共培養(yǎng)模型.ppt.Convertor

1、腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立技術(shù)背景在腫瘤生長早期，實體腫瘤生長到1到2mm后，其繼續(xù)生長就會依賴新生血管的形成。在此之前，腫瘤細(xì)胞本身已經(jīng)釋放了大量的促血管新生因子誘導(dǎo)腫瘤血管新生。這些新生血管是腫瘤和外界進(jìn)行物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，血管新生與惡性腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，研究血管新生的機理研究，特別是早期的腫瘤血管新生，顯得非常必要和迫切。建立腫瘤血管新生模型是研究其形成機制的重要手段。其中，體外共培養(yǎng)模型是模擬體內(nèi)腫瘤血管新生的有效方法細(xì)胞共培養(yǎng)的概念及意義概念：體外細(xì)胞共培養(yǎng)（cellco-culture）：是將兩種細(xì)胞（可以來自同一種組織，也可以來自不同的組織）混合共同

2、培養(yǎng)，從而使其中一種細(xì)胞的形態(tài)和功能穩(wěn)定表達(dá)，并維持較長時間。意義：該技術(shù)能模擬體內(nèi)生成的微環(huán)境,便于更好地觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機制和可能作用的靶點,填補了單層細(xì)胞培養(yǎng)和整體動物實驗的鴻溝。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)目前涉及的方面細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸、作用,引起胞質(zhì)膜的直接接觸并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)ECM,其含有間質(zhì)膠原、纖連蛋白、蛋白多糖及層粘連蛋白等成分,從而模擬了與體內(nèi)相似的微環(huán)境,維持細(xì)胞的立體構(gòu)形及促進(jìn)細(xì)胞的功能細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用,觀察細(xì)胞共培養(yǎng)后其功能、性狀和生長行為的變化,如某一細(xì)胞的分泌物對另外一種細(xì)胞基因表達(dá)的影響,細(xì)胞與細(xì)胞之間的“對話”等研究

3、藥物對細(xì)胞形態(tài)、功能的影響以及相關(guān)機制,為新藥研發(fā)提供重要技術(shù)支持我們現(xiàn)在所做的課題與后兩項有關(guān)。常用細(xì)胞共培養(yǎng)方法：直接接觸式共培養(yǎng)：在合適的條件下，將兩種細(xì)胞按照一定比例在同一培養(yǎng)皿中共同培養(yǎng)。利用兩種細(xì)胞或組織接觸，通過旁分泌、自分泌分泌細(xì)胞因子或直接接觸等相互作用方式缺點：兩種細(xì)胞分離較困難，不便于觀察和后續(xù)檢測。直接接觸式共培養(yǎng)非直接接觸式共培養(yǎng)非直接接觸式共培養(yǎng)：共培養(yǎng)體系中一者對另者的影響是通過旁分泌的細(xì)胞因子相互作用，但兩者不接觸。由于兩種細(xì)胞容易分離，便于觀察和不影響后續(xù)的檢測。包括以下3種方法：（1）用一種細(xì)胞的培養(yǎng)上清液（含有不同生長因子）與另外一種細(xì)胞共培養(yǎng)。（2）將玻

4、片上（經(jīng)過1型膠原凝膠預(yù)處理）培養(yǎng)的細(xì)胞B,以一定的比例放入細(xì)胞A的培養(yǎng)皿中與其共培養(yǎng)。（3）Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿（Transwell小室）是一類有通透性的杯狀裝置,杯子底層放一張有通透性的膜,一般常用的是聚碳酸酯膜，孔徑大小有0.112.0um.將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，細(xì)胞A種在上室內(nèi)，下層種植的細(xì)胞B其培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞,從而可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細(xì)胞A的影響三維細(xì)胞培養(yǎng)（threedimensionalcellculture，TDCC）：TDCC是將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使得細(xì)胞能夠分化產(chǎn)

5、生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu),構(gòu)成三維細(xì)胞載體復(fù)合物,如現(xiàn)在常用的基質(zhì)膠（matrigel）,是一種從小鼠腫瘤組織中提取的物質(zhì)。在室溫下，它形成類似于體內(nèi)的細(xì)胞外基底膜的膠狀結(jié)構(gòu)，把內(nèi)皮細(xì)胞培Matrigel膠內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出新生血管的特征。Matrigel膠方法的局限性是并不能很好模仿體內(nèi)腫瘤和血管內(nèi)皮的微環(huán)境，細(xì)胞分離及提取困難，而且細(xì)胞因子的彌散受到一定的影響。本實驗選擇：用一種細(xì)胞的培養(yǎng)上清液（含有不同生長因子）與另外一種細(xì)胞共培養(yǎng)。操作步驟：腫瘤條件培養(yǎng)基的收集：取腫瘤細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)（含10%胎牛血清和雙抗），當(dāng)細(xì)胞早期融合時，吸取腫瘤細(xì)胞上清液儲存起來，并為細(xì)胞更換

6、新的DMEM培養(yǎng)基。此后，每兩天收集腫瘤細(xì)胞上清液一次。收集的條件培養(yǎng)基離心（2000rpm,10min），并濾過（0.22um微孔膜）以除去漂浮的腫瘤細(xì)胞。該腫瘤條件培養(yǎng)基儲存于-20度。使用前解凍離心。取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿或N孔板內(nèi)，貼壁培養(yǎng)12小時后吸去培養(yǎng)液，加入腫瘤條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。可根據(jù)實驗需要決定換液時間。檢測相關(guān)指標(biāo)。參考實驗一：CL聯(lián)合苦參堿抑制胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長實驗方法：取人胃癌細(xì)胞株SGC-7901于DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，吸取上清液，用DMEM培養(yǎng)液配成含7.25%,12.5%,25%,50%4

7、個質(zhì)量濃度的腫瘤上清培養(yǎng)液。當(dāng)HUVEC細(xì)胞長成單層后，經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，100uL/孔，貼壁12小時，吸去培養(yǎng)液，加入上述4個質(zhì)量濃度的腫瘤上清培養(yǎng)液100ul/孔，對照組加等量含10%血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，加MTT在酶標(biāo)儀上測570處的值。本實驗在同一條件下重復(fù)3次，取3次實驗值的均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。確定腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的最佳劑量。結(jié)果：與對照組相比，SGC-7901全部濃度組均顯著促內(nèi)皮細(xì)胞生長，（P0.05），見圖1建議：取完全腫瘤培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC討論：在體內(nèi)，腫瘤的血管新生刺激因子主要來源于腫瘤細(xì)胞，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（

8、VEGF），成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）是主要的正性調(diào)節(jié)因子。胃癌細(xì)胞存在VEGF及FGF表達(dá)的增多。VEGF是一種分泌型糖蛋白細(xì)胞因子，在體外培養(yǎng)時，VEGF主要存于培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中，本實驗證實了人胃癌SGC-790能促進(jìn)EVC304的生長。參考實驗二：多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響及其機制的初步研究評價MM細(xì)胞對HUVEC血管新生能力的影響方法采用人MM細(xì)胞系RPM18226細(xì)胞或原代MM細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）混合共培養(yǎng)和隔離共培養(yǎng)；以同期單獨培養(yǎng)的HUVEC為對照，對與MM細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVEC進(jìn)行Matrigel基質(zhì)管狀結(jié)構(gòu)形成實驗，評價MM細(xì)胞對HUV

9、EC血管新生能力的影響；采用ELISA方法檢測兩種共培養(yǎng)體系培養(yǎng)上清中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的含量；結(jié)果：與同期單獨培養(yǎng)的HUVEC相比，與RPM18226細(xì)胞隔離共培養(yǎng)的HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯增多，但增加幅度（約75）低于混合共培養(yǎng)體系（約113）。原代MM細(xì)胞促HUVEC管狀結(jié)構(gòu)形成效應(yīng)在隔離共培養(yǎng)體系和混合共培養(yǎng)體系分別為138與188。HUVEC單獨培養(yǎng)上清中BDNF的含量為（12451）ngml，RPM18226細(xì)胞混合共培養(yǎng)上清和隔離共培養(yǎng)上清的BDNF含量分別為（38582）ngml和（31672）ng/ml;原代MM細(xì)胞混合共培養(yǎng)上清和隔離共培養(yǎng)上清的BDNF含量

10、分別為（37.1土&7）ngml和（27976）ngml參考實驗三：VEGF高表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6對共培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Flk一1及Flt一1的影響方法：實驗組1（c6細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)）:C6以1X106的量接種于直徑85cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，12h后，內(nèi)皮細(xì)胞以5X105的量接種于2.4cmX5.0cm玻片上，玻片需經(jīng)1型膠原凝膠預(yù)處理。內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)12h培養(yǎng)后已貼壁生長良好，將其放人生長有C6細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液小牛血清濃度降至2，繼續(xù)共培養(yǎng)。實驗組2:（BRL3A+內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)）對照組：（內(nèi)皮細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)）細(xì)胞接種量及培養(yǎng)時間及方法完全同實驗組1。結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)

11、果實驗組1內(nèi)皮細(xì)胞Flk-1,Flt-1的染色加深，陽性細(xì)胞核強陽性細(xì)胞百分率顯著大于對照組，而實驗組2的Flk-1,Flt-1的染色變淺，陽性細(xì)胞核強陽性細(xì)胞百分率明顯低于對照組，見圖1結(jié)果2.RTPCR檢測Fikl、Fit一1mRNA的表達(dá)：以GAPDH為內(nèi)參照，可見實驗組1的Flk一1、F1t一1mRNA的表達(dá)明顯多于對照組（P0.01），而實驗組2的Flk一F1t一1mRNA的表達(dá)明顯低于對照組（P0.01）。瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖2、3所示，電泳圖像灰度分析結(jié)果見圖4參考實驗四：體外共培養(yǎng)研究乳腺癌細(xì)胞株MCF-7對正常內(nèi)皮細(xì)胞的作用方法：內(nèi)皮細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞株MCF-7共培養(yǎng)體

12、系中，內(nèi)皮細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的初始細(xì)胞濃度比為2：1。經(jīng)本研究實驗篩選，內(nèi)皮細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的細(xì)胞培養(yǎng)液采用Z-MCF-7-EC（其中含有FBS、Hepes、谷氨酰胺），細(xì)胞培養(yǎng)時間為1周。共培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞采用步驟2中免疫磁珠技術(shù)分選。透射電鏡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、光鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，并以看家基因B2m為內(nèi)參照進(jìn)行ESM、IGFBP3、ave3、VE-C、及Tie-2-2基因半定量RT-PCR表達(dá)分析，以縮時錄像技術(shù)進(jìn)行血管新生觀察結(jié)果：1.形態(tài)：經(jīng)共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與正常內(nèi)皮細(xì)胞比較不規(guī)則呈現(xiàn)游走狀;在透射電鏡下觀察具有瘤性特征：（1）細(xì)胞核膨大、核胞比側(cè)增大、核仁增大;（2）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松、變形;（3）細(xì)胞表而纖毛減少;（4）細(xì)胞表面窗孔加深，（5）細(xì)胞間隙增大。（圖5）內(nèi)皮細(xì)胞的管形成：經(jīng)乳腺痛細(xì)胞株MCF-7作用后的內(nèi)皮細(xì)胞，有明顯管型形成（圖6），而同期對照培養(yǎng)的正常內(nèi)皮細(xì)胞無此現(xiàn)象。相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果：住經(jīng)乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的正常內(nèi)皮細(xì)胞與未經(jīng)共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞間有相關(guān)基因的差異表達(dá)（圖7.表1）小結(jié)通過