實(shí)驗(yàn)5_葉綠體色素的測(cè)定和分析

1、提取葉綠素葉綠素的物理性質(zhì)葉綠素的化學(xué)性質(zhì)葉綠素含量的測(cè)定 2.1 用含水的有機(jī)溶劑提取葉綠素 2.2 葉綠素的物理性質(zhì) 吸收光譜 熒光現(xiàn)象 2.3 葉綠素的化學(xué)性質(zhì) 取代反應(yīng) 皂化反應(yīng) 葉綠素分子含有一個(gè)卟啉環(huán)的“頭部”和一個(gè)葉綠醇的“尾巴” 親水的“頭部”：鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，帶正電性，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負(fù)電性，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合 親脂的“尾巴”：葉醇是由四個(gè)異戊二烯單位組成的雙萜，是一個(gè)親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性1) 吸收光譜2) 熒光現(xiàn)象3) 含量測(cè)定2) 熒光現(xiàn)象葉綠素溶液的透射光呈綠色，其反射光呈紅色的現(xiàn)象。葉綠素a、b在紅光區(qū)的最大

2、吸收峰分別位于663 nm 和645 nm；葉綠素a、b在652 nm處有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），測(cè)OD652求出葉綠素a、b總量。故葉綠素濃度 COD652 / 34.5 ( mg/ml )葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素的濃度提取液體積稀釋倍數(shù)/樣品鮮重 Chl: 強(qiáng)吸收區(qū): 640-700nm(紅) & 400-500nm(藍(lán)紫); 不吸收區(qū): 500-600nm (呈綠） Carotene: 強(qiáng)吸收區(qū): 400-500 (藍(lán)紫); 不吸收區(qū)：500以上（呈黃色或棕色）不用藍(lán)光區(qū)，用652 nm1) 葉綠素的結(jié)構(gòu)2) 取代反應(yīng)3) 皂化反應(yīng) 葉綠素a與b很相似，不同之

3、處僅在于Chla第二個(gè)吡咯環(huán)上的一個(gè)甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。 稀酸 去鎂 銅代 濃酸 去鎂 水解卟啉環(huán)中的Mg處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等離子取代。 稀酸 葉綠素溶液與稀酸作用，H+取代Mg后的產(chǎn)物為褐色的去鎂葉綠素； 去鎂葉綠素與Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等離子取代后的產(chǎn)物為銅代葉綠素等，深綠色； 濃酸 葉綠素溶液與濃酸作用，除了代換Mg外，可使去鎂葉綠素迅速分解出葉綠醇，并形成去鎂葉綠酸，呈褐綠色。葉綠素去鎂葉綠素銅代葉綠素（穩(wěn)定而不易降解，常用醋酸銅處理來(lái)保存綠色植物標(biāo)本） 葉綠酸是二羧酸，其中一個(gè)羧基被甲醇酯化，另一個(gè)被葉綠

4、醇酯化。葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應(yīng)。 葉綠素與堿皂化的鹽能溶于水，極性增大。葉綠素的鹽形成以后，因分子極性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能進(jìn)入苯層而類胡蘿卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中一部分苯分散在水中形成乳膠體，出現(xiàn)一層乳白色的溶液低溫下發(fā)生皂化反應(yīng)的葉綠體色素溶液，易乳化而出現(xiàn)白色絮狀物，溶液渾濁，且不分層 （1）材料 菠菜葉片（2）儀器設(shè)備 研缽，漏斗，剪刀，試管，試管夾，容量瓶，分光光度計(jì)，水浴鍋等（3）試劑 95%乙醇，苯，濃鹽酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂新鮮菠菜葉片，剪碎成小塊（去掉中脈）混勻；2. 稱取剪碎的樣品3 g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸

5、鎂粉及2-3 ml的95%乙醇，研磨勻漿，再加乙醇混勻；3. 過(guò)濾到25 ml容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)詈筮B同殘?jiān)黄疬^(guò)濾（ 直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止）最后用乙醇定容至25ml，搖勻。4 實(shí)驗(yàn)步驟 取3 ml葉綠素提取原液，觀察其透射光、反射光的顏色； 取5 ml葉綠素溶液移入50 ml容量瓶，用乙醇定容。 1) 葉綠素吸收光譜 以95%乙醇作為空白對(duì)照，在400-700 nm之間，每隔20 nm讀OD值，然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D為縱坐標(biāo)作圖 2) 葉綠素含量（提取的原液稀釋10倍后進(jìn)行）測(cè)定 以95%乙醇作為空白對(duì)照，測(cè)OD652 1) 取代反應(yīng) 稀酸： 取5 ml葉綠

6、素原液，一滴滴加入醋酸，觀察顏色變化； 向上述加醋酸的葉綠素溶液中加少量CuAc顆粒，65水浴加熱，觀察其顏色變化。 濃酸 取5 ml葉綠素原液，一滴滴加入濃鹽酸，觀察顏色變化。 2) 皂化反應(yīng) 取3 ml葉綠素原液，加1 ml 20% NaOH-甲醇溶液，搖勻， 65水浴5 min； 取出冷卻后，先加3 ml苯，再加3 ml水（沿壁慢慢加入），輕輕搖勻，靜置觀察其分層現(xiàn)象。處 理 顏色變化/分層 原 理熒光現(xiàn)象醋酸CuAc濃HCl皂化反應(yīng)5 結(jié)果記錄與數(shù)據(jù)處理5.1 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象記錄葉綠素的理化性質(zhì)5.2 繪制葉綠素吸收光譜曲線5.3 葉綠素含量計(jì)算公式葉綠素的含量（mg / g）= 葉綠素的濃

7、度體積稀釋倍數(shù)/樣品鮮重 (OD652 / 34.5)(2550 / 5 ) 10-3/3v操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行 ？v研磨時(shí)間盡可能短，以不超過(guò)2分鐘為宜v分光光度計(jì)的正確使用(更換波長(zhǎng)后要調(diào)0)v皂化反應(yīng)最后做v 在低溫下發(fā)生皂化反應(yīng)的葉綠體色素溶液，易乳化而出現(xiàn)白絮狀物，溶液渾濁，且不分層。可激烈搖勻，放在30-40的水浴中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。 提取時(shí)為何要加入MgCO3？為何選用652 nm 測(cè)葉綠素的含量？解釋皂化反應(yīng)的分層現(xiàn)象。 4.2 葉綠素的熒光 取3 ml葉綠素提取原液，觀察其透射光、反射光的顏色； 4.3.1 葉綠素吸收光譜 以95%乙醇作為空白對(duì)照，在400-700 nm之間，每隔20 nm讀OD值，然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D為縱坐標(biāo)作圖 4.3.2 葉綠素含量測(cè)定:以95%乙醇為空白，測(cè)OD652(理論上是峰，將曲線峰附近20nm細(xì)分） 4.4.1 取代反應(yīng) 4.4.1.1 稀酸： 取5 ml葉綠素原液，一滴滴加入醋酸，觀察顏色變化； 向上述加醋酸的葉綠素溶液中加少量CuAc顆粒，65水浴加熱10 min，觀察其顏色變化。 4.4.1.2 濃酸 取5 ml葉綠素原液，一滴滴加