大豆脲酶提取與動(dòng)力學(xué)研究-袁永澤-2010-04-14

1、大豆脲酶大豆脲酶制備制備與與動(dòng)力學(xué)研究動(dòng)力學(xué)研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室指導(dǎo)教師：袁永澤指導(dǎo)教師：袁永澤生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握掌握脲酶提取脲酶提取的基本方法的基本方法2、掌握脲酶掌握脲酶活性檢測(cè)活性檢測(cè)方法方法3、掌握脲酶動(dòng)力學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)原理掌握脲酶動(dòng)力學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)原理 作圖法作圖法求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)( (Km、Vmax) )4、理解理解底物濃度底物濃度、pH以及以及抑制劑抑制劑對(duì)酶對(duì)酶Km 的影響、利用作圖法判斷抑制類型的影響、利用作圖法判斷抑制類型二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理1 1、脲酶（、脲酶（urease）的基本

2、）的基本生化性質(zhì)生化性質(zhì) 脲酶廣泛分布于植物種子中，也存在于某些微生物中。脲酶廣泛分布于植物種子中，也存在于某些微生物中。 刀豆刀豆、大豆大豆、黃豆中含量豐富。、黃豆中含量豐富。 脲酶催化脲的水解反應(yīng)，專一性高，生成氨與脲酶催化脲的水解反應(yīng)，專一性高，生成氨與CO2。 脲酶為脲酶為寡聚酶寡聚酶， 分子量約為分子量約為483 KD, 等電點(diǎn)為等電點(diǎn)為4.8, 最適最適pH 7.0。 Km與來源及測(cè)定條件與來源及測(cè)定條件 有關(guān)，參見有關(guān)，參見表表1。UreaseUrease crystals crystals ( X 728)( X 728)Sumner, J. B. (1926) Sumner,

3、 J. B. (1926) “ The isolation and The isolation and crystallization of the crystallization of the enzyme enzyme ureaseurease”J. Biol. J. Biol. Chem.Chem.69:43569:435- -441.441.表表1 脲酶脲酶Km與與來源來源、測(cè)定條件的關(guān)系、測(cè)定條件的關(guān)系二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理2 2、脲酶活性測(cè)定原理、脲酶活性測(cè)定原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最適反應(yīng)脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最適反應(yīng)pH 7.0。反應(yīng)式：反應(yīng)式：（NH2

4、)2CO + H2O 2 NH3 + CO2 氨與氨與奈氏試劑奈氏試劑反應(yīng)生成反應(yīng)生成黃色黃色配合物配合物，其吸光度與氨濃度，其吸光度與氨濃度成正比。故可以測(cè)定脲酶活力的大小。反應(yīng)式：成正比。故可以測(cè)定脲酶活力的大小。反應(yīng)式： NH3H2O + 2K2HgI4 + 3KOH HgOHgNH2I + 7KI + 3H2O （納氏試劑）（納氏試劑） （碘化氨氧合汞）（碘化氨氧合汞）奈氏試劑法試劑昂貴奈氏試劑法試劑昂貴但較為精確但較為精確三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1. 粉碎機(jī)、試管、燒杯、離心機(jī)粉碎機(jī)、試管、燒杯、離心機(jī)(離心管離心管)、分光光度計(jì)等。、分光光度計(jì)等。2. 脲酶提取液脲酶提

5、取液（粗酶液）（粗酶液），使用時(shí)可以磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋。，使用時(shí)可以磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋。3. 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)脲脲（尿素）溶液：（尿素）溶液：0.01, 0.02, 0.04, 0.08 mol/L。 3%脲的磷酸鹽溶液（脲的磷酸鹽溶液（5.4%磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉- 4.25%磷酸二氫鉀）磷酸二氫鉀）4. 磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（PBS, pH7.0）：）：0.1, 0.4, 0.8 mol/L。5. Tris-H2SO4緩沖液：緩沖液：50 mmol/L, pH 5, 6, 7, 8, 9。6. 標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液：標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液：40 mmol/L（即（即40 m mmol/ml）7. 奈氏試劑

6、：配制方法參見教材；注意奈氏試劑：配制方法參見教材；注意離心取上清離心取上清，避光儲(chǔ)避光儲(chǔ) 于棕色瓶中于棕色瓶中備用。備用。8. 人造沸石、人造沸石、2%乙酸、乙酸、32%丙酮丙酮9. 10%（W/V）三氯乙酸（三氯乙酸（沉淀蛋白、終止酶反應(yīng)！沉淀蛋白、終止酶反應(yīng)?。?、脲酶的提取脲酶的提取 稱取稱取5 g人造沸石，置小燒杯中，用人造沸石，置小燒杯中，用2%乙酸浸泡兩次，傾乙酸浸泡兩次，傾 去酸，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，瀝干備用。去酸，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，瀝干備用。 稱取稱取10 g新鮮大豆粉，置于錐形瓶中，加上述人造沸石，新鮮大豆粉，置于錐形瓶中，加上述人造沸石， 再加入再加入50 ml

7、 32%丙酮溶液，丙酮溶液，冰浴中冰浴中持續(xù)搖動(dòng)持續(xù)搖動(dòng)15-20 min， 4、10,000 rpm離心離心15 min，收集收集上清液上清液備用。備用。 向中沉淀加入向中沉淀加入10 ml 32%丙酮溶液，重懸，復(fù)抽提一丙酮溶液，重懸，復(fù)抽提一 次（操作同上），兩次上清合并，即為粗酶液。次（操作同上），兩次上清合并，即為粗酶液。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與操作步驟四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與操作步驟2、脲酶活性的測(cè)定脲酶活性的測(cè)定 試管號(hào)試管號(hào)步步 驟驟123（1）酶液（）酶液（mL，原液或適當(dāng)稀釋），原液或適當(dāng)稀釋）001.00（2）標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（）標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（mL）00.300（3）蒸餾水（）蒸餾水（mL）

8、2.001.701.00（4）10% 三氯乙酸三氯乙酸 (mL)1.001.000（5）室溫平衡）室溫平衡5 min。（6）3%尿素（尿素（mL）1.001.001.00（7）從樣品管加尿素開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)）從樣品管加尿素開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，立即向樣品管（，立即向樣品管（3號(hào)管）加號(hào)管）加10%三氯乙酸三氯乙酸 1.00 mL，終止反應(yīng)。各管搖勻后，取，終止反應(yīng)。各管搖勻后，取1.0 ml溶液置于溶液置于EP管中，室溫、管中，室溫、10,000 rpm離心離心 5 min，吸取，吸取0.2 ml上清按步驟（上清按步驟（8）進(jìn)行反應(yīng)。）進(jìn)行反應(yīng)。（8）另?。┝砣?支潔凈的試管，分別對(duì)

9、應(yīng)于上述各管，進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。支潔凈的試管，分別對(duì)應(yīng)于上述各管，進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。 反應(yīng)液（反應(yīng)液（mL） 蒸餾水（蒸餾水（mL） 奈氏試劑（奈氏試劑（mL）0.204.300.500.204.300.500.204.300.50（9）各管混勻后）各管混勻后30 min內(nèi)，用分光光度計(jì)內(nèi)，用分光光度計(jì)F1800測(cè)試：測(cè)試：比色記錄比色記錄A480nmA1A2A3 結(jié)果與分析結(jié)果與分析脲酶活力（脲酶活力（U/ml）=式中：式中：n為酶樣品的稀釋倍數(shù)為酶樣品的稀釋倍數(shù)請(qǐng)思考下面三個(gè)問題，請(qǐng)思考下面三個(gè)問題，這對(duì)保證本實(shí)驗(yàn)的完成質(zhì)量很重要這對(duì)保證本實(shí)驗(yàn)的完成質(zhì)量很重要! 根據(jù)上述計(jì)算公式，脲酶根據(jù)上述計(jì)算

10、公式，脲酶活力單位活力單位如何定義？如何定義？ 你認(rèn)為上述實(shí)驗(yàn)獲得的脲酶活性數(shù)據(jù)你認(rèn)為上述實(shí)驗(yàn)獲得的脲酶活性數(shù)據(jù)嚴(yán)格嗎嚴(yán)格嗎？如果不夠？如果不夠 嚴(yán)格，你認(rèn)為應(yīng)如何嚴(yán)格，你認(rèn)為應(yīng)如何改進(jìn)實(shí)驗(yàn)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)? ? 在測(cè)活操作中，是否有因素在測(cè)活操作中，是否有因素影響結(jié)果的準(zhǔn)確度影響結(jié)果的準(zhǔn)確度？如有不？如有不 利因素，應(yīng)利因素，應(yīng)如何克服如何克服？nAANHAA酶樣品毫升數(shù)微摩爾數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管中的min5)()(123133 3、脲酶動(dòng)力學(xué)研究、脲酶動(dòng)力學(xué)研究 底物濃度對(duì)脲酶反應(yīng)速度的影響底物濃度對(duì)脲酶反應(yīng)速度的影響Km和和Vm的測(cè)定的測(cè)定原理：酶的原理：酶的Km和和Vm是酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)重要參數(shù)。是酶反應(yīng)動(dòng)力

11、學(xué)重要參數(shù)。 Km是酶的特征常數(shù)（是酶的特征常數(shù)（與反應(yīng)條件有關(guān)與反應(yīng)條件有關(guān)）。）。 利用不同底物濃度利用不同底物濃度S下測(cè)得的反應(yīng)速度下測(cè)得的反應(yīng)速度v,以以S/v對(duì)對(duì) S作圖，或以雙倒數(shù)作圖，可測(cè)定脲酶的作圖，或以雙倒數(shù)作圖，可測(cè)定脲酶的Km和和Vm。 O-KmSvS mmVKSKmSVmvSKmVmSv1SVVKvSmmm斜率斜率= 1/Vm 這里，需準(zhǔn)備另外這里，需準(zhǔn)備另外6只潔凈的試管。只潔凈的試管。 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 將測(cè)定結(jié)果列表：將測(cè)定結(jié)果列表： 以以S/v對(duì)對(duì)S作圖，求取作圖，求取Km和和Vm。思考：上述動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求取在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上思考：上述動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求取在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上

12、是否嚴(yán)密是否嚴(yán)密？ 若不夠嚴(yán)密，請(qǐng)你提出改進(jìn)的方案。若不夠嚴(yán)密，請(qǐng)你提出改進(jìn)的方案。編號(hào)編號(hào)1234空白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管A480A標(biāo)標(biāo)-A空空A樣樣-A空空VSS/v pH對(duì)脲酶催化速度的影響對(duì)脲酶催化速度的影響取取7只干燥試管，標(biāo)以只干燥試管，標(biāo)以1-7序號(hào)。在序號(hào)。在1-5管中各加入管中各加入0.5毫升毫升0.1M脲溶液，再分別加入脲溶液，再分別加入1毫升毫升0.1M的的pH5，pH6，pH7，pH8，pH9的的Tris-硫酸緩沖液，室溫平衡硫酸緩沖液，室溫平衡5分鐘后，分別分鐘后，分別加入加入0.5毫升酶溶液，混勻。再于室溫反應(yīng)毫升酶溶液，混勻。再于室溫反應(yīng)5分鐘，然后在分鐘，然后在

13、各管立即加入各管立即加入0.5毫升毫升10%三氯乙酸，終止反應(yīng)，混勻，三氯乙酸，終止反應(yīng)，混勻，按前法取出按前法取出1.0 ml離心，取一定體積的上清與奈氏試劑顯離心，取一定體積的上清與奈氏試劑顯色。色。6號(hào)管加入號(hào)管加入0.3毫升標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，毫升標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，7號(hào)管加入號(hào)管加入0.5毫毫升升H2O作為空白，作為空白，6、7號(hào)管各加號(hào)管各加1毫升毫升H2O代替代替Tris硫酸硫酸緩沖液。室溫平衡、加酶液等操作與緩沖液。室溫平衡、加酶液等操作與15號(hào)管同時(shí)進(jìn)行。號(hào)管同時(shí)進(jìn)行。分別由各管吸取分別由各管吸取0.2毫升反應(yīng)液依次加入另毫升反應(yīng)液依次加入另17各管中，各管中，各加各加4.3毫升毫升

14、H2O，搖勻，再加，搖勻，再加0.50毫升奈氏試劑，搖勻。毫升奈氏試劑，搖勻。測(cè)測(cè)A480，并計(jì)算反應(yīng)速度。，并計(jì)算反應(yīng)速度。以以v為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)，pH為橫坐標(biāo)作出為橫坐標(biāo)作出v-pH圖，求脲酶最適圖，求脲酶最適pH。）min5時(shí)間（A)mol(NH40Av標(biāo)3樣 抑制劑對(duì)脲水解速度的影響抑制劑對(duì)脲水解速度的影響 取取14只干燥試管，各管標(biāo)號(hào)，按下表加樣。只干燥試管，各管標(biāo)號(hào)，按下表加樣。級(jí)數(shù)級(jí)數(shù)試管號(hào)試管號(hào)pH7.0磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（0.5 ml）脲溶液（脲溶液（0.25 ml）一組一組12340.8 mol/L0.01 mol/L0.02 mol/L0.04 mol/L0.08 mol/L二組二組56780.4 mol/L0.01 mol/L0.02 mol/L0.04 mol/L 0.08 mol/L三組三組91011120.1 mol/L0.01 mol/L0.02 mol/L0.04 mol/L0.08 mol/L四組四組130.1 mol/LH2O 0.25毫升毫升同前法分別在各試管中加入同前法分別在各試管中加入0.5毫升脲酶提取液，毫升脲酶提取液，25保溫保溫5分鐘，立即加入分鐘，立即加入0.5毫升毫升1molH2SO4，然后煮沸至渾濁，然后煮沸至渾濁,取取出靜置出靜置5分鐘。分鐘。與此同時(shí)在與此同時(shí)在14號(hào)管