分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)主講：琚春梅主講：琚春梅Tel醫(yī)學(xué)院微生物教研室獸醫(yī)學(xué)院微生物教研室第一章第一章 RNARNA的提取和的提取和cDNAcDNA的合成的合成RT-PCRRT-PCR原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用提取總提取總RNARNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNAPCR作模板作模板獲得目的基因獲得目的基因應(yīng)用：基因檢測(cè)、基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析、應(yīng)用：基因檢測(cè)、基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析、 合成合成cDNA探針、構(gòu)建探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)一、一、RNARNA的提取的提取pRNARNA易降解，在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止易降解，在提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNARNA酶的污酶的污

2、染，并設(shè)法抑制其活性。染，并設(shè)法抑制其活性。pRNARNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚、酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚、手指、手指、試劑、容器等。試劑、容器等。采取的措施：采取的措施：1 1、全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使、全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。用一次性手套）。2 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200200烘烤烘烤2 2小小時(shí)以上。時(shí)以上。3 3、不能用高溫烘烤的材料如塑料容器、試劑等可用、不能用高溫烘烤的材料如塑料容器、試劑等可用0.1%0.1%的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(

3、DEPC)水溶液處理，然后高壓水溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的滅菌以消除殘存的DEPCDEPC 。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 1、DEPCDEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物。與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物。2 2、DEPCDEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含能與胺和巰基反應(yīng)，因而含TrisTris和和DTTDTT（二（二硫蘇糖醇）的試劑不能用硫蘇糖醇）的試劑不能用DEPCDEPC處理。處理。3 3、TrisTris溶液可用溶液可用DEPCDEPC處理的水配制然后高壓滅菌。處理的水配制然后高壓滅菌。4 4、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPCDEPC處理水配處理水配制

4、，并盡可能用未曾開封的試劑。制，并盡可能用未曾開封的試劑。 總總RNA提取方法（試劑盒）：提取方法（試劑盒）：異硫氰酸胍苯酚法（異硫氰酸胍苯酚法（Trizol 法法）原理：原理：首先用強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，同時(shí)首先用強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，同時(shí)使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋放出來(lái)的放出來(lái)的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH時(shí)溶解度不同，時(shí)溶解度不同，分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而使分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而使DNADNA和和RNARNA分離開來(lái)。進(jìn)一步通過(guò)有機(jī)溶劑來(lái)抽提沉淀分離開來(lái)。進(jìn)一步

5、通過(guò)有機(jī)溶劑來(lái)抽提沉淀RNARNA，就可以得到純凈的，就可以得到純凈的RNARNA。 二、二、cDNAcDNA的合成的合成5Buffer4ldNTPs6lRNA酶抑制劑酶抑制劑1lOligo（dT）1l隨機(jī)引物隨機(jī)引物1l反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶AMV1l提取的提取的RNA6l總體積總體積20lp反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶種類：兩種種類：兩種1、禽類成髓細(xì)胞病毒（、禽類成髓細(xì)胞病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)多肽亞基（最適溫度包括兩個(gè)多肽亞基（最適溫度4242） 活性：依賴于活性：依賴于RNARNA的的DNADNA合成，依賴于合成，依賴于DNADN

6、A的的DNADNA合成合成以及對(duì)以及對(duì)DNA:RNADNA:RNA雜交體的雜交體的RNARNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA(RNA酶酶H H活性活性) )。2 2、鼠白血病病毒、鼠白血病病毒(MLV)(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 只有單個(gè)多肽亞基（最適溫度只有單個(gè)多肽亞基（最適溫度3737） 活性：依賴于活性：依賴于RNARNA和依賴于和依賴于DNADNA的的DNADNA合成活性，但合成活性，但降解降解RNA:DNARNA:DNA雜交體中的雜交體中的RNARNA的能力較弱，且對(duì)熱的能力較弱，且對(duì)熱的穩(wěn)定性較的穩(wěn)定性較AMVAMV反轉(zhuǎn)錄酶差。反轉(zhuǎn)錄酶差。 MLVMLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長(zhǎng)

7、的反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長(zhǎng)的cDNAcDNA( (如大于如大于2-3kb)2-3kb)。 pcDNAcDNA引物引物種類：種類：1 1、隨機(jī)六聚體引物：不特異的引物隨機(jī)六聚體引物：不特異的引物 體系中所有體系中所有RNARNA分子全部充當(dāng)了分子全部充當(dāng)了cDNAcDNA第一鏈模板，第一鏈模板，PCRPCR引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的用此引物合成的cDNAcDNA中中96%96%來(lái)源于來(lái)源于rRNArRNA。 2 2、Oligo(dTOligo(dT) )：是一種對(duì)：是一種對(duì)mRNAmRNA特異的引物特異的引物絕大多數(shù)真核細(xì)胞絕大多數(shù)真

8、核細(xì)胞mRNAmRNA具有具有33端端Poly(APoly(A+)+)尾，此引尾，此引物（物（12-1812-18核苷酸）與其配對(duì)，僅核苷酸）與其配對(duì)，僅mRNAmRNA可被反轉(zhuǎn)錄?？杀环崔D(zhuǎn)錄。由于由于Poly(A+)RNAPoly(A+)RNA僅占總僅占總RNARNA的的1-4%1-4%，故此種引物合成，故此種引物合成的的cDNAcDNA比隨機(jī)六聚體引物得到的比隨機(jī)六聚體引物得到的cDNAcDNA在數(shù)量和復(fù)雜在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。性方面均要小。 3 3、特異性引物特異性引物 用含目標(biāo)用含目標(biāo)RNARNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的用

9、此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNAcDNA，導(dǎo)致更為特異，導(dǎo)致更為特異的的PCRPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。 第二章第二章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一、一、PCRPCR基本步驟基本步驟三個(gè)步驟：三個(gè)步驟：1 1、變性、變性(Denature)(Denature)：雙鏈：雙鏈DNADNA目的片段在目的片段在9494下解鏈。下解鏈。2 2、退火、退火(Anneal)(Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50(50左右左右) )下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)。下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)。3 3、延伸、延伸(Extension)(Extension)：在：

10、在TaqTaq DNA DNA聚合酶合成聚合酶合成DNADNA的最適的最適溫度溫度(72(72左右左右) )下，以目的下，以目的DNADNA為模板進(jìn)行合成。為模板進(jìn)行合成。 二、二、PCRPCR反應(yīng)中的主要成分反應(yīng)中的主要成分ddH2O32.7l10PCR Buffer5ldNTPs4lP12lP22lTaq0.3lcDNA template4lTotal50lp引物：好壞是引物：好壞是PCRPCR成敗的關(guān)鍵。成敗的關(guān)鍵。 設(shè)計(jì)原則：設(shè)計(jì)原則：1 1、引物長(zhǎng)度約為、引物長(zhǎng)度約為16-30bp16-30bp 2 2、引物中、引物中G+CG+C含量通常為含量通常為40%-60%40%-60%，粗略

11、估計(jì)引物，粗略估計(jì)引物的解鏈溫度的解鏈溫度TmTm4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)，且接近，且接近7272最好。最好。 3 3、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在、四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在33端不存在連續(xù)端不存在連續(xù)3 3個(gè)個(gè)G G或或C C，因這樣會(huì)使引物在，因這樣會(huì)使引物在G+CG+C富集序列區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤。富集序列區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤。4 4、引物、引物3-3-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。產(chǎn)生的不配對(duì)。5 5、在引物內(nèi)，尤其在、在引物內(nèi)，尤其在3-3-端應(yīng)不存

12、在二級(jí)結(jié)構(gòu)，且端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，且3-3-端盡量不用端盡量不用T T，尤應(yīng)避免連續(xù)，尤應(yīng)避免連續(xù)2 2個(gè)或個(gè)或2 2個(gè)以上個(gè)以上T T，因?yàn)橐驗(yàn)門 T引發(fā)錯(cuò)配的幾率高。引發(fā)錯(cuò)配的幾率高。6 6、兩引物之間尤其在、兩引物之間尤其在3-3-端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4 4個(gè)連個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。7 7、引物、引物5-5-端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼

13、子、缺失或插入突變位點(diǎn)等，通常應(yīng)在碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)等，通常應(yīng)在5-5-端限端限制酶位點(diǎn)外再加制酶位點(diǎn)外再加1-21-2個(gè)保護(hù)堿基。個(gè)保護(hù)堿基。 8 8、引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。引物濃度：引物濃度： 一般一般PCRPCR反應(yīng)中的引物終濃度為反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L0.2-1.0mol/L。引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過(guò)低引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過(guò)低則降低產(chǎn)量。則降低產(chǎn)量。 p4 4種三磷酸脫氧核苷酸種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP(dNTP) )：dNTPdNTP原液一般配成原液一般配成2.5-1

14、0mmol/L2.5-10mmol/L分裝，分裝，-20-20貯貯存存。一般反應(yīng)中每種一般反應(yīng)中每種dNTPdNTP的終濃度為的終濃度為20-200mol/L20-200mol/L。當(dāng)當(dāng)dNTPdNTP終濃度大于終濃度大于50mmol/L50mmol/L時(shí)可抑制時(shí)可抑制TaqTaq DNA DNA聚聚合酶的活性。合酶的活性。4 4種種dNTPdNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTPdNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。 pMgMg2+2+： MgMg2+2+濃度對(duì)濃度對(duì)TaqTaq DNA DNA聚合酶影響很大，它可影響酶聚合酶影響

15、很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度，影的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常通常MgMg2+2+濃度范圍為濃度范圍為0.5-2mmol/L0.5-2mmol/L。對(duì)于一種新的。對(duì)于一種新的PCRPCR反應(yīng)，可以用反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L0.1-5mmol/L的遞增濃度的的遞增濃度的MgMg2+2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的Mg2+Mg2+濃度。濃度。 在在PCRPCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例如磷

16、酸基團(tuán)或電荷的基團(tuán)，例如磷酸基團(tuán)或EDTAEDTA等可能影響等可能影響MgMg2+2+濃度的物質(zhì)，以保證最適濃度的物質(zhì)，以保證最適MgMg2+2+濃度。濃度。 p模板：模板：PCRPCR中模板中模板DNADNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子( (線狀分線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好) )。 就模板就模板DNADNA而言，影響而言，影響PCRPCR的主要因素是模板的數(shù)量的主要因素是模板的數(shù)量和純度。和純度。一般反應(yīng)中模板量為一般反應(yīng)中模板量為10102 2-10-10

17、5 5個(gè)拷貝。擴(kuò)增單拷貝基個(gè)拷貝。擴(kuò)增單拷貝基因，需要因，需要0.1g0.1g的人基因組的人基因組DNADNA，10ng10ng的酵母的酵母DNADNA，1ng1ng的大腸桿菌的大腸桿菌DNADNA。多拷貝基因擴(kuò)增用量更少。多拷貝基因擴(kuò)增用量更少。模板過(guò)多可能增加非特異性產(chǎn)物。模板過(guò)多可能增加非特異性產(chǎn)物。DNADNA中的雜質(zhì)也中的雜質(zhì)也會(huì)影響會(huì)影響PCRPCR的效率。的效率。 pTaqTaq DNA DNA聚合酶：聚合酶：一般一般TaqTaq DNA DNA聚合酶活性半衰期為聚合酶活性半衰期為92.5 130min92.5 130min，95 40min95 40min， 97 5min97

18、 5min。TaqTaq DNA DNA聚合酶的酶活性單位定義為聚合酶的酶活性單位定義為74 30min74 30min，摻入摻入10nmol/L dNTP10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。到核酸中所需的酶量。TaqTaq DNA DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般般PCRPCR中出錯(cuò)率為中出錯(cuò)率為2 21010-4-4核苷酸核苷酸/ /每輪循環(huán)，在利用每輪循環(huán)，在利用PCRPCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意?？寺『瓦M(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意。 所用的酶量適當(dāng)。所用的酶量適當(dāng)。酶量過(guò)多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增酶量過(guò)多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過(guò)少則使

19、產(chǎn)量降低。加，過(guò)少則使產(chǎn)量降低。反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活反應(yīng)結(jié)束后，需要滅活TaqTaq DNA DNA聚合酶。聚合酶。 滅活滅活TaqTaq DNA DNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：(1) PCR(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚產(chǎn)物經(jīng)酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀。氯仿抽提，乙醇沉淀。 (2) (2) 加入加入10mmol/L10mmol/L的的EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+ 。 (3) 99-100(3) 99-100加熱加熱10min10min。目前。目前已有直接純化已有直接純化PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的KitKit可用?？捎?。 p反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含反應(yīng)緩沖液一般含10

20、-50mmol/L Tris10-50mmol/L TrisClCl (20 (20下下pH8.3-8.8)pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的和適當(dāng)濃度的MgMg2+2+。50mmol/L50mmol/L的的KClKCl有利于引物的退火。有利于引物的退火。 加入加入5mmol/L5mmol/L的二硫蘇糖醇的二硫蘇糖醇(DTT)(DTT)或或100g/ml100g/ml的牛的牛血清白蛋白血清白蛋白(BSA)(BSA)，可穩(wěn)定酶活性；加入，可穩(wěn)定酶活性；加入T4T4噬菌體噬菌體的基因的基因3232蛋白對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)蛋白對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)DNADNA片段有利。片段

21、有利。各種各種TaqTaq DNA DNA聚合酶商品都有自己特定的緩沖液。聚合酶商品都有自己特定的緩沖液。 三、三、PCRPCR反應(yīng)參數(shù)反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性預(yù)變性94 5min變性變性退火退火延伸延伸94507230s45s1min30cycles終延伸終延伸7210minp變性變性在第一輪循環(huán)前，在在第一輪循環(huán)前，在9494下變性下變性5-10min5-10min非常重要，非常重要，它可使模板它可使模板DNADNA完全解鏈。完全解鏈。變性不完全，往往使變性不完全，往往使PCRPCR失敗，因?yàn)槲醋冃酝耆氖?，因?yàn)槲醋冃酝耆腄NADNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNADNA產(chǎn)量。產(chǎn)量

22、。一般變性溫度與時(shí)間為一般變性溫度與時(shí)間為94 1min94 1min。 在變性溫度下，雙鏈在變性溫度下，雙鏈DNADNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏厮臅r(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取６?。?duì)于富含對(duì)于富含GCGC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。 p退火退火引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成、引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度堿基組成、引物的長(zhǎng)度、引物與

23、模板的配對(duì)程度以及引物的濃度。以及引物的濃度。一般當(dāng)引物中一般當(dāng)引物中G G、C C含量高，長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全含量高，長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。產(chǎn)物的特異性越高。 實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的TmTm值約低值約低55。通常退火溫度和時(shí)間為通常退火溫度和時(shí)間為37-5537-55，1-2min1-2min。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。 p延伸

24、延伸延伸反應(yīng)通常為延伸反應(yīng)通常為7272，接近于，接近于TaqTaq DNA DNA聚合酶的最聚合酶的最適反應(yīng)溫度適反應(yīng)溫度7575。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)閷?shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aqTaq DNADNA聚合酶的作用溫度范圍可從聚合酶的作用溫度范圍可從20-8520-85。延伸時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度。延伸時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，在一般反應(yīng)體系中，TaqTaq DNA DNA聚合酶每分鐘約可合聚合酶每分鐘約可合成成2kb2kb長(zhǎng)的長(zhǎng)的DNADNA。 延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加

25、。但對(duì)很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反但對(duì)很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10-30min)(10-30min)的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。物，這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。 p循環(huán)參數(shù)循環(huán)參數(shù)一般而言，一般而言，25-3025-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)使會(huì)使PCRPCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)通常經(jīng)25-3025-30輪

26、循環(huán)后，反應(yīng)中輪循環(huán)后，反應(yīng)中TaqTaq酶已經(jīng)不足。酶已經(jīng)不足。如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的增的DNADNA樣品稀釋樣品稀釋10103 3-10-105 5倍作為模板，重新加入各倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)6060輪循環(huán)后，擴(kuò)增水輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)平可達(dá)10109 9-10-101010。 在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。

27、顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。 四、四、PCRPCR產(chǎn)物的純化產(chǎn)物的純化p酚酚/ /氯仿法氯仿法pKit法法酚酚: :氯仿氯仿: :異戊醇抽提異戊醇抽提2 2次次 PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物加加TE100TE100l混勻混勻回收水相回收水相沉淀沉淀DNADNA無(wú)水乙醇沉淀無(wú)水乙醇沉淀純化純化DNADNA75乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀

28、ddH2O ddH2O 溶解溶解DNADNA五、五、PCRPCR產(chǎn)物的克隆產(chǎn)物的克隆p利用利用T-VectorT-Vector克隆克隆TaqTaq DNA DNA聚合酶會(huì)在聚合酶會(huì)在3-3-端加上多余的非模板依賴端加上多余的非模板依賴堿基，而且對(duì)堿基，而且對(duì)A A優(yōu)先聚合，所以優(yōu)先聚合，所以PCRPCR產(chǎn)物末端的多產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是余堿基大部分都是A A。利用這一特點(diǎn)，可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端利用這一特點(diǎn)，可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上用酶加上dTdT或或ddTddT，使載體與，使載體與PCRPCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接。進(jìn)行連接。 p粘性末端連接粘性末端連接

29、 利用引物中附加在利用引物中附加在55端的限制酶位點(diǎn)，直接將端的限制酶位點(diǎn)，直接將PCRPCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與載體連接，產(chǎn)生重組載體連接，產(chǎn)生重組DNADNA。如果上、下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶如果上、下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。位點(diǎn)，經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。 第三章第三章 DNADNA酶切及凝膠電泳酶切及凝膠電泳 一、一、DNADNA的限制性內(nèi)切酶分析的限制性內(nèi)切酶分析p類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為識(shí)別長(zhǎng)度為4 4至至6 6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異

30、核苷酸序列。酸序列。類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的處切割，產(chǎn)生平末端的DNADNA片段。片段。 如，如，SmaSma：5-CCCGGG-35-CCCGGG-3有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的末端的DNADNA片段稱粘性未端。片段稱粘性未端。 如，如，EcoREcoR切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5p酶切反應(yīng)酶切反應(yīng)單酶切：各種酶緩沖液、反應(yīng)溫度不同

31、單酶切：各種酶緩沖液、反應(yīng)溫度不同 如，如，BamH反應(yīng)溫度為反應(yīng)溫度為3030雙酶切：緩沖液不同，反應(yīng)溫度為雙酶切：緩沖液不同，反應(yīng)溫度為3737。 若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。度的限制性內(nèi)切酶水解。 酶切時(shí)保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)酶切時(shí)保護(hù)堿基的個(gè)數(shù)二、瓊脂糖凝膠電泳二、瓊脂糖凝膠電泳p瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖主要在糖主要在DNADNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，制備電泳中作

32、為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。其密度取決于瓊脂糖的濃度。 p瓊脂糖凝膠分離瓊脂糖凝膠分離DNADNA片度大小范圍較廣，不同濃度片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度200bp200bp至至50kb50kb的的DNADNA片段。片段。p瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。下電泳。 p在電場(chǎng)中，帶負(fù)電荷的在電場(chǎng)中，帶負(fù)電荷的DNADNA向陽(yáng)極遷移，其遷移速向陽(yáng)極遷移，其遷移速率由多種因素決定：率由多種因素決定：DNADNA的分子大小的分子大小 線狀雙鏈線狀雙鏈DNADNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的

33、遷分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與移速率與DNADNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。移得越慢。 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 一個(gè)給定大小的線狀一個(gè)給定大小的線狀DNADNA分子，其遷移速度在不同分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNADNA電泳遷移率的電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。 DNA大小大小凝膠濃度凝膠濃度0.5kb1.21.50.5kb 10kb0.81.010kb0.30.7DNA

34、DNA分子的構(gòu)象分子的構(gòu)象 相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNADNA在瓊脂糖凝在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNADNA移動(dòng)最快，移動(dòng)最快，而線狀雙鏈而線狀雙鏈DNADNA移動(dòng)最慢。移動(dòng)最慢。電源電壓電源電壓 在低電壓時(shí)，線狀在低電壓時(shí)，線狀DNADNA片段的遷移速率與所加電片段的遷移速率與所加電壓成正比。電壓增加時(shí)，瓊脂糖凝膠的有效分離壓成正比。電壓增加時(shí)，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。范圍將縮小。離子強(qiáng)度影響離子強(qiáng)度影響 在沒(méi)有離子時(shí)在沒(méi)有離子時(shí)( (如誤用蒸餾水配制凝膠如誤用蒸餾水配制凝膠) )，電導(dǎo)率，電導(dǎo)率最小

35、，最小，DNADNA幾乎不移動(dòng)。幾乎不移動(dòng)。 在高離子強(qiáng)度時(shí)在高離子強(qiáng)度時(shí)( (如誤加如誤加1010電泳緩沖液配制凝電泳緩沖液配制凝膠膠) )，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或熔化或DNADNA變性。變性。 第四章第四章 其它工具酶其它工具酶一、連接酶（連接反應(yīng)）一、連接酶（連接反應(yīng)）p類型與用途類型與用途1 1、T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 催化相鄰催化相鄰DNADNA鏈的鏈的5-P5-P末端和末端和3-OH3-OH末端之間末端之間形成磷酸二酯鍵。它不僅可以催化粘性末端形成磷酸二酯鍵。它不僅可以催化粘性末端DNADNA之間的連接，也

36、可以催化平滑末端之間的連接，也可以催化平滑末端DNADNA之間的連之間的連接。接。 用途：（用途：（1 1）DNADNA片斷和載體片斷和載體DNADNA的連接。的連接。 （2 2）DNADNA片斷和片斷和Linker DNALinker DNA的連接。的連接。 2 2、大腸桿菌、大腸桿菌DNADNA連接酶連接酶 催化相鄰催化相鄰DNADNA鏈的鏈的5-P5-P末端和末端和3-OH3-OH末端之間形末端之間形成磷酸二酯鍵。一般只能催化突出末端成磷酸二酯鍵。一般只能催化突出末端DNADNA之間的之間的連接，如果要催化平滑末端連接，如果要催化平滑末端DNADNA之間的連接反應(yīng)，之間的連接反應(yīng)，需要有

37、需要有PEGPEG及高濃度一價(jià)陽(yáng)離子的存在。及高濃度一價(jià)陽(yáng)離子的存在。用途：（用途：（1 1）DNADNA片斷和載體片斷和載體DNADNA的連接。的連接。 （2 2）DNADNA片斷和片斷和Linker DNALinker DNA的連接。的連接。 p連接要求與結(jié)果連接要求與結(jié)果外源外源DNADNA片段末端性質(zhì)片段末端性質(zhì)連接要求連接要求連接結(jié)果連接結(jié)果不對(duì)稱粘性末端不對(duì)稱粘性末端兩種限制酶消兩種限制酶消化后，需純化化后，需純化載體以提高連載體以提高連接效率接效率載體與外源載體與外源DNADNA連接處的限制酶切位點(diǎn)連接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?；非重組克隆的背景較低；外?？杀Ａ?；非重組克隆的背景較

38、低；外源源DNADNA可以定向插入到載體中?？梢远ㄏ虿迦氲捷d體中。對(duì)稱性粘性末端對(duì)稱性粘性末端線形載體線形載體DNADNA常需磷酸酶去常需磷酸酶去磷酸化處理磷酸化處理載體與外源載體與外源DNADNA連接處的限制酶切位點(diǎn)連接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源?？杀Ａ簦恢亟M質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNADNA的的串聯(lián)拷貝；外源串聯(lián)拷貝；外源DNADNA會(huì)以兩個(gè)方向插入會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體中。到載體中。平端平端要求高濃度的要求高濃度的DNADNA和連接酶和連接酶載體與外源載體與外源DNADNA連接處的限制酶切位點(diǎn)連接處的限制酶切位點(diǎn)可能消失；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源可能消失；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNADN

39、A的的串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高 。p反應(yīng)體系（反應(yīng)體系（ 20l ）載體載體DNA 1l外源外源DNA 3l10T4 DNA Ligation Buffer 2lT4 DNA Ligase 1lddH2O 13l載體載體DNADNA與外源與外源DNADNA的摩爾比通常為的摩爾比通常為1 13 3左右。左右。反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：16 8-14h16 8-14h，通常過(guò)夜即可。，通常過(guò)夜即可。 二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應(yīng)）二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應(yīng)）p類型：類型： SAPSAP（蝦的堿性磷酸酶）、（蝦的堿性磷酸酶）、BAPBAP（大腸桿菌（大腸桿菌C75C7

40、5堿堿性磷酸酶）、性磷酸酶）、CIAPCIAP（小牛腸堿性磷酸酶），其中（小牛腸堿性磷酸酶），其中BAPBAP、CIAPCIAP應(yīng)用最廣泛。應(yīng)用最廣泛。 p用途：用途： 去除載體去除載體DNA 5-DNA 5-末端的磷酸基團(tuán)，防止自身環(huán)末端的磷酸基團(tuán)，防止自身環(huán)化反應(yīng)?；磻?yīng)。 p反應(yīng)體系（反應(yīng)體系（ 50l l ）載體載體DNA 20l10Alkaline Phosphate Buffer 5lAlkaline Phosphatase 2lddH2O 23l反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：5-突出端突出端37 30min，對(duì)于平末端及，對(duì)于平末端及5-凹端使用凹端使用BAP 應(yīng)在應(yīng)在5560條件下反應(yīng)。

41、條件下反應(yīng)。 三、三、DNADNA聚合酶（補(bǔ)平反應(yīng)）聚合酶（補(bǔ)平反應(yīng)）p類型與用途類型與用途1 1、KlenowKlenow Fragment Fragment（大腸桿菌（大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I大片斷）大片斷）具有具有5353的的DNADNA聚合酶活性，對(duì)于單鏈聚合酶活性，對(duì)于單鏈DNADNA具有具有3535的外切核酸酶活性，但較弱。的外切核酸酶活性，但較弱。用途：雙鏈用途：雙鏈DNA5-DNA5-突出端的平滑化。突出端的平滑化。2 2、T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶具有具有5353的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3535的外切的外切核酸酶活性，且后者比核酸酶活性

42、，且后者比KlenowKlenow Fragment Fragment外切核酸外切核酸酶活性高酶活性高10010010001000倍。倍。用途：雙鏈用途：雙鏈DNA5-DNA5-突出端和雙鏈突出端和雙鏈DNA3-DNA3-突出端的突出端的平滑化。平滑化。p反應(yīng)體系：（反應(yīng)體系：（2020l l）DNA 5-突出端突出端 12l10Buffer 2lKlenow Fragment 1ldNTPs 0.5lddH2O 4.5l雙鏈雙鏈DNA3-DNA3-突出端的平滑化反應(yīng)不需加突出端的平滑化反應(yīng)不需加dNTPsdNTPs即可。即可。反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：37 30min37 30min 第五章第五章

43、 感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化p受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它可以容忍外源可以容忍外源DNADNA分子進(jìn)入其體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給分子進(jìn)入其體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。后代。p受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法( (如電擊法，如電擊法，CaClCaCl2 2，KClKCl等化學(xué)試劑法等化學(xué)試劑法) )的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNADNA分子進(jìn)入分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent(Compenent cells)

44、 cells)。 p轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(Transformation)(Transformation)是將外源是將外源DNADNA分子引入受體分子引入受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。細(xì)胞，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。p為了提高轉(zhuǎn)化效率，要考慮幾個(gè)重要因素：為了提高轉(zhuǎn)化效率，要考慮幾個(gè)重要因素：1 1、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于44的培養(yǎng)菌，最好從的培養(yǎng)菌，最好從7070或或-20-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通細(xì)胞生長(zhǎng)密

45、度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 OD600 來(lái)控制。來(lái)控制。DH5DH5菌株的菌株的OD600 OD600 為為0.50.5時(shí)，細(xì)胞密度在時(shí)，細(xì)胞密度在5 510107 7 個(gè)個(gè)/ml/ml左右左右( (不同的菌株情況有所不同不同的菌株情況有所不同) )，這時(shí)比較，這時(shí)比較合適。合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 2 2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度： 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNADNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNADNA。轉(zhuǎn)化效率與外源轉(zhuǎn)化效率與外源DNADNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，的濃度在一

46、定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源但當(dāng)加入的外源DNADNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。效率就會(huì)降低。一般情況下，一般情況下，DNADNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的體積的5%5%。 3 3、試劑的質(zhì)量：試劑的質(zhì)量： 所用的試劑，如所用的試劑，如CaCl2 CaCl2 等均需是最高純度的等均需是最高純度的(GR.(GR.或或AR.)AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。的冷暗處。4 4、防止雜菌和雜、防止雜菌和雜DNADNA的污染：的污染： 整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，

47、所用器皿，整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，如離心管，tiptip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌。理，所有的試劑都要滅菌。 第六章第六章 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取質(zhì)粒載體的特性質(zhì)粒載體的特性p質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid)(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從大小從1-200kb1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNADNA分子，分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。p質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中質(zhì)粒具有自主

48、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。p質(zhì)粒的不相容性：質(zhì)粒的不相容性：利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在。不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在。 p理想的克隆載體的特性：理想的克隆載體的特性：1 1、分子量小、多拷貝、松馳控制型、分子量小、多拷貝、松馳控制型2 2、具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)、具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)3 3、能插入較大的外源、能插入較大的外源DNADNA片段片段4 4、具有容易操作的檢測(cè)表型。、具有容易操作的檢測(cè)表型。 p常用的質(zhì)粒載體大小一般在

49、常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb1kb至至10kb10kb之間，如之間，如pBR322pBR322、pUCpUC系列、系列、PGEMPGEM系列和系列和pBluescriptpBluescript（簡(jiǎn)（簡(jiǎn)稱稱pBSpBS）等。）等。 質(zhì)粒分離的基本步驟質(zhì)粒分離的基本步驟1 1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增2 2、收集和裂解細(xì)胞、收集和裂解細(xì)胞 采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，SDSSDS和和Triton X-Triton X-100100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)處理后，細(xì)菌染色體可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)處理后，細(xì)菌染色體DNADNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體

50、會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNADNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。而被切斷成不同大小的線性片段。 當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNADNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條鏈不會(huì)相互分開，變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNADNA片段難以片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒起，而質(zhì)粒DNADNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新

51、形成天然的雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。 3 3、分離和純化質(zhì)粒、分離和純化質(zhì)粒DNADNAp在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNADNA外，還會(huì)產(chǎn)生外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒其它形式的質(zhì)粒DNADNA。p如果質(zhì)粒如果質(zhì)粒DNADNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNADNA。p如果質(zhì)粒如果質(zhì)粒DNADNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNADNA。 質(zhì)粒的提?。▔A裂解法）質(zhì)粒的提取（堿裂解法）試劑配制：試劑配制：p溶液溶液：50 mmol50 mmol/L /L 葡萄糖，葡萄糖，25 mmol