日本醫(yī)蛭不同萃取部位體外抗凝活性的實(shí)驗(yàn)研究

1、日本醫(yī)蛭差異萃取部位體外抗凝活性的實(shí)行研究姚楠余順慧相宇李友賓【摘要】目的研究日本醫(yī)蛭差異萃取部位的抗凝活性，為日本醫(yī)蛭的新藥開(kāi)拓提供根據(jù)。要領(lǐng)SD大鼠腹主脈取血，應(yīng)用血凝儀體外測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)和活化的部門凝血活酶時(shí)間(APTT)。效果日本醫(yī)蛭的總提物能使大鼠PT，TT，APTT時(shí)間明顯延伸；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延伸。結(jié)論中藥日本醫(yī)蛭的低極性小分子具有抗凝活性。【關(guān)鍵詞】日本醫(yī)蛭抗凝血水蛭作為藥用，汗青久長(zhǎng)。在中國(guó)，水蛭始載于?神農(nóng)本草經(jīng)?，謂其能“逐惡血、瘀血“破血瘕積累。臨床普及用于血栓形成、冠心并腦水腫的治療1。天下上蛭類有數(shù)百種，中國(guó)也有近百種。

2、?中國(guó)藥典?2022年版收載水蛭科動(dòng)物螞蝗hitaniapigrahitan、日本醫(yī)蛭Hirudnippniahitan和柳葉螞蝗hitaniaaranulatahitan3種2。如今公認(rèn)水蛭的活性身分為水蛭素，它是從醫(yī)蛭的唾液腺中提取出來(lái)的一種多肽，是作用很強(qiáng)的凝血酶按捺劑，具有抗凝、抗血栓等藥理作用。而中藥傳統(tǒng)應(yīng)用炮制的水蛭入藥，即水蛭要顛末開(kāi)水燙死曬干或砂炒，水蛭素完全被粉碎3，4，然而水蛭的破血、通經(jīng)的成果仍舊得以保存，這說(shuō)明水蛭中含有除水蛭素外的別的抗凝血身分。如今人們對(duì)水蛭中卵白多肽類活性身分研究較多，如抗凝血物質(zhì)水蛭素以及肝素、抗血栓素抗炎酶和溶血酶及組胺樣物質(zhì)5，而對(duì)小分子研究

3、報(bào)道較少。有人研究了螞蝗的差異極性小分子部位的抗凝活性，證實(shí)中等極性的小分子具有較強(qiáng)的抗凝活性6。本文報(bào)道日本醫(yī)蛭差異萃取部位體外的抗凝活性，以期探求其他有用的抗凝血小分子身分。1質(zhì)料與儀器1.1動(dòng)物SpragueDaley大鼠，雄性，體重200250g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)行動(dòng)物中央，及格證號(hào)SXK滬2002-0010?；筐B(yǎng)情況為干凈級(jí)，及格證號(hào)SYXK蘇2002-0007。1.2藥材日本醫(yī)蛭購(gòu)于江蘇省宿遷市保安養(yǎng)蛭場(chǎng)，為鮮品經(jīng)太陽(yáng)直接曬干而成，經(jīng)李友賓博士斷定為Hirudnippniahitan，標(biāo)本保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥化學(xué)室，標(biāo)本號(hào)2022-09-08。1.3試劑枸櫞酸鈉闡發(fā)純，

4、中國(guó)上海試劑一廠，批號(hào)20020912；水合氯醛闡發(fā)純，國(guó)藥團(tuán)體化學(xué)試劑，批號(hào)T20220922；TT，PT，APTT試劑上海希森美康醫(yī)用電子，產(chǎn)物尺度號(hào)ZB/DadeBehing-04-2002。1.4儀器普利生PLS2000-4型血小板聚攏凝血因子闡發(fā)儀。2要領(lǐng)2.1樣品液的制備日本醫(yī)蛭干品，加8倍量95的乙醇回流提取3次，1.5h/次。歸并3次提取液，減壓揮去溶劑得到總提物。將總提物疏散于水中，別離用石油醚、氯仿、正丁醇萃取正丁醇萃取后剩下的部門為水部位，各萃取物揮去溶劑別離得到石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部門。別離稱取總提取物2g，石油醚部位1.1g，氯仿部位0.044g溶解于

5、10l的二甲亞砜中，正丁醇部位0.754g，溶于10l3吐溫，水部位0.646g溶于10l生理鹽水，使各部位樣品液濃度均為830g生藥/l。2.2凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)的測(cè)定選用SD雄性大鼠，10水合氯醛麻醉，腹自動(dòng)脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(19)，混勻后以3000r/in，離心15in，取血漿100l，參加藥液10l，預(yù)溫3in后參加預(yù)溫好的PT，TT試劑200l，用血小板聚攏凝血因子闡發(fā)儀測(cè)定凝固時(shí)間。2.3活化的部門凝血活酶時(shí)間(APTT)的測(cè)定按“2.2要領(lǐng)疏散出血漿，取血漿100l，參加10l藥液和APTT試劑100l，預(yù)溫3in后參加預(yù)溫15in的al2100

6、l，用血小板聚攏凝血因子闡發(fā)儀測(cè)定凝固時(shí)間。2.4統(tǒng)計(jì)要領(lǐng)統(tǒng)計(jì)要領(lǐng)用ne-ay-ANVA，多組間兩兩比力，用LSD(Least-Signfieant-Diferene)統(tǒng)計(jì)。3效果3.1日本醫(yī)蛭提取部位的抗凝血活性效果見(jiàn)表13。效果表白，總提物能使大鼠PT，TT，APTT時(shí)間明顯延伸；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延伸。經(jīng)SPSS軟件單因素方差闡發(fā)，日本醫(yī)蛭總提物、石油醚部位抗凝活性作用顯著強(qiáng)于其他提取部位。表1日本醫(yī)蛭總提物、石油醚部位、氯仿部位對(duì)大鼠PT，TT，APTT的影響略與二甲亞砜比力，*P0.05；n=4表2日本醫(yī)蛭水部位對(duì)大鼠PT，TT，APTT的影響略表3日本醫(yī)蛭正丁醇部位對(duì)

7、大鼠PT，TT，APTT的影響略3.2提取物濃度與抗凝血活性的干系總提物和石油醚部位的濃度越高其抗凝血作用越強(qiáng)。在實(shí)行范疇內(nèi)，總提物的濃度與PT，TT，APTT凝血指標(biāo)的延伸呈線性干系。見(jiàn)圖12。圖1總提物濃度與凝血活性之間的干系略圖2石油醚部位濃度與凝血酶原時(shí)間之間的干系略4討論凝血?dú)v程是一系列的酶促反響，包羅內(nèi)源性，外源性凝血系列和配合途徑。凝血酶原時(shí)間PT，活化部門凝血活酶時(shí)間APTT，凝血酶時(shí)間TT別離反響了外源性凝血體系和內(nèi)源性凝血體系的活性。此中，APTT測(cè)定是內(nèi)源性凝血體系各凝血身分總的凝血狀態(tài)的挑選實(shí)行；PT測(cè)定是外源性凝血體系各凝血身分總的凝血狀態(tài)的挑選實(shí)行；而TT測(cè)定是查抄

8、血漿纖維卵白原變化為纖維卵白本領(lǐng)的過(guò)篩實(shí)行7。體外抗凝活性測(cè)定效果表白，日本醫(yī)蛭總提物能延伸APTT，PT，TT時(shí)間，說(shuō)嫡本醫(yī)蛭飲片中存在對(duì)內(nèi)源性，外源性凝血體系和配合途徑產(chǎn)生抗凝作用的有用物質(zhì)。進(jìn)一步根據(jù)總提物中分子的差異極性用差異極性的有機(jī)溶劑萃取，分成石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部位。此中石油醚部位有顯著的抗凝血活性，延伸PT、APTT時(shí)間，且抗凝血作用與濃度成正相干，說(shuō)嫡本醫(yī)蛭抗凝身分除了水蛭素外，另有低極性的小分子物質(zhì)。這和文獻(xiàn)6報(bào)道螞蟥的抗凝身分重要為中等極性分子有必然收支。也有人報(bào)道8水蛭粗粉經(jīng)甲醇提取后用差異極性的有機(jī)溶劑萃取，此中脂溶性部門表示有較強(qiáng)的抗凝血活性，因此可以必定的是水蛭中除了卵白多肽等水溶性抗凝活性身特別，還存在低極性的小分子抗凝活性身分。至于是何種詳細(xì)身分及其作用機(jī)理有待更進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1譚毓治，徐彭，張孝友，等.去頭水蛭醇提物抗血栓作用的研究J.中國(guó)中藥雜志，1999，2410：622.2國(guó)度藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，部S.北京：化學(xué)產(chǎn)業(yè)出書(shū)社，2022：57.3中國(guó)藥用動(dòng)物志.天津：天津科技出書(shū)社，1979：8.4賈元印.水蛭中抗凝血物質(zhì)的提取及藥理實(shí)行J.山東醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，1990,9(1)：1.5潘賀，剛宏林，蘇云明.中藥水蛭的活性身分及藥理作用研究外表J.中醫(yī)藥信息，2022，231：20.6