生物分析化學(xué)樣品處理

1、第三講第三講 生物樣品的處理生物樣品的處理生物樣品處理的主要問(wèn)題生物樣品處理的主要問(wèn)題1.組成復(fù)雜，易變2.樣品量有限3.分離純化的步驟繁多4.濃度變化范圍寬5.生物分子易失活6.難評(píng)估生物樣品預(yù)處理的基本原則 步驟少、時(shí)間短，獲得盡可能多的目標(biāo)組分通常包括以下考慮因素：1.確定要處理的生物分子的目的和要求2.掌握目標(biāo)產(chǎn)物的物理、化學(xué)以及生物學(xué)性質(zhì)3.生物材料的破碎和預(yù)處理4.分離純化方案的選擇和探索5.評(píng)價(jià)生物分子純度的檢驗(yàn)方法6.產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存。物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)的考慮1.水溶液和各種有機(jī)溶劑中的溶解性2.不同溫度、pH值和各種緩沖液中的穩(wěn)定性3.對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性

2、4.分子的大小、帶電的情況、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹(shù)脂等填料中的擴(kuò)散系數(shù)等5.對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性等6.對(duì)其他生物分子的特殊親和力7.組織及細(xì)胞內(nèi)的定位分布等。真核細(xì)胞的亞細(xì)胞器a. 動(dòng)物細(xì)胞; b. 植物細(xì)胞在顯微鏡下通過(guò)顯微操作系統(tǒng)對(duì)欲選取的材料（組織、細(xì)胞群、細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)組分或染色體區(qū)帶等）進(jìn)行切割、分離，獲取均勻性很好的目標(biāo)細(xì)胞（homogeneous cell）。激光捕獲顯微切割技術(shù)laser-capture microdissection，LCMA：大鼠子宮上皮H & E-染色的冰凍切片樣品B：人空腸Cy2-Ab抗Cytokeratin

3、上皮細(xì)胞冰凍切片樣品C：石臘包埋H & E-染色的前列腺樣品D：人血液中Giemsa-染色的白細(xì)胞樣品E：大鼠小神經(jīng)元細(xì)胞Nissl-染色的樣品F：小鼠HistoGene-染色的腎小球冰凍切片樣品細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法劇烈程度劇烈程度應(yīng)用對(duì)象應(yīng)用對(duì)象機(jī)械法機(jī)械法研磨法劇烈固體組織細(xì)胞、微生物細(xì)胞組織搗碎法（勻漿法）劇烈固體組織細(xì)胞、微生物細(xì)胞物理法物理法反復(fù)凍融法溫和細(xì)菌細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞超聲波處理法劇烈懸浮細(xì)胞壓榨法劇烈微生物細(xì)胞、含有細(xì)胞壁的細(xì)胞冷熱交替法溫和細(xì)菌細(xì)胞或病毒化學(xué)與生物化學(xué)法化學(xué)與生物化學(xué)法自溶法溫和組織及各種細(xì)胞溶脹法溫和血細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞酶解法溫和植物細(xì)胞、細(xì)

4、菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎的目的 使被分離的分子充分地釋放到溶劑中，與細(xì)胞中其它化合物和生物大分子分離，并由固相轉(zhuǎn)入液相，并盡可能保持原有的生物活性。將目標(biāo)分子從細(xì)胞內(nèi)的生理狀況轉(zhuǎn)入外界特定的溶液中的過(guò)程。 水溶液提取水溶液提取稀鹽和緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的穩(wěn)定性好、溶解度大。考慮的影響因素如下：1.鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：在低離子強(qiáng)度的溶液中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶都有較大的溶解度，此為“鹽溶”現(xiàn)象；中性鹽的濃度增加至一定時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為“鹽析”現(xiàn)象。2.pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值密切相關(guān)，一般提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)

5、和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)（pH=68），通常選擇在偏離等電點(diǎn)的pH條件。例如胰蛋白酶為堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取。（待續(xù)）3. 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在05的低溫操作。4. 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：可采用加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使這些水解酶失去活性。例如在提取DNA時(shí)加入EDTA絡(luò)合Mg2+ 使DNAase失活。5. 攪拌與氧化：采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的氧化變性失活。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸可以防止肽鏈上的巰基的氧化。（續(xù)前）有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取 一些和脂類結(jié)合

6、比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和較強(qiáng)的親脂性，因此常用來(lái)提取與脂結(jié)合較牢或含非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中。采用稀的有機(jī)溶液提取常常可以避免水解酶的破壞。例-胰島素的溶劑提取 胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但組織樣品中共存的糜蛋白酶對(duì)胰島素有極高的水解活性，因而采用6.8乙醇溶液并用草酸調(diào)溶液的pH為2.53.0，進(jìn)行提取，因?yàn)椋阂掖伎梢允姑拥鞍酌笗簳r(shí)失

7、活草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca+pH 2.53.0下糜蛋白酶活性低。 以上條件對(duì)胰島素的溶解和穩(wěn)定性都沒(méi)有影響，還可同時(shí)除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。生物大分子的分離純化 由于樣品可含有數(shù)千種乃至上萬(wàn)種生物分子同處于一個(gè)體系中，因此不可能有一個(gè)適合于各類分子的固定的一勞永逸的分離程序，但很多基本手段是相同的。為了避免盲目性，節(jié)省實(shí)驗(yàn)探索時(shí)間，要認(rèn)真參考和借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)。 常用的分離純化方法和技術(shù)有：離心法、沉淀法（包括：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等）、透析法、色譜法、等電聚焦制備電泳法等。離心分離離心分離l利用離心作用將目標(biāo)組分依據(jù)密度不同進(jìn)行分離的技術(shù)l相對(duì)離心力，RCF（重

8、力加速度的倍數(shù)）。離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速 40000 r/min時(shí)的RCF可達(dá)200000 g！l沉降系數(shù)，Swedberg單位，單位離心力作用下的沉降速度l等密度離心法，用梯度溶液形成密度梯度，粒子或分子從離心管頂部進(jìn)入與其等密度的位置時(shí)不受力；甚至可分離RNA和DNA。l用以收集細(xì)胞，細(xì)胞器，生物大分子等l分離條件溫和，但是溫度需要控制等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，因此單獨(dú)使用此法效果不理想，常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀

9、法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目標(biāo)蛋白。 生物樣品的膜分離生物樣品的膜分離l透析l半透膜（纖維素)-大分子被截留，鹽和小分子擴(kuò)散通過(guò)l截留分子量指標(biāo)l透析袋內(nèi)為保留液，外為滲出液或者透析液l用于樣品除鹽、少量有機(jī)溶劑、生物小分子等;保留液體積經(jīng)常增加（可達(dá)50%）。l超濾l加壓膜分離技術(shù)，一定壓力下小分子溶劑和溶質(zhì)透過(guò)一定孔徑的膜（乙酸纖維或硝酸纖維），而大分子不能通過(guò)l生物大分子的脫鹽，脫水和濃縮(10-50%)高豐度蛋白的去除問(wèn)題1. 使結(jié)合在白蛋白、免疫球蛋白上的低豐度蛋白質(zhì)解離出來(lái)并富集2. 使2DE圖象更加

10、清晰3. 減少2DE的斑點(diǎn)數(shù)，提高對(duì)2-DE斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確度4. 提高2-DE上低豐度蛋白質(zhì)的載容量和大分子量的蛋白質(zhì)分子的分辨率，提高低豐度蛋白質(zhì)被識(shí)別的幾率。例如例如 從血清/血漿中尋求生物標(biāo)志物的關(guān)鍵是去除樣品中占主導(dǎo)地位的高豐度蛋白質(zhì)。血清/血漿樣品中高豐度蛋白質(zhì)： 白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、-1-抗胰蛋白酶、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G等六種蛋白質(zhì)，占血清/血漿中蛋白質(zhì)質(zhì)量數(shù)的85%。 目前，從血清中除去高豐度蛋白質(zhì)的方法主要有親和柱色譜法和化學(xué)試劑除去法。全局蛋白組分析樣品的基本要求1.溶解包括疏水蛋白在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)2.防止在等電聚焦過(guò)程中蛋白質(zhì)聚積和析出3.避免制備過(guò)

11、程中可能的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾和降解4.去除或降解產(chǎn)生干擾的其它物質(zhì)5.去除高豐度或不相關(guān)的蛋白質(zhì)，提高低含量蛋白的濃度，使其達(dá)到分析檢測(cè)的要求蛋白樣品處理中經(jīng)常使用的添加劑1.變性劑（尿素，打開(kāi)氫鍵 、增溶）2.去垢劑（CHAPS，SDS等，消除疏水基團(tuán)之間的相互作用，增強(qiáng)蛋白質(zhì)在其pI值處的溶解性 ）3.兩性電解質(zhì)（減少蛋白聚合，維持其溶解性）4.還原劑（DDT，二硫蘇糖醇，用于打開(kāi)二硫鍵）5.烷基化-SH，保護(hù)其不被再氧化6.蛋白酶抑制劑（防止蛋白質(zhì)降解等）蛋白質(zhì)的分步提取法（1998年Moloy等提出）第一步，親水性蛋白用40 mmol/L Tris去離子水溶液反復(fù)凍融處理，加入適量的DNa

12、se I和RNase A第二步，親水性，中性和較疏水性的蛋白提取液中含有表面活性劑CHAPS，還原劑DDT，裂解劑Urea等第三步，疏水性蛋白裂解液中添加能夠促進(jìn)疏水蛋白質(zhì)溶解的表面活性劑SB3-10，還原劑DDT，裂解劑硫脲（thiourea）等。關(guān)于蛋白質(zhì)順序提取過(guò)程的一些建議1. 為防止降解，加入1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF，一種酶抑制劑）2. 為防止降解，建議分步提取法中的第一和第二步在4C離心，離心速度為12000g3. 為防止析出，蛋白提取過(guò)程中建議第三步在15C離心，離心速度為12000g4. 為提高雙向電泳（2DE）圖譜質(zhì)量，建議加入核酸酶：樣品中終濃度10-100 ug/

13、ml DNase-5-25 ug/ml RNase5. 第二步提取后樣品中未溶解蛋白質(zhì)已很少，減少第三步提取液用量為標(biāo)準(zhǔn)方法的一半6. 第三步提取后樣品中仍有少量未溶解蛋白質(zhì)，建議用SDS溶解后通過(guò)PAGE膠分離，膠內(nèi)酶解，LC-MS鑒定常用蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑有效抑制的酶缺點(diǎn)PMSF（很常用，使用濃度為1mM）不可逆抑制劑，抑制：1.絲氨酸水解酶2.胱氨酸水解酶在含水溶液中很快失活毒性大多肽水解蛋白抑制劑（如亮肽素leupeptin, 抑肽素pepstatin, 抑肽酶aprotinin和苯丁抑制劑bestain）亮肽素抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑肽素抑制天冬氨酸蛋白酶抑肽酶抑制許多

14、絲氨酸蛋白酶苯丁抑制劑抑制氨基酸多肽酶價(jià)格昂貴為小分子多肽，在雙向電泳結(jié)果中出現(xiàn)抑肽素pepstatin在pH為9 時(shí)不能發(fā)揮其抑制作用1 mM EDTA, 1 mM EGTA 抑制金屬蛋白酶除去影響雙向電泳的污染物污染物除雜技術(shù)樣品制備過(guò)程中帶來(lái)的鹽、殘留緩沖液和其它帶電小分子1.透析2.旋轉(zhuǎn)透析3.凝膠過(guò)濾4.沉淀/重懸法內(nèi)源性帶電小分子（核苷、代謝物、磷脂等）TCA/丙酮沉淀法核酸(DNA, RNA)1.DNase/RNase2.超速離心3.超聲多糖，脂類TCA，丙酮沉淀法不溶物離心核酸提取例-細(xì)菌培養(yǎng)液的DNA提取l培養(yǎng)液離心使細(xì)菌沉淀與試管底部；將沉淀分散在TE溶液（Tris-HCl

15、 EDTA，pH 8.0）l用SDS和蛋白酶K水浴37溫育1小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞裂解l加入NaCl和CTAB水浴65溫育20分鐘去多糖等l加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）混合液抽提；離心分離（核酸溶于上層的水相）；取水相加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，離心分離取上清液l加入RNaseA 37溫育30分鐘分解去除RNAl溫育后加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，離心取上清液中加入無(wú)水乙醇，混合靜置后得白色絮狀沉淀l取絮狀沉淀并在75%乙醇中清洗后風(fēng)干，溶于TE溶液中4 保存或者-80 長(zhǎng)期保存lUV吸收法測(cè)定純度及濃度，凝膠電泳分離RNA樣品提取流程液氮研磨分散細(xì)胞裂解水溶液抽提，離心分離酒精沉淀或者介質(zhì)吸附沉淀的離心洗滌溶解或者洗脫純度檢測(cè)對(duì)試劑及操作環(huán)境要求非常嚴(yán)格！RNA的處理過(guò)程中的降解問(wèn)題l裂解液質(zhì)量和用量l外源NRase的污染l組織裂解不充分l富含內(nèi)源性酶的樣品（脾臟，胸腺等）難以避免RNA的降解l在液氮條件下進(jìn)行組織研碎固相萃?。⊿olid Phase Extraction，SPE） 利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附從而與樣品基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。 SPE可用于氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HP