定量pcr儀選則寶典

1、定量pcr儀選則寶典:各自精彩的選擇如何選擇合適的定量 PCR儀定量PCR儀主要由兩部分組成，一個(gè)是PCR系統(tǒng)，一個(gè)是熒光檢測(cè)系統(tǒng)。選擇定量PCR儀的關(guān)鍵由于定量PCR必需借助樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對(duì)比來(lái)實(shí)現(xiàn)定量的，對(duì)于定量PCR系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級(jí)放大。至于熒光檢測(cè)系統(tǒng)，多色多通道檢測(cè)是當(dāng)今的主流趨勢(shì)儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬;多通道指可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣品中的多種熒光，儀器就可以同時(shí)檢測(cè)單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標(biāo)+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強(qiáng)大。熒光

2、檢測(cè)系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測(cè)器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長(zhǎng)，而單色發(fā)光二極管LED價(jià)格低、能耗少、壽命長(zhǎng)，不過(guò)因?yàn)槭菃紊?，需要不同的LED才能更好地實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長(zhǎng)。監(jiān)測(cè)系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對(duì)多點(diǎn)成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，需要通過(guò)逐個(gè)掃描實(shí)現(xiàn)多樣品檢測(cè)，對(duì)于大量樣品來(lái)說(shuō)需要較長(zhǎng)的時(shí)間。定量PCR儀需要考慮的另外一個(gè)因素是軟件設(shè)計(jì)，這一點(diǎn)目前較新型號(hào)的儀器都有不錯(cuò)的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。隨著定量PCR技術(shù)在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測(cè)、腫瘤研究等領(lǐng)域的越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，市

3、面上不同品牌和設(shè)計(jì)的定量PCR儀也不斷推陳出新，生物通在這里著重介紹不同的3類定量PCR儀，各有各精彩。1. 傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀以美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)為代表。傳統(tǒng)96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點(diǎn)是可容納的樣本量大而且無(wú)需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板甚至384孔板進(jìn)行批量的定量反應(yīng)，但是缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn)溫度均一性不佳平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應(yīng)樣品槽上每個(gè)孔之間的溫度存在差異也就是所謂位置效應(yīng)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件應(yīng)難以做到與樣本完全一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對(duì)于靈敏度極高的定量PCR來(lái)說(shuō)，任何極微小的差異都會(huì)以指

4、數(shù)級(jí)別的規(guī)模被放大，不能不說(shuō)是一種缺憾。傳統(tǒng)反應(yīng)板面積大，溫度控制的精確性、升降溫速度也相對(duì)較慢，因而反應(yīng)速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個(gè)樣品孔距離光源和監(jiān)測(cè)器的光程各不相同，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。檢測(cè)在試管管底進(jìn)行，試管底的透光性和厚薄均一性都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司的定量 PCR儀也屬于這一類。 ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時(shí)激發(fā)96個(gè)樣品，超低溫CCD具備同時(shí)多點(diǎn)多色檢測(cè)的能力，能夠有效地分辨 FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMR

5、A/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照的陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express非常有用，“因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒(méi)有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針(生物通摘自ABI技術(shù)資料)”。各型號(hào)都有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(Real-Time)和終點(diǎn)讀板(Plate Read)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)?？梢詣?dòng)態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個(gè)

6、數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和 10000個(gè)拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析等。當(dāng)然，也可以作為普通 PCR儀使用。ABI定量PCR儀最大的優(yōu)勢(shì)在于ABI已經(jīng)發(fā)布十二萬(wàn)種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達(dá)分析試劑盒，覆蓋人類全部4萬(wàn)個(gè)基因，二百萬(wàn)種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP 檢測(cè)試劑盒，為運(yùn)用7000、7300、7500、7900型開(kāi)展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學(xué)

7、：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無(wú)雜帶生成。7500型號(hào)比7300多一個(gè)濾光鏡，新的光路設(shè)計(jì)使長(zhǎng)波長(zhǎng)紅色熒光的檢測(cè)靈敏度大大提高，帶有快速運(yùn)行模式。增強(qiáng)的7900型在96孔模塊的基礎(chǔ)上更加可以更換384孔版模塊，使得高通量處理數(shù)據(jù)的能力大大增強(qiáng)，應(yīng)該更適合經(jīng)常處理大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室吧。 MJ的Option系列是在MJ原來(lái)的常規(guī)PCR儀基礎(chǔ)上改造，采用LED光源PMT光電倍增管熒檢測(cè)器。 96個(gè)單色LED光源對(duì)應(yīng)96孔板，但是單色LED激發(fā)波長(zhǎng)范圍較窄。Option是單道單個(gè)光電倍增管

8、熒光檢測(cè)器，升級(jí)的Option2是雙PMT光電倍增管熒光檢測(cè)器，PMT靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，所以O(shè)ption系列是逐孔掃描而非同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品。雙PMT可同時(shí)進(jìn) 行雙色檢測(cè) (FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。優(yōu)勢(shì)之一是帶梯度功能。Bio-Rad(伯樂(lè))也算是個(gè)熟悉的品牌，iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)也是96孔平板式固定加熱的，熒光檢測(cè)波長(zhǎng)范圍400-700nm，可4波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)，儀器的設(shè)計(jì)靈活，定性和定量部分可獨(dú)立工作，同樣可完成梯度PCR。5組濾光片位置使用戶可以自由選擇不同的檢測(cè)波長(zhǎng)。專利技術(shù)intensifier熒光放大器保證了極高的

9、檢測(cè)靈敏度。MJ被 Bio-Rad收購(gòu)后，Option和iCycler iQ目前還是各自走各自的銷售渠道，至于將來(lái)Bio-Rad會(huì)如何決定二者的發(fā)展方向還需要拭目以待。 小 中 大 2.創(chuàng)新概念的離心式實(shí)時(shí)定量pcr儀為了克服平板式定量pcr溫度均一性差的缺點(diǎn)，聰明的研究人員又開(kāi)發(fā)出創(chuàng)新概念的離心式實(shí)時(shí)定量pcr儀，以roche羅氏的lightcycle和corbett的rotor-gene為代表。pcr擴(kuò)增樣品槽被巧妙地設(shè)計(jì)為離心轉(zhuǎn)子的模樣，借助空氣加熱和轉(zhuǎn)子在腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)子上每個(gè)孔都是“等位”的，幾乎無(wú)差別，很好的解決了每個(gè)樣品孔之間的溫度均一性的關(guān)鍵問(wèn)題 corbett的rotor-ge

10、ne樣品間溫度差異小于±0.01，最大程度地保障了標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間條件的一致性。利用空氣做加熱介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于能實(shí)現(xiàn)與反應(yīng)體系無(wú)縫接觸，接觸面積大且加熱均勻。雖然有競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手批評(píng)空氣介質(zhì)比熱小，但事實(shí)上roche的lightcycle%202.0卻是目前升溫速度最快的定量pcr儀，可以達(dá)到20/秒!Corbett的Rotor-gene也可以達(dá)到5/秒(樣品實(shí)際升溫速度達(dá)到2.5/秒)，優(yōu)于多數(shù)的平板式PCR儀。借助旋轉(zhuǎn)離心力還可以隨時(shí)將可能凝在管壁和蓋子上的液滴離心到管底而無(wú)需熱蓋;還可以將酶加在管蓋上，升溫后離心到管底與反應(yīng)體系混合，實(shí)現(xiàn)“機(jī)械的熱啟動(dòng)功能”。由于升溫速度快，對(duì)于常規(guī)

11、需要2個(gè)多小時(shí)完成的定量PCR反應(yīng)，Roche的LightCycler僅需2030 分鐘即可完成，可以大大節(jié)約時(shí)間和提高工作效率。這一點(diǎn)對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)極為有用，因?yàn)槟悴辉傩枰?個(gè)多小時(shí)才能看實(shí)驗(yàn)結(jié)果了，或者換句話來(lái)說(shuō)，2個(gè)多小時(shí)你可以做45輪定量實(shí)驗(yàn)了。 由于轉(zhuǎn)子上的樣品孔是旋轉(zhuǎn)可移動(dòng)的，因而離心式熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以固定激發(fā)光源和熒光檢測(cè)器，隨時(shí)檢測(cè)旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品管由于每個(gè)樣品管在檢測(cè)時(shí)距離檢測(cè)器和激發(fā)光源的距離都是“等價(jià)”一樣的，使用的是同一個(gè)檢測(cè)器和激發(fā)光源，有效減少不必要的系統(tǒng)誤差。固定的結(jié)構(gòu)使得儀器運(yùn)行更穩(wěn)定，使用壽命更長(zhǎng);離心式定量PCR都是逐個(gè)檢測(cè)樣品的，所以大多采用了長(zhǎng)壽的L

12、ED(發(fā)光二極管)冷光源，運(yùn)行前無(wú)須預(yù)熱，無(wú)須校正;系統(tǒng)檢測(cè)重復(fù)性也更好。離心式定量 PCR儀的缺點(diǎn)主要是離心的轉(zhuǎn)子小，能容納的樣本量有限，由于是離心式轉(zhuǎn)子，常規(guī)的96孔板和條形管就不適用，有的還需要特殊的消耗品，增加使用成本。當(dāng)然離心式定量PCR儀不可能帶梯度功能。 Roche的Lightcycler剛推出的時(shí)候確實(shí)讓人眼前一亮!現(xiàn)在Lightcycler2.0擁有令人心動(dòng)的優(yōu)點(diǎn)-快速：利用空氣動(dòng)力學(xué)原理，20-30分鐘內(nèi)完成30-40個(gè)循環(huán)?？販販?zhǔn)確：變溫速率最高可達(dá)20/秒，溫差±0.3°C多波長(zhǎng)檢測(cè)：可同時(shí)在530、640及710nm三個(gè)通道進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)同管檢測(cè)兩

13、個(gè)項(xiàng)目或設(shè)立檢測(cè)項(xiàng)目的外對(duì)照和內(nèi)對(duì)照。此外動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍達(dá)10個(gè)數(shù)量級(jí)，而無(wú)須將樣品稀釋;具有熔點(diǎn)曲線分析功能可以鑒別基因型、檢測(cè)點(diǎn)突變、檢測(cè)非特異性擴(kuò)增，具多種檢測(cè)模式如Taqman探針、熒光染料SYBR Green I檢測(cè)、序列特異雜交探針等;探針及引物設(shè)計(jì)方便，雜交探針及引物設(shè)計(jì)的限制少，而且亦可方便地選用合適大小的擴(kuò)增子(100-1000bp)。但是 Lightcycler需要使用特定的毛細(xì)管作為樣品管，這在某種程度上提高了消耗成本，也不方便作為常規(guī)PCR儀使用。 Corbett的Rotor-Gene也是離心式的定量PCR儀。在品牌的角度上Corbett當(dāng)然不如Roche羅氏在國(guó)內(nèi)那樣家

14、喻戶曉，之所以特別提到這個(gè)產(chǎn)品，確實(shí)是因?yàn)镃orbett的設(shè)計(jì)有獨(dú)到之處。比如Corbett的Rotot-Gene3000標(biāo)準(zhǔn)型是真正獨(dú)立的4通道(可建立新通道)，4個(gè)獨(dú)立LED激發(fā)光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保證最少的光譜交叉 (0.99935)。由于轉(zhuǎn)子在反應(yīng)過(guò)程之中一直以恒定的低速旋轉(zhuǎn)，使得樣品間的溫度均一性極佳(±0.01/秒)，同一熱反應(yīng)室提供完全相同的反應(yīng)條件，同一光學(xué)通路提供完全相同的測(cè)量通道，每標(biāo)本每循環(huán)檢測(cè)32次，滿足高精度和一致性要求。Rotot- Gene3000提供了36 x0.2ml和72x0.1ml兩種轉(zhuǎn)子，檢測(cè)是通過(guò)薄壁管側(cè)壁

15、而非管底進(jìn)行的，因而可以使用普通的0.2ml PCR管，并允許在試管蓋上標(biāo)記，這降低了使用成本。Rotot-Gene3000的溫控速度不如LightCycler，但優(yōu)于多數(shù)的固定加熱模塊的機(jī)型，能達(dá)到5/秒(管內(nèi)實(shí)際升溫速度達(dá)到2.5/秒)。 Corbett還有一個(gè)光學(xué)變性專利讓待擴(kuò)增樣品預(yù)先進(jìn)行一次熔解曲線程序，檢測(cè)熒光染料信號(hào)大小的變化，找到代表全部雙鏈DNA解鏈的峰值對(duì)應(yīng)溫度，在其后的反應(yīng)中就無(wú)需總是將變性溫度設(shè)為94度，也不需要延長(zhǎng)孵育時(shí)間。這個(gè)專利使得反應(yīng)過(guò)程大大縮短。Rotot-Gene主要的問(wèn)題也是可容納的樣品數(shù)量少，只能靠反應(yīng)速度快，同樣的時(shí)間可以多運(yùn)行幾輪反應(yīng)來(lái)彌補(bǔ)。對(duì)于大量

16、樣品的實(shí)驗(yàn)室， Corbett同時(shí)還提供定量PCR反應(yīng)自動(dòng)加樣系統(tǒng)，不單可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性，也可以配套 Roche和ABI的定量PCR儀。這樣就不用擔(dān)心加樣累壞了。3.第三類的熒光定量pcr儀以cepher公司的smart%20cyclerii為代表，對(duì)于國(guó)內(nèi)的用戶來(lái)說(shuō)比較新鮮，但這個(gè)一直受美國(guó)國(guó)防部和安全局、美國(guó)軍隊(duì)傳染病醫(yī)學(xué)研究中心、美國(guó)軍隊(duì)士兵和生物化學(xué)合作所資助的公司卻相當(dāng)有來(lái)頭。smart%20cyclerii獲得過(guò)1998年美國(guó)研發(fā) r&d100金獎(jiǎng)。smart%20cyclerii的機(jī)型小巧，只有16個(gè)樣品槽，它的獨(dú)到之處

17、在于這16個(gè)樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊，也就是說(shuō)這16個(gè)樣品槽相當(dāng)于16臺(tái)獨(dú)立的定量pcr儀!獨(dú)立控溫的好處首先是，你可以在同一定量pcr儀上分別進(jìn)行不同條件的定量pcr反應(yīng)，更為靈活自定義的梯度優(yōu)化反應(yīng)也好，或者是完全不同的幾組反應(yīng)甚至，你可能只進(jìn)行個(gè)別樣品的檢測(cè)，只占用其中幾個(gè)樣品槽過(guò)一會(huì)兒其它的同事也要用 他不需要等待你的反應(yīng)結(jié)束，而可以隨時(shí)利用空置的樣品槽開(kāi)始其它定量反應(yīng)!對(duì)于各有各忙的多成員的實(shí)驗(yàn)室，要是個(gè)別樣品就占據(jù)96孔樣品槽，其它人每輪要再等2個(gè)多小時(shí)，有時(shí)還要等幾輪，那可夠郁悶的。smart%20cycler%20ii的使用頻率可以被最大化，大家都不用等待!這個(gè)世界上

18、唯一允許不同條件pcr同時(shí)進(jìn)行的定量pcr儀擁有獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)點(diǎn)，是其它任何平板式或者離心式定量pcr都不具備的。此外，每個(gè)溫控模塊只控制一個(gè)樣品槽，升降溫速度當(dāng)然更快高達(dá)10/秒，控溫精度自然就更高這里根本不用考慮不同樣品槽之間的溫度均一性的問(wèn)題，只有每個(gè)模塊控溫精確度的問(wèn)題。對(duì)于普通的96孔板固定加熱模塊，本身有控溫精度和準(zhǔn)確度的差異，再加上樣品槽不同位置之間的溫度差異，而 Smart CyclerII就完全減少了一個(gè)誤差因素。優(yōu)異的特性使得只要20分鐘就可以完成常規(guī)的定量PCR反應(yīng)，大大提高研究人員的工作效率。每個(gè)模塊獨(dú)立控制的激發(fā)光源和檢測(cè)器直接與反應(yīng)管壁接觸，保證熒光激發(fā)和檢測(cè)不受外界

19、干擾，固定的結(jié)構(gòu)使得儀器運(yùn)行更穩(wěn)定，使用壽命更長(zhǎng)。整合有4通道光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，分別可以檢測(cè)FAM/SYBR Green I, Tet/ Cy3, Texas Red和Cy5，可在同一樣本中進(jìn)行多靶點(diǎn)分析，同時(shí)檢測(cè)4種熒光信號(hào)，可使用多種檢測(cè)方法，包括Taqman探針、分子信標(biāo)、Amplifluor引物和Scorpion引物和熒光內(nèi)插染料等等。寬達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍。不過(guò)Smart CyclerII需要使用獨(dú)家的扁平反應(yīng)管，增加了反應(yīng)成本，上樣也不如傳統(tǒng)的方法方便，而且16個(gè)樣品槽也不大適合批量反應(yīng)的要求不過(guò)Smart Cycler II的軟件設(shè)計(jì)允許一臺(tái)電腦同時(shí)操作6臺(tái)Smart Cycler

20、 II，部分彌補(bǔ)了缺憾。所以Smart Cycler II會(huì)更適合多成員、樣本量不大、要求快速出結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室。不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都總是要同時(shí)檢測(cè)幾十上百個(gè)樣品吧?在選購(gòu)定量PCR前之前我們需要先了解自己的需要是同時(shí)檢測(cè)大量樣本?還是小規(guī)模的研究?是固定的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法還是有機(jī)會(huì)嘗試不同的方法?隨著技術(shù)的加速發(fā)展不斷有新的熒光素、標(biāo)記方法和試劑盒面市，還要考慮儀器性能在將來(lái)的可拓展性等等。生物通撰寫(xiě)本文的目的并非指出哪一類的儀器更適合我們的需要畢竟不同應(yīng)用領(lǐng)域、不同的實(shí)驗(yàn)室有著不同的需求，所以了解不同類型的定量PCR儀的特點(diǎn)有助于選擇更適合自己需要的儀器，“不求最好，但求適合”。 熒光定量PCR詳細(xì)

21、流程和問(wèn)題解析 轉(zhuǎn)自 丁香園論壇前一段時(shí)間在百度中搜索，發(fā)現(xiàn)多年前寫(xiě)的一個(gè)關(guān)于熒光定量PCR技術(shù)的PPT有很多人看過(guò)或引用過(guò)，考慮到自己作熒光定量PCR工作已經(jīng)了五年了，做的實(shí)驗(yàn)以及解決的問(wèn)題遠(yuǎn)比五年前多了，因此利用過(guò)年的時(shí)間，寫(xiě)點(diǎn)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的一些注意事項(xiàng)及感想，無(wú)論對(duì)錯(cuò)，都是希望對(duì)相關(guān)的人員有些參考價(jià)值。 熒光定量PCR原理等大家都已經(jīng)很熟了，我就不細(xì)說(shuō)了，主要是寫(xiě)一些有人問(wèn)過(guò)的事，希望寫(xiě)的內(nèi)容是大家都關(guān)心的。普通PCR與熒光定量PCR技術(shù)區(qū)別？簡(jiǎn)單的講PCR技術(shù)最早是用于擴(kuò)增一段特異的PCR片段，用于克隆、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)，后來(lái)也將其用于樣本中特異的PCR片段有無(wú)或非很粗的相對(duì)定量，而

22、熒光定量PCR技術(shù)則是為了測(cè)定樣本中特異的PCR片段相對(duì)及絕對(duì)量，是一種測(cè)定特異的PCR片段含量的方式。如測(cè)定病人樣本中病原體的含量、實(shí)驗(yàn)樣本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人講過(guò)普通PCR后，通過(guò)電泳也可以進(jìn)行定量，其實(shí)是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。近兩年沒(méi)有人再講這類的話了。Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX這些方法如何選擇？從實(shí)驗(yàn)成本來(lái)講，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一點(diǎn)Sybr Green I 熒光染料即可，其信號(hào)強(qiáng)度也很好，還可以進(jìn)行融解曲線分析等，但缺點(diǎn)是只能在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行一種PCR反

23、應(yīng)的檢測(cè)，另一個(gè)問(wèn)題是非特異性擴(kuò)增會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)然也有一些技術(shù)解決這些問(wèn)題，后面會(huì)講到。對(duì)于研究人員來(lái)講，如果需要檢測(cè)的基因很多，而每個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行一種PCR反應(yīng)的檢測(cè)可以滿足實(shí)驗(yàn)要求，則Sybr Green是最好的選擇。如果需要進(jìn)行多通道實(shí)驗(yàn)，即在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行2種或以上的反應(yīng)，則要選擇其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，這兩種都是探針的方式，由于增加了探針的特異性，因此其擴(kuò)增曲線反映的就是特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線，不含有非特異性擴(kuò)增的成分。因此商業(yè)用途的檢測(cè)試劑盒大都采用這一技術(shù)，以減少非特異性產(chǎn)物造成錯(cuò)誤結(jié)論的可能性。其缺點(diǎn)在于探針成本較高，有時(shí)設(shè)計(jì)的

24、探針并不合適，有造成損失的可能性。并且要進(jìn)行較多的實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。這兩種探針技術(shù)用于商業(yè)目的時(shí)都有專利問(wèn)題，據(jù)說(shuō)取得Molecular beacon的許可權(quán)的成本相對(duì)較低，但只是據(jù)說(shuō)。另一種值得一提的是LUX探針，它也可進(jìn)行多通道實(shí)驗(yàn)，但它沒(méi)有Taqman和Molecular beacon方法的增加探針特異性的功能，因此只能是一種折中的方案，如果不考慮多通道實(shí)驗(yàn)，則不如Sybr Green法選擇單通道實(shí)驗(yàn)還是多通道實(shí)驗(yàn)？這是要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來(lái)選擇的，如果有一個(gè)、兩個(gè)或是三個(gè)基因要進(jìn)行比較，并用看家基因進(jìn)行對(duì)照，可以考慮選擇多通道實(shí)驗(yàn)。多通道實(shí)驗(yàn)的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較

25、多，一是條件的優(yōu)化比較麻煩，即多種PCR反應(yīng)以及探針要在同一個(gè)反應(yīng)條件下進(jìn)行，并且效率都要比較高，另一個(gè)困難是要求相互之間沒(méi)有干擾，因?yàn)楦蓴_會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。還有一個(gè)困難是當(dāng)一個(gè)基因的模板數(shù)顯著大于其他基因時(shí)，因?yàn)楣灿煤塑账岬荣Y源的原因，會(huì)讓模板數(shù)少的基因的定量值變小或變?yōu)榱恪Ｒ虼艘话銉赏ǖ赖膶?shí)驗(yàn)比較多些，即一個(gè)基因進(jìn)行多樣本比較，用看家基因進(jìn)行對(duì)照。可以看出，如果單通道實(shí)驗(yàn)可以解決問(wèn)題，就不要選擇多通道實(shí)驗(yàn)了。三個(gè)以上的基因進(jìn)行比較時(shí)就最好用單通道。因?yàn)橐话愕膬x器最多也只有四個(gè)通道，就是有更多的通道，實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化也是足夠麻煩了。 雙通道實(shí)驗(yàn)時(shí)如何克服反應(yīng)條件、干擾以及模板數(shù)差別很大等困難？

26、對(duì)于反應(yīng)條件的優(yōu)化，可通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)優(yōu)化，主要是復(fù)性溫度，可用PCR儀的溫度梯度功能來(lái)選擇，然后找到一個(gè)合適的復(fù)性溫度。對(duì)于如何確定是否存在相互干擾，則要通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的單通道實(shí)驗(yàn)與雙通道實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，如果差別不大，則表明沒(méi)有干擾。至于模板數(shù)差別很大的問(wèn)題，可以通過(guò)降低引物濃度的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，即primer limited，在一般的PCR反應(yīng)中，引物的濃度是足夠高的，基本上可以將反應(yīng)液中的核苷酸全部消耗盡，在優(yōu)化引物濃度時(shí)，用不同的引物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，找到不影響反應(yīng)的C(t)值的最低引物濃度。這樣在實(shí)際反應(yīng)中，模板數(shù)高的基因在引物耗盡后，反應(yīng)液中仍然有足夠的核苷酸等用于另一個(gè)基因

27、的反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)中的幾個(gè)注意事項(xiàng)1、 引物設(shè)計(jì)最好用相關(guān)的軟件來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)，考慮引物自身回折、錯(cuò)配、引物二聚體、復(fù)性溫度、產(chǎn)物變性溫度等問(wèn)題，其中產(chǎn)物的變性溫度是大家不太關(guān)心的問(wèn)題，但有些產(chǎn)物在一般的95度條件下不能充分解鏈，會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2、 引物所設(shè)計(jì)的片斷一定要有足夠的特異性，選擇好片段后，最好到互聯(lián)網(wǎng)中進(jìn)行相關(guān)的搜索，看在樣本的基因組有沒(méi)有相擬的基因以及假基因等，如果有，則可選擇特異性更高的區(qū)域。3、 在進(jìn)行mRNA表達(dá)量的定量，可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮基因組的污染問(wèn)題，即在引物設(shè)計(jì)時(shí)讓兩個(gè)引物跨一個(gè)內(nèi)含子，這樣基因組污染所造成的擴(kuò)增可以區(qū)別出來(lái)，或因?yàn)槠芜^(guò)大而不能擴(kuò)增4、 由于mR

28、NA表達(dá)量的定量有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，如果逆轉(zhuǎn)錄是用poly（T）作引物，則設(shè)計(jì)的片段盡量靠近poly（A），以免逆轉(zhuǎn)錄的效率影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果用特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，則要考慮引物區(qū)是否存在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題5、 產(chǎn)物片段的大?。憾縋CR一般產(chǎn)生片段都不大，不會(huì)超過(guò)600bp。Sybr Green法一般選擇250-600bp，過(guò)大會(huì)影響到PCR擴(kuò)增的效率，過(guò)小則很難通過(guò)融解曲線與引物二聚體分開(kāi)，但并不是絕對(duì)的。Taqman法的擴(kuò)增片段都很小，幾十或是100多，這是其原理造成的。Molecular beacon法對(duì)片段大小的要求不高，只要不是太長(zhǎng)即可。Sybr Green法的實(shí)驗(yàn)策略：實(shí)驗(yàn)可

29、分為三個(gè)階段，即實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化、預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)。一、 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化階段，這一階段是最花時(shí)間的，1、 要找到一個(gè)陽(yáng)性的模板，可以是克隆有基因質(zhì)粒、強(qiáng)陽(yáng)性樣本或純化的PCR產(chǎn)物等。有了陽(yáng)性的模板才能進(jìn)行最基本的定量擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，如果有普通PCR的實(shí)驗(yàn)條件，也可以此為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、 擴(kuò)增出的產(chǎn)物要通過(guò)電泳方法確定其大小，以確認(rèn)定量PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物是你的目的基因，有些用戶就發(fā)生過(guò)優(yōu)化了幾天的條件才發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段的大小不對(duì)，不是自己想要的基因。當(dāng)然，能測(cè)個(gè)序什么的最好。并通過(guò)融解曲線實(shí)驗(yàn)來(lái)確定產(chǎn)生的Tm值以及所用的變性溫度是否已經(jīng)足夠，個(gè)別情況下會(huì)出來(lái)解鍵不充分的現(xiàn)象。3、 有了基本的PCR條件后，要

30、將陽(yáng)性模板進(jìn)行倍比稀釋，一般用10倍稀釋。將稀釋的模板帶上陰性對(duì)照，分成多份進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)，對(duì)復(fù)性溫度進(jìn)行優(yōu)化，以找出復(fù)性溫度范圍，復(fù)性溫度最好能滿足以下條件：高中低模板濃度下PCR擴(kuò)增效率都很高、陰性模板沒(méi)有擴(kuò)增。選擇滿足條件的中間溫度，這樣可以提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，不會(huì)因?yàn)闃颖竟茉诩訜崮K中的位置不同而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4、 如果找不到合適的條件，如引物二聚體過(guò)多，可對(duì)引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進(jìn)行優(yōu)化，然后再進(jìn)行復(fù)性溫度梯度實(shí)驗(yàn)。其中Mg2+離子濃度、DMSO含量都會(huì)影響Tm值以及所用的變性溫度。二、 預(yù)實(shí)驗(yàn)階段按照優(yōu)化的條件對(duì)所需要分析的樣本做一個(gè)沒(méi)有重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣本做一

31、個(gè)10倍和100倍稀釋的實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的主要有兩個(gè)，一是了解樣本的模板濃度范圍，如果有樣本的模板濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，如過(guò)高或過(guò)低，則可能要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重新優(yōu)化，當(dāng)然，如果過(guò)高和過(guò)低不影響你的實(shí)驗(yàn)結(jié)論則可定為高于多少或低于多少，直接進(jìn)行外推是不科學(xué)的。另一個(gè)目的看樣本中是否有PCR抑制物的影響，如果每個(gè)樣本的定量結(jié)果與其10及100倍稀釋后的樣本的結(jié)果相同，則表明沒(méi)有抑制物的影響，如果不同，如原倍結(jié)果為零，而10及100倍稀釋后的樣本的結(jié)果為陽(yáng)性，則表明樣本中PCR抑制物濃度較高。可用其10及100倍稀釋后的樣本進(jìn)行定量。有幾個(gè)用戶發(fā)現(xiàn)過(guò)實(shí)驗(yàn)為陰性的樣本在其10及100倍稀釋后的樣本為陽(yáng)性的

32、，也許有更多用戶沒(méi)有進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)，得到了錯(cuò)誤的結(jié)論。因?yàn)闃颖綬NA的提取試劑中經(jīng)常有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，清洗不干凈就會(huì)影響到定量PCR反應(yīng)。三、 正式實(shí)驗(yàn)階段然后就可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)了，只需要將每個(gè)樣本作三個(gè)或更多的重復(fù)即可以了。有抑制物的樣本先進(jìn)行稀釋，計(jì)算濃度時(shí)不要忘記就行了。最后就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析了，個(gè)別樣本中離群的數(shù)值可以刪除。Sybr Green法的注意事項(xiàng)1、 最好按照上面提到策略進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以免造成不必要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，從而降低實(shí)驗(yàn)成本2、 Sybr Green I一般是先將母液用DMSO進(jìn)行稀釋100倍，最終的使用濃度為4000-10000分之一?？赡懿煌腟ybr Green

33、I母液的稀釋倍數(shù)不同，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明，但高濃度的Sybr Green I肯定會(huì)影響PCR反應(yīng)。另外用水稀釋后的Sybr Green I保存的時(shí)間很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反復(fù)凍融會(huì)影響性能，但原因不明。3、 在對(duì)引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進(jìn)行優(yōu)化后仍得不到滿意的結(jié)果，特別是引物二聚體很多時(shí)，可以考慮更換引物，因?yàn)橐锍杀镜?，而?yōu)化實(shí)驗(yàn)成本很高。4、 當(dāng)有少量引物二聚體影響熒光結(jié)果時(shí)，可以提高熒光讀板時(shí)的溫度來(lái)消除引物二聚體的影響，如將讀板時(shí)的溫度提高到82度，此時(shí)引物二聚體已經(jīng)解鏈而產(chǎn)物沒(méi)有解鏈。但引物二聚體濃度很高時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響PCR反應(yīng)，消除引物二聚體的影響也

34、沒(méi)有用。5、 大家都知道進(jìn)行絕對(duì)定量需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，有些用戶認(rèn)為進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)就不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線了，可以通過(guò)2C（t）來(lái)計(jì)算，但這一計(jì)算是有條件的，即所有熒光定量PCR擴(kuò)增的效率都接近于100%，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。但大多數(shù)用戶并沒(méi)有進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)就直接用2C（t）來(lái)計(jì)算了。這是錯(cuò)誤的，會(huì)得到錯(cuò)誤結(jié)論。6、 無(wú)論是使用自配的試劑還是用商業(yè)的熒光定量試劑盒，最好買夠試劑，以免進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)或正式實(shí)驗(yàn)時(shí)沒(méi)有試劑而必需采用其他試劑，由于不同試劑的緩沖液成份有較大差別，如有的試劑中含有DMSO及Mg2+離子等，可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。7、 不要在管蓋上寫(xiě)字，原因很明顯，但有些用戶習(xí)

35、慣了寫(xiě)字，后來(lái)再擦掉，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有些影響。8、 最好使用高質(zhì)量的PCR管，低質(zhì)量管的管間差可能會(huì)很大。9、 每次實(shí)驗(yàn)一定要有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以免出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)找不到原因。10、 在樣本很珍貴時(shí)可以采用對(duì)樣本進(jìn)行稀釋的方式進(jìn)行定量。只要濃度不是太低，理論來(lái)講對(duì)稀釋是不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的。其他方法也可以采用類擬的策略，以節(jié)約成本，提高效率。想到的內(nèi)容就這些了，希望大家多批評(píng)指正。反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 1. SG濃度：終濃度1:5,0001:100,000，一般為1:10,0001:70,0002. Primer濃度：終濃度50nM300nM固定摸板濃度的梯度實(shí)驗(yàn)不加摸板的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（NTC）有無(wú)非特異

36、信號(hào)熔解曲線的分析是否單峰建議使用HPLC純化的引物3. MgCl2濃度降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物最低可至1.5nM同時(shí)做梯度實(shí)驗(yàn)和NTC對(duì)照4. 反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)反應(yīng)溫度參考所用酶的種類退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間與常規(guī)PCR類似，擴(kuò)增片斷一般為200300bp5. TaqMan探針引物、探針設(shè)計(jì)：首先選擇探針序列探針的Tm值為6870度，長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)30堿基探針的5端不應(yīng)是G，G有可能會(huì)淬滅熒光素引物應(yīng)盡量靠近探針，擴(kuò)增片斷不超過(guò)400bp，通常為80150bp引物的Tm值為5960度，長(zhǎng)度約20堿基避免引物、探針之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)委托合成公司設(shè)計(jì)使用輔助軟件確定反應(yīng)參數(shù)一

37、般為兩步法，94度1020s60度3060s （Taq酶的5外切酶活性在60度最強(qiáng)）通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度三步法， 72度45s優(yōu)化引物探針濃度目標(biāo)：最高的信號(hào)/背景比最小的Ct值引物濃度：50nM-900nM探針濃度：50nM-250nM通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定各自的濃度和比例 real-time PCR 掃盲文章real-time PCR 掃盲文章 轉(zhuǎn)自 丁香園論壇多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)發(fā)明至今已近20年了，在這期間技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR）技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從

38、定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，本文就此技術(shù)及其應(yīng)用做一綜述。1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的方法學(xué)1.1 原理 所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time 技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一

39、密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平

40、不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板最初的含量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表

41、明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1.2 熒光化學(xué) 目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測(cè)兩大類。擴(kuò)增序列非特異性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種最簡(jiǎn)單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR gre

42、en 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引物二聚體的問(wèn)題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。擴(kuò)增序列特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-time Q-PCR中

43、最廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個(gè)原理。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，此時(shí)5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET），因此探針完整時(shí)，檢測(cè)不到該探針5端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5-3外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3

44、端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo)（molecular beacon）就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針?lè)肿映拾l(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。熒光標(biāo)記引物是從分子信標(biāo)的概念變化而

45、產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。目前主要有兩種：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。雜交探針（hybridization probe）使用兩個(gè)特異的探針，其中上游的探針的3端標(biāo)記有供體熒光素（donor），而下游的探針的5端標(biāo)記有受體熒光素（acceptor）。在PCR中模板退火階段，兩探針同時(shí)與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，此作用與上述水解探針的方式相反），使得受體熒光基團(tuán)發(fā)

46、出熒光；當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時(shí)，無(wú)熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個(gè)探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核苷酸熔解曲線（melting curve）對(duì)與寡核苷酸探針結(jié)合的序列進(jìn)行分析，從中獲取有用的信息。1.2 熒光化學(xué) 目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測(cè)兩大類。擴(kuò)增序列非特異性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種最簡(jiǎn)單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYB

47、R green 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引物二聚體的問(wèn)題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。擴(kuò)增序列特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-time Q

48、-PCR中最廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個(gè)原理。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，此時(shí)5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET），因此探針完整時(shí)，檢測(cè)不到該探針5端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5-3外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，

49、從而脫離3端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo)（molecular beacon）就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針?lè)肿映拾l(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。熒光標(biāo)記引物是從分子信標(biāo)的

50、概念變化而產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。目前主要有兩種：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。雜交探針（hybridization probe）使用兩個(gè)特異的探針，其中上游的探針的3端標(biāo)記有供體熒光素（donor），而下游的探針的5端標(biāo)記有受體熒光素（acceptor）。在PCR中模板退火階段，兩探針同時(shí)與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，此作用與上述水解探針的方式相反），使得受體

51、熒光基團(tuán)發(fā)出熒光；當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時(shí)，無(wú)熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個(gè)探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核苷酸熔解曲線（melting curve）對(duì)與寡核苷酸探針結(jié)合的序列進(jìn)行分析，從中獲取有用的信息。1.3 定量方法 在real-time Q-PCR中，模板定量有兩種策略；相對(duì)定量和絕對(duì)定量。相對(duì)定量指的是在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化。絕對(duì)定量指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本的量。1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的法的相對(duì)定量 由于在此方法中量的表達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言的，因此相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其相對(duì)稀釋度即可。在

52、整個(gè)實(shí)驗(yàn)中樣本的靶序列的量來(lái)自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的量，即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。在實(shí)驗(yàn)中為了標(biāo)準(zhǔn)化加入反應(yīng)體系的RNA或DNA的量，往往在反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增一內(nèi)源控制物，如在基因表達(dá)研究中，內(nèi)源控制物常為一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH等）。1.3.2 比較CT法的相對(duì)定量 比較CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量的不同之處于在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來(lái)反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)

53、增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對(duì)定量 此方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量的不同之處在于其標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先可知的。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常作為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來(lái)轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來(lái)確定。2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用eal-time Q-PCR的應(yīng)用范圍很廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的測(cè)定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的檢測(cè)，細(xì)胞因子的表達(dá)分析，腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用作一概

54、述。2.1 微小殘留病變的檢測(cè)腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤常伴有特異性基因的易位，這種易位往往可以作為監(jiān)測(cè)臨床治療效果的一種腫瘤標(biāo)志。雖然在過(guò)去的幾十年里治療方案的改進(jìn)已大大地延長(zhǎng)了病人的生存期，但是緩解期的病人仍存在復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性。因此微小殘留病變（MRD）的檢測(cè)對(duì)于進(jìn)一步調(diào)整治療方案是至關(guān)重要的。Real-time Q-PCR的應(yīng)用正成為檢測(cè)腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備的研究工具。通過(guò)對(duì)腫瘤融合基因的定量測(cè)定能指導(dǎo)臨床對(duì)病人實(shí)行個(gè)體化的治療。急性粒細(xì)胞性白血?。ˋML）最常見(jiàn)的染色體異常是交互易位t(8；21) (q 22；q22)，在這易位中，AML-1轉(zhuǎn)錄因子基因和8號(hào)染色體的MTG8

55、基因發(fā)生融合，致使正常的AML-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到影響，這可能是白血病的病因。目前的研究證明用real-time Q-PCR來(lái)檢測(cè)融合基因有助于對(duì)這些病人的MRD進(jìn)行定量，其作為預(yù)后的指標(biāo)或?qū)χ委煼桨傅脑u(píng)估是有價(jià)值的。同樣的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML）的BCR-ABL融合基因；急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL）的白血病特異的TEL-AML1融合基因；濾泡狀淋巴瘤（FL）的染色體易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。許多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的應(yīng)用，隨著技術(shù)的發(fā)展，Real-time Q-PCR的運(yùn)用將不斷

56、地?cái)U(kuò)大。多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)發(fā)明至今已近20年了，在這期間技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR）技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，本文就此技術(shù)及其應(yīng)用做一綜述。1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的方法學(xué)1.1 原理 所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方

57、法。在real-time 技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用

58、此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板最初的含量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷