質的氨基酸序列(xli)(xli)mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學合成化學合成2.2.基因文庫的構建方法基因文庫的構建方法第20頁/共41頁第二十一頁，共42頁。1.1.用一定的用一定的_切割切割 質粒，使其出現一個切質粒，使其出現一個切 口，露出口，露出_。2.2.用

16、用_切斷切斷(qi dun)(qi dun)目目 的基因，使其產生的基因，使其產生_ _ _。( (二二) )基因表達載體基因表達載體(zit)(zit)的構建的構建 核心核心(hxn)3.3.將切下的目的基因片段插入質粒的將切下的目的基因片段插入質粒的_ _處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同第21頁/共41頁第二十二頁，共42頁。質粒質粒DNADNA分子分子(fnz)(fnz)限制限制(xinzh)(xin

17、zh)酶酶處理處理一個切口一個切口(qi ku)(qi ku)兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒） 核心核心同一種同一種( (二二) )基因表達載體的構建基因表達載體的構建4.4.過程過程: :第22頁/共41頁第二十三頁，共42頁。5.5.基因基因(jyn)(jyn)表達載體的組表達載體的組成：成：復制原點復制原點+ +目的目的(md)(md)基因基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標記標記基因基因它們有什么它們有什么(shn me)作用？作用？第23頁/共41頁第二十四頁，共4

18、2頁。( (三三) )將目的將目的(md)(md)基因導入受體細胞基因導入受體細胞轉化轉化(zhunhu) (zhunhu) 目的基因進入目的基因進入_內，并且內，并且(bngqi)(bngqi)在在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達第24頁/共41頁第二十五頁，共42頁。( (三三) )將目的將目的(md)(md)基因導入受體細胞基因導入受體細胞轉化轉化(zhunhu) (zhunhu) 方法方法(fngf)(fngf)將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞

19、微生物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞目的基因進入目的基因進入_內，并且在內，并且在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達第25頁/共41頁第二十六頁，共42頁。1 1、將目的基因導入植物細胞、將目的基因導入植物細胞(xbo)(xbo)的方法：農桿的方法：農桿菌轉化法菌轉化法（1 1）農桿菌介紹）農桿菌介紹（2 2）原理及適用范圍）原理及適用范圍( (三三) )將目的將目的(md)(md)基因導入受體細胞基因導入受體細胞第26頁/共41頁第二十七頁，共42頁。( (三三) )

20、將目的將目的(md)(md)基因導入受體細胞基因導入受體細胞第27頁/共41頁第二十八頁，共42頁。第28頁/共41頁第二十九頁，共42頁。( (四四) )目的目的(md)(md)基因的檢測與鑒基因的檢測與鑒定定檢查是否檢查是否(sh fu)成功成功檢測檢測(jin (jin c)c)檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因方法方法DNADNA分子雜交分子雜交第29頁/共41頁第三十頁，共42頁。第30頁/共41頁第三十一頁，共42頁。( (四四) )目的基因的檢測目的基因的檢測(jin c)(jin c)與鑒定與鑒定檢查是否檢查是否

21、(sh fu)成功成功檢測檢測(jin (jin c)c)檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）（注意與上不同之處）抗原抗體雜交抗原抗體雜交第31頁/共41頁第三十二頁，共42頁。第32頁/共41頁第三十三頁，共42頁。( (四四) )目的基因的檢測目的基因的檢測(jin c)(jin c)與鑒與鑒定定檢查檢查(jinch)是否

22、成功是否成功檢測檢測(jin (jin c)c)鑒定鑒定檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）（注意與上不同之處）抗原抗體雜交抗原抗體雜交第33頁/共41頁第三十四頁，共42頁。DNADNA分子分子(fnz)(fnz)雜交示雜交示意圖意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物

23、的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNADNA分子分子(fnz)(fnz)的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。是兩條游離的單鏈。 P15P15思考思考(sko)(sko)與探究與探究第34頁/共41頁第三十五頁，共42頁。1）以下說法正確的是）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列序

24、列(xli) B、質粒是基因工程中唯一的運載體、質粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現出來、基因控制的性狀都能在后代表現出來C C第35頁/共41頁第三十六頁，共42頁。2）不屬于質粒被選為基因運載體的理由）不屬于質粒被選為基因運載體的理由(lyu)是是 A、能復制、能復制 （ ） B、有多個限制酶切點、有多個限制酶切點 C、具有標記基因、具有標記基因 D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNA第36頁/共41頁第三十七頁，共42頁。3）有關基因工程）有關基因工程(jyn gngchng)的敘述中，錯誤的敘述中，錯誤的是（的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基