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1、實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和酶活測(cè)定酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膎學(xué)習(xí)提取酵母蔗糖酶和測(cè)定酶活力的方法;n學(xué)習(xí)提取生物活性大分子的方法。實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)資料n資料:活性干酵母粉、石英砂;n試劑:95冰乙醇、DNS液、PBSpH7.2、n 5蔗糖溶液、1N NaOH溶液;n儀器:水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、722型分光 n 光度計(jì)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理n蔗糖酶的提取過(guò)程和酶活的測(cè)定方法;n蛋白質(zhì)等生物活性大分子的提取方法。自學(xué)提取工藝和酶活測(cè)定n蔗糖酶蔗糖酶n蔗糖酶的耐熱溫度為蔗糖酶的耐熱溫度為50度,度,45度以下可堅(jiān)持酶活度以下可堅(jiān)持酶活不變;在不變;在pH3.08.0范圍內(nèi)均可堅(jiān)持
2、較高的酶活;范圍內(nèi)均可堅(jiān)持較高的酶活;n蔗糖酶的活性中心有巰基,因此在提取時(shí)應(yīng)防止其蔗糖酶的活性中心有巰基,因此在提取時(shí)應(yīng)防止其被氧化,或者參與復(fù)原劑如被氧化,或者參與復(fù)原劑如Vc堅(jiān)持酶活力;堅(jiān)持酶活力;n酵母細(xì)胞存在兩種蔗糖酶,一種在細(xì)胞壁中,一種酵母細(xì)胞存在兩種蔗糖酶,一種在細(xì)胞壁中,一種在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),前者活力較高,分子量較大約在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),前者活力較高,分子量較大約270KDa,后者活力較低,分子量約為,后者活力較低,分子量約為KDa,兩,兩種酶的底物專注性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)非常類似,因此,種酶的底物專注性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)非常類似,因此,本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶。本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶。n提取工藝提取工
3、藝n1. 破碎酵母細(xì)胞的方法:破碎酵母細(xì)胞的方法:n 蔗糖酶分子量較大,普通采用研磨法徹底破蔗糖酶分子量較大,普通采用研磨法徹底破碎細(xì)胞使其釋放出來(lái),但應(yīng)留意研磨過(guò)程中堅(jiān)碎細(xì)胞使其釋放出來(lái),但應(yīng)留意研磨過(guò)程中堅(jiān)持低溫防止酶失活;持低溫防止酶失活;n 或者采用自溶法適當(dāng)?shù)乃岫群蜏囟认吕没蛘卟捎米匀芊ㄟm當(dāng)?shù)乃岫群蜏囟认吕媒湍妇旧淼拿赶灯茐募?xì)胞壁,此方法較為酵母菌本身的酶系破壞細(xì)胞壁,此方法較為溫暖,但是時(shí)間較長(zhǎng),需參與少量防腐劑,防溫暖,但是時(shí)間較長(zhǎng),需參與少量防腐劑,防止過(guò)程中外界細(xì)菌污染;止過(guò)程中外界細(xì)菌污染;n 化學(xué)浸透法等較溫暖的非機(jī)械法?;瘜W(xué)浸透法等較溫暖的非機(jī)械法。n 原那么:低
4、溫,處置時(shí)間短,防止酶失活。原那么:低溫,處置時(shí)間短,防止酶失活。2. 選擇性熱變性: 根據(jù)蔗糖酶的耐熱性質(zhì),將熱不穩(wěn)定性雜蛋白變性除去, 而蔗糖酶堅(jiān)持活性仍在上清液中;該法簡(jiǎn)便易行。原那么:1、選擇適宜的溫度和加熱時(shí)間,防止目的物變性, 2、溶液的蛋白質(zhì)濃度要適宜,防止蔗糖酶與雜蛋白共沉淀。3. 有機(jī)溶劑沉淀法: 根據(jù)蔗糖酶的分子量和親水性,在溶液中參與一定量的無(wú)水乙醇溶 液,利用其脫水作用,破壞了蛋白質(zhì)分子外表的水化膜,使蔗糖酶 聚集沉淀下來(lái),而與其它雜質(zhì)分開(kāi)。普通采用分級(jí)沉淀法探求目的 物沉淀的條件。原那么:1、留意在低溫下操作,故無(wú)水乙醇要預(yù)冷; 2、邊加乙醇邊攪拌溶液,防止部分乙醇過(guò)
5、濃,導(dǎo)致酶變性失活; 3、離心后應(yīng)迅速將上清倒出,沉淀物用緩沖液溶解,防止酶與有 機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間接觸,防止其變性。n測(cè)定酶活的原理測(cè)定酶活的原理n蔗糖酶可作用于蔗糖酶可作用于1,2糖苷鍵,將蔗糖糖苷鍵,將蔗糖水解為水解為D葡萄糖和葡萄糖和D果糖;果糖; Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活劑,是其激活劑,Mn2+ 是其抑是其抑制劑。制劑。n葡萄糖和果糖具有復(fù)原性,在偏堿性條件葡萄糖和果糖具有復(fù)原性,在偏堿性條件下,可與下,可與3,5二硝基水楊酸共熱后生成二硝基水楊酸共熱后生成棕紅色物質(zhì),在一定濃度范圍內(nèi),復(fù)原糖棕紅色物質(zhì),在一定濃度范圍內(nèi),復(fù)原糖的量和反響液的顏色強(qiáng)度成正比例關(guān)系。的量
6、和反響液的顏色強(qiáng)度成正比例關(guān)系。n蔗糖酶的活力經(jīng)過(guò)其水解生成的復(fù)原糖量蔗糖酶的活力經(jīng)過(guò)其水解生成的復(fù)原糖量來(lái)反映。來(lái)反映。n n n提取酶本卷須知提取酶本卷須知n了解目的物的分子量、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性,了解目的物的分子量、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性,選擇適宜的提取條件;選擇適宜的提取條件;n提取過(guò)程中采用緩沖液系統(tǒng)溶解酶,并可添加提取過(guò)程中采用緩沖液系統(tǒng)溶解酶,并可添加一些維護(hù)劑如復(fù)原劑、金屬螯合劑等;一些維護(hù)劑如復(fù)原劑、金屬螯合劑等;n提取過(guò)程普通堅(jiān)持低溫、防止猛烈攪拌、強(qiáng)酸、提取過(guò)程普通堅(jiān)持低溫、防止猛烈攪拌、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等變性的要素;強(qiáng)堿等變性的要素;n普通先選擇分辨率低處置量大的方法如萃取、
7、普通先選擇分辨率低處置量大的方法如萃取、沉淀、吸附濃縮酶,再采用分辨率高的方法沉淀、吸附濃縮酶,再采用分辨率高的方法如離子交換層析、親和層析、超濾精制;如離子交換層析、親和層析、超濾精制;n經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定,調(diào)理提取條件。經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定,調(diào)理提取條件。生物活性大分子的提取方法自學(xué)書(shū)P3641實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟n反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞n 稱取稱取1g活性干酵母泥,活性干酵母泥,0.2g石英砂,置于預(yù)冷的研缽中,石英砂,置于預(yù)冷的研缽中,研磨至粉狀,參與研磨至粉狀,參與5mLPBSpH7.2,混合均勻,研磨,混合均勻,研磨5min ,20度冷凍,再研磨度冷凍,再研磨5min;n離心獲
8、得粗酶液離心獲得粗酶液n 汲取約汲取約4mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中,酵母細(xì)胞破碎液于離心管中,8000rpm 5min,保管上清液;保管上清液;粗酶液粗酶液n分別純化獲得純酶液分別純化獲得純酶液n汲取剩余的約汲取剩余的約2mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中,酵母細(xì)胞破碎液于離心管中,45度水浴度水浴10min,緩慢攪拌,迅速冰浴冷卻,緩慢攪拌,迅速冰浴冷卻, 12000rpm 5min,保管,保管上清液;上清液;選擇性熱變性除去雜蛋白選擇性熱變性除去雜蛋白n將上清液置于離心管中,參與等體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇乙醇終將上清液置于離心管中,參與等體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇乙醇終濃度約濃度約50,20度靜置度靜置15
9、20min,12000rpm 5min,保,保管沉淀物;管沉淀物;有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶n每管參與每管參與1mLPBSpH7.2于沉淀物中,悄然攪拌促溶;于沉淀物中,悄然攪拌促溶;純酶液純酶液n酶活測(cè)定酶活測(cè)定n蔗糖酶將底物水解為復(fù)原糖蔗糖酶將底物水解為復(fù)原糖試劑(均(均35度預(yù)度預(yù)熱)熱)粗酶液組粗酶液組純酶液組純酶液組測(cè)定組1對(duì)照組1測(cè)定組2對(duì)照組2酶液(mL)1.01.01.01.01N NaOH液(mL)0.50.55%蔗糖液(mL)2.02.02.02.035度水浴10min,自來(lái)水冷卻1N NaOH液(mL)0.50.52、DNS法測(cè)定復(fù)原糖量法測(cè)定復(fù)原糖量試劑粗酶液組純酶液組測(cè)定組1對(duì)照組1測(cè)定組2對(duì)照組2水解液(mL)1111蒸餾水(mL)0.50.50.50.5DNS液(mL)1.01.01.01.0沸水浴5min,自來(lái)水冷卻,稀釋至10mL,以對(duì)照組調(diào)零以對(duì)照組調(diào)零,記錄測(cè)定組OD540nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果n計(jì)算酶活力計(jì)算酶活力n 將吸光值代入實(shí)驗(yàn)一葡萄糖規(guī)范曲線,將吸光值代入實(shí)驗(yàn)一葡萄糖規(guī)范曲線,得到水解液中復(fù)原糖的毫克數(shù)得到水解液中復(fù)原糖的毫克數(shù)n 酶活力酶活力U/mL復(fù)原糖毫克數(shù)復(fù)原糖毫克數(shù)3.5水解液體積水解液體積n 蔗糖酶活力定義:在一定實(shí)
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