實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)N端分析PPT學(xué)習(xí)教案

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N端分析端分析基本原理基本原理第1頁(yè)/共22頁(yè) 熒光試劑熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯（ DNS-Cl ）在）在堿性堿性條件下與氨基酸、肽和蛋白質(zhì)條件下與氨基酸、肽和蛋白質(zhì)N末端的氨基反末端的氨基反應(yīng)，分別生成帶有應(yīng)，分別生成帶有的的DNS-氨基酸、氨基酸、DNS-肽、肽、 DNS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)。靈敏度。靈敏度10-10摩爾。摩爾。DansylCl 標(biāo)記標(biāo)記N末端氨基末端氨基酸酸第2頁(yè)/共22頁(yè)第3頁(yè)/共22頁(yè)DNS-肽和 DNS-蛋白質(zhì)的水解DNS-肽和肽和 DNS-蛋白質(zhì)被蛋白質(zhì)被6.0 mol/L的鹽酸的鹽酸水解水解，釋釋放出帶有放出帶有 N末端標(biāo)記的

2、末端標(biāo)記的DNS-氨基酸氨基酸。第4頁(yè)/共22頁(yè)第5頁(yè)/共22頁(yè)第6頁(yè)/共22頁(yè)BCAC第7頁(yè)/共22頁(yè)聚酰胺（尼龍）：聚酰胺（尼龍）： 己二酸己二酸和和己二胺己二胺的聚合物的聚合物 nHOOC(CH2)4COOH + nH2N (CH2) 6NH2 -HN-CO -(CH2)4 CO-NH (CH2) 6NH-CO- 分子中含有大量的分子中含有大量的酰胺基團(tuán)酰胺基團(tuán)聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析第8頁(yè)/共22頁(yè)聚酰胺薄膜：聚酰胺薄膜：將聚酰胺均勻涂在滌綸基片上，干燥將聚酰胺均勻涂在滌綸基片上，干燥后制得的薄膜。后制得的薄膜。 聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜含有含有-CO-和和-NH-基團(tuán)，能與被分離的基

3、團(tuán)，能與被分離的化合物形成氫鍵，因此可以吸附酚類、化合物形成氫鍵，因此可以吸附酚類、酸類酸類（核苷（核苷酸、氨基酸）、醌類、硝基及胺基等化合物。酸、氨基酸）、醌類、硝基及胺基等化合物。 聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析第9頁(yè)/共22頁(yè)分離原理：分離原理： 各種被分離物在展層劑中的各種被分離物在展層劑中的溶解度溶解度及及被分離化合物與聚酰胺被分離化合物與聚酰胺形成氫鍵能力形成氫鍵能力的大的大小的不同，決定它們?cè)谡箤舆^程中遷移的小的不同，決定它們?cè)谡箤舆^程中遷移的速度不同。速度不同。聚酰胺薄膜層析第10頁(yè)/共22頁(yè)展層過程：展層過程： 將將DNS-氨基酸點(diǎn)在聚酰胺薄膜上（固定相），氨基酸點(diǎn)在聚酰胺薄膜

4、上（固定相）， 薄膜的底端浸泡在展層劑中。展層劑（流動(dòng)相）在薄膜的底端浸泡在展層劑中。展層劑（流動(dòng)相）在 毛細(xì)管作用下向薄膜的上端移動(dòng)，毛細(xì)管作用下向薄膜的上端移動(dòng)，DNS-氨基酸隨展氨基酸隨展層劑向薄膜的上端移動(dòng)。層劑向薄膜的上端移動(dòng)。聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析第11頁(yè)/共22頁(yè)第12頁(yè)/共22頁(yè)聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析遷移率：遷移率：Rf =被分離化合物的移動(dòng)距離被分離化合物的移動(dòng)距離溶劑前沿的移動(dòng)距離溶劑前沿的移動(dòng)距離第13頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)步實(shí)驗(yàn)步驟驟第14頁(yè)/共22頁(yè)1、加樣、加樣（加樣前把試管洗干凈！加樣前把試管洗干凈?。?試管試管 1、 0.2ml Phe 溶液溶液0.2ml

5、 DNS-Cl溶液溶液 試管試管2、 0.2ml Gly 溶液溶液0.2ml DNS-Cl溶液溶液 2、薄膜封口，、薄膜封口，40C反應(yīng)反應(yīng)30min。 3、 在電爐上將在電爐上將液體蒸干。液體蒸干。 4、 各加入各加入0.1ml 1.0mol/L HCl。 制備制備DNS-氨基酸氨基酸第15頁(yè)/共22頁(yè)1、在、在DNS胰島素樣品加入等體積的胰島素樣品加入等體積的 6.0mol/L HCl，酒精燈上封口。，酒精燈上封口。2、 110C水解水解12小時(shí)。小時(shí)。老師準(zhǔn)備！老師準(zhǔn)備！DNS胰島素的水解胰島素的水解第16頁(yè)/共22頁(yè) 1、將樣品、將樣品0.1mL分別轉(zhuǎn)入分別轉(zhuǎn)入0.5ml離心管中離心管中 2、 加入等體積加入等體積乙酸乙酯乙酸乙酯，萃取，萃取2分鐘，使分鐘，使DNS-氨氨基酸進(jìn)入乙酸乙酯層?；徇M(jìn)入乙酸乙酯層。 DNS-氨基酸的萃取氨基酸的萃取第17頁(yè)/共22頁(yè)點(diǎn)點(diǎn) 樣樣注意：1、用鉛筆輕輕定位點(diǎn)樣點(diǎn)。2、點(diǎn)樣點(diǎn)距薄膜底端1.5cm第18頁(yè)/共22頁(yè)展 層展層劑：展層劑：甲酸（甲酸（88%）：水）：水=1.5 ：100（V/V） 1、展層、展層10-15分鐘，等溶劑前沿到分鐘，等溶劑前沿到達(dá)離聚酰胺薄膜頂端達(dá)離聚酰胺薄膜頂端1.0 cm 時(shí)，時(shí)，停止展層