實(shí)驗(yàn)二酵母蔗糖酶ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和酶活測(cè)定酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膎學(xué)習(xí)提取酵母蔗糖酶和測(cè)定酶活力的方法；n學(xué)習(xí)提取生物活性大分子的方法。實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)資料n資料：活性干酵母粉、石英砂；n試劑：95冰乙醇、DNS液、PBSpH7.2、n 5蔗糖溶液、1N NaOH溶液；n儀器：水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、722型分光 n 光度計(jì)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理n蔗糖酶的提取過(guò)程和酶活的測(cè)定方法；n蛋白質(zhì)等生物活性大分子的提取方法。自學(xué)提取工藝和酶活測(cè)定n蔗糖酶蔗糖酶n蔗糖酶的耐熱溫度為蔗糖酶的耐熱溫度為50度，度，45度以下可堅(jiān)持酶活度以下可堅(jiān)持酶活不變；在不變；在pH3.08.0范圍內(nèi)均可堅(jiān)持

2、較高的酶活；范圍內(nèi)均可堅(jiān)持較高的酶活；n蔗糖酶的活性中心有巰基，因此在提取時(shí)應(yīng)防止其蔗糖酶的活性中心有巰基，因此在提取時(shí)應(yīng)防止其被氧化，或者參與復(fù)原劑如被氧化，或者參與復(fù)原劑如Vc堅(jiān)持酶活力；堅(jiān)持酶活力；n酵母細(xì)胞存在兩種蔗糖酶，一種在細(xì)胞壁中，一種酵母細(xì)胞存在兩種蔗糖酶，一種在細(xì)胞壁中，一種在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，前者活力較高，分子量較大約在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，前者活力較高，分子量較大約270KDa，后者活力較低，分子量約為，后者活力較低，分子量約為KDa，兩，兩種酶的底物專注性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)非常類似，因此，種酶的底物專注性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)非常類似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶。本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶。n提取工藝提取工

3、藝n1. 破碎酵母細(xì)胞的方法：破碎酵母細(xì)胞的方法：n 蔗糖酶分子量較大，普通采用研磨法徹底破蔗糖酶分子量較大，普通采用研磨法徹底破碎細(xì)胞使其釋放出來(lái)，但應(yīng)留意研磨過(guò)程中堅(jiān)碎細(xì)胞使其釋放出來(lái)，但應(yīng)留意研磨過(guò)程中堅(jiān)持低溫防止酶失活；持低溫防止酶失活；n 或者采用自溶法適當(dāng)?shù)乃岫群蜏囟认吕没蛘卟捎米匀芊ㄟm當(dāng)?shù)乃岫群蜏囟认吕媒湍妇旧淼拿赶灯茐募?xì)胞壁，此方法較為酵母菌本身的酶系破壞細(xì)胞壁，此方法較為溫暖，但是時(shí)間較長(zhǎng)，需參與少量防腐劑，防溫暖，但是時(shí)間較長(zhǎng)，需參與少量防腐劑，防止過(guò)程中外界細(xì)菌污染；止過(guò)程中外界細(xì)菌污染；n 化學(xué)浸透法等較溫暖的非機(jī)械法?；瘜W(xué)浸透法等較溫暖的非機(jī)械法。n 原那么：低

4、溫，處置時(shí)間短，防止酶失活。原那么：低溫，處置時(shí)間短，防止酶失活。2. 選擇性熱變性： 根據(jù)蔗糖酶的耐熱性質(zhì)，將熱不穩(wěn)定性雜蛋白變性除去， 而蔗糖酶堅(jiān)持活性仍在上清液中；該法簡(jiǎn)便易行。原那么：1、選擇適宜的溫度和加熱時(shí)間，防止目的物變性， 2、溶液的蛋白質(zhì)濃度要適宜，防止蔗糖酶與雜蛋白共沉淀。3. 有機(jī)溶劑沉淀法： 根據(jù)蔗糖酶的分子量和親水性，在溶液中參與一定量的無(wú)水乙醇溶 液，利用其脫水作用，破壞了蛋白質(zhì)分子外表的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下來(lái)，而與其它雜質(zhì)分開(kāi)。普通采用分級(jí)沉淀法探求目的 物沉淀的條件。原那么：1、留意在低溫下操作，故無(wú)水乙醇要預(yù)冷； 2、邊加乙醇邊攪拌溶液，防止部分乙醇過(guò)

5、濃，導(dǎo)致酶變性失活； 3、離心后應(yīng)迅速將上清倒出，沉淀物用緩沖液溶解，防止酶與有 機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間接觸，防止其變性。n測(cè)定酶活的原理測(cè)定酶活的原理n蔗糖酶可作用于蔗糖酶可作用于1，2糖苷鍵，將蔗糖糖苷鍵，將蔗糖水解為水解為D葡萄糖和葡萄糖和D果糖；果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活劑，是其激活劑，Mn2+ 是其抑是其抑制劑。制劑。n葡萄糖和果糖具有復(fù)原性，在偏堿性條件葡萄糖和果糖具有復(fù)原性，在偏堿性條件下，可與下，可與3，5二硝基水楊酸共熱后生成二硝基水楊酸共熱后生成棕紅色物質(zhì)，在一定濃度范圍內(nèi)，復(fù)原糖棕紅色物質(zhì)，在一定濃度范圍內(nèi)，復(fù)原糖的量和反響液的顏色強(qiáng)度成正比例關(guān)系。的量

6、和反響液的顏色強(qiáng)度成正比例關(guān)系。n蔗糖酶的活力經(jīng)過(guò)其水解生成的復(fù)原糖量蔗糖酶的活力經(jīng)過(guò)其水解生成的復(fù)原糖量來(lái)反映。來(lái)反映。n n n提取酶本卷須知提取酶本卷須知n了解目的物的分子量、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，了解目的物的分子量、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，選擇適宜的提取條件；選擇適宜的提取條件；n提取過(guò)程中采用緩沖液系統(tǒng)溶解酶，并可添加提取過(guò)程中采用緩沖液系統(tǒng)溶解酶，并可添加一些維護(hù)劑如復(fù)原劑、金屬螯合劑等；一些維護(hù)劑如復(fù)原劑、金屬螯合劑等；n提取過(guò)程普通堅(jiān)持低溫、防止猛烈攪拌、強(qiáng)酸、提取過(guò)程普通堅(jiān)持低溫、防止猛烈攪拌、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等變性的要素；強(qiáng)堿等變性的要素；n普通先選擇分辨率低處置量大的方法如萃取、

7、普通先選擇分辨率低處置量大的方法如萃取、沉淀、吸附濃縮酶，再采用分辨率高的方法沉淀、吸附濃縮酶，再采用分辨率高的方法如離子交換層析、親和層析、超濾精制；如離子交換層析、親和層析、超濾精制；n經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定，調(diào)理提取條件。經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定，調(diào)理提取條件。生物活性大分子的提取方法自學(xué)書(shū)P3641實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟n反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞n 稱取稱取1g活性干酵母泥，活性干酵母泥，0.2g石英砂，置于預(yù)冷的研缽中，石英砂，置于預(yù)冷的研缽中，研磨至粉狀，參與研磨至粉狀，參與5mLPBSpH7.2，混合均勻，研磨，混合均勻，研磨5min ,20度冷凍，再研磨度冷凍，再研磨5min；n離心獲

8、得粗酶液離心獲得粗酶液n 汲取約汲取約4mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中，酵母細(xì)胞破碎液于離心管中，8000rpm 5min，保管上清液；保管上清液；粗酶液粗酶液n分別純化獲得純酶液分別純化獲得純酶液n汲取剩余的約汲取剩余的約2mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中，酵母細(xì)胞破碎液于離心管中，45度水浴度水浴10min，緩慢攪拌，迅速冰浴冷卻，緩慢攪拌，迅速冰浴冷卻， 12000rpm 5min，保管，保管上清液；上清液；選擇性熱變性除去雜蛋白選擇性熱變性除去雜蛋白n將上清液置于離心管中，參與等體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇乙醇終將上清液置于離心管中，參與等體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇乙醇終濃度約濃度約50，20度靜置度靜置15

9、20min，12000rpm 5min，保，保管沉淀物；管沉淀物；有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶n每管參與每管參與1mLPBSpH7.2于沉淀物中，悄然攪拌促溶；于沉淀物中，悄然攪拌促溶；純酶液純酶液n酶活測(cè)定酶活測(cè)定n蔗糖酶將底物水解為復(fù)原糖蔗糖酶將底物水解為復(fù)原糖試劑（均（均35度預(yù)度預(yù)熱）熱）粗酶液組粗酶液組純酶液組純酶液組測(cè)定組1對(duì)照組1測(cè)定組2對(duì)照組2酶液（mL）1.01.01.01.01N NaOH液（mL）0.50.55%蔗糖液（mL）2.02.02.02.035度水浴10min，自來(lái)水冷卻1N NaOH液（mL）0.50.52、DNS法測(cè)定復(fù)原糖量法測(cè)定復(fù)原糖量試劑粗酶液組純酶液組測(cè)定組1對(duì)照組1測(cè)定組2對(duì)照組2水解液（mL）1111蒸餾水（mL）0.50.50.50.5DNS液（mL）1.01.01.01.0沸水浴5min，自來(lái)水冷卻，稀釋至10mL，以對(duì)照組調(diào)零以對(duì)照組調(diào)零，記錄測(cè)定組OD540nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果n計(jì)算酶活力計(jì)算酶活力n 將吸光值代入實(shí)驗(yàn)一葡萄糖規(guī)范曲線，將吸光值代入實(shí)驗(yàn)一葡萄糖規(guī)范曲線，得到水解液中復(fù)原糖的毫克數(shù)得到水解液中復(fù)原糖的毫克數(shù)n 酶活力酶活力U/mL復(fù)原糖毫克數(shù)復(fù)原糖毫克數(shù)3.5水解液體積水解液體積n 蔗糖酶活力定義：在一定實(shí)