細菌鑒定的一般步驟

1、細菌鑒定的一般步驟李榮南京農業(yè)大學資環(huán)院辦公室：綜合樓B419郵箱：一、確保菌株的純度n在鑒定菌株之前首先確保菌株的純度確保菌株的純度。n假若菌株沒有純化好，將會做大量的無用功二、PCR擴增16S rRNA片段n菌落直接PCR 菌體新鮮、加菌量少、陰性菌較陽性菌容易、退火溫度要高點nDNA擴 PCR 高鹽法或CTAB法提取細菌總DNA DNA量不要加太多 三、16S rRNA片段測序nPCR產物直接測序產物直接測序 條帶特異，注意產物的濃度要足夠，不要純化不要純化nPCR產物克隆測序產物克隆測序 挑單菌落，菌液測序或質粒測序。 四、系統(tǒng)發(fā)育樹的構建n首先將所獲得的16S rRNA片段序列在NC

2、BI數(shù)據(jù)庫中進行序列的比對（序列提交GenBank 獲得登錄號）n從相關數(shù)據(jù)庫下載相關模式種16S rRNA片段序列n采用MEGA 軟件鄰近法做樹核酸序列數(shù)據(jù)庫核酸序列數(shù)據(jù)庫n現(xiàn)在比較通用的核酸序列數(shù)據(jù)庫有：現(xiàn)在比較通用的核酸序列數(shù)據(jù)庫有：pGenbank（national institutes of health ）、pRDP。p EMBL（European molecular biology laboratory）、）、pDDBJ（DNA data bank of Japan）五、發(fā)育樹的構建及作用n確認目標菌株跟模式菌株間的遺傳距離n確認目標菌株的分類定位n同源性較低，認定可能為新種或新

3、屬，有必要重新擴同源性較低，認定可能為新種或新屬，有必要重新擴增序列克隆測序增序列克隆測序六、序列同源性差異分析n16S rRNA序列同源性在大于97% 慎重考慮n16S rRNA序列同源性在97%以下 有做新種的意義n16S rRNA序列同源性在95%以下 有可能是新屬新屬的判定依據(jù)n16S rRNA序列同源性在95%以下n擁有該科的共有特性n與相鄰屬的脂肪酸組成及含量有顯著差異n生理生化差異明顯n極性脂成分有差異n注意：判定依據(jù)要根據(jù)實際情況而定注意：判定依據(jù)要根據(jù)實際情況而定七、幾個發(fā)育樹例子的分析地衣芽孢桿菌模式種的生理生化特性n分類在一個支上，同源性大于99%，初步判定為地衣芽孢桿菌

4、 n生理生化特性的分析等nDNA雜交(實際情況而定)確定菌株種屬n首先確定菌株屬的定位（與同屬模式菌株數(shù)據(jù)的比較）查閱文獻到IJSEM雜志閱讀鄰近種屬的分類文章形態(tài)學分析n菌落形態(tài)菌株 wd的LB平板菌落照片n菌體照片間的比較菌株 wd掃描電鏡照片Starkeya koreensisLm et al. IJSEM (2006), 56, 24092414Ancylobacter rudongensisIJSEM (2004), 54, 385388Angulomicrobium amanitiformeIJSEM (2004), 54, 651657生理生化性質IJSEM (2004), 54, 651657選擇模式種進行實驗n菌種 15561 Angulomicrobium amanitifo 培養(yǎng)基編號： 1 830n菌種 5895 Angulomicrobium tetraedrale 培養(yǎng)基編號： 628n菌種 18406 Starkeya novella 培養(yǎng)基編號： 830菌株送國際菌種保藏中心保藏菌株送國際菌種保藏中心保藏細胞壁脂肪酸（與模式種同步試驗）n測定G+C含量DNA-DNA雜交同源性測定nAPI實驗進行生理生化的特性的獲得n“Biolog”鑒定