2015主管臨床醫(yī)學檢驗免疫學和免疫講義

1、第十章 化學發(fā)光免疫技術第一節(jié) 概述發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標記免疫分析技術。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應的高特異性。發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并光子的過程。光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光。一、化學發(fā)光化學發(fā)光是指伴隨化學反應過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質（發(fā)光劑）在化學反應時，吸收了反應過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應的產(chǎn)物分子或反應的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式出能量，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。化學發(fā)

2、光與熒光的區(qū)別是形成激發(fā)態(tài)分子韻激發(fā)能不同。熒光是吸收了光能使分子激發(fā)而發(fā)射的光；而化學發(fā)光是吸收了化學能使分子激發(fā)而發(fā)射的光。因此，化學發(fā)光反應的首要條件是反應必須提供足夠的化學能。通常只有那些反應速度相當快的放能反應，才能在可見光范圍內觀察到化學發(fā)光現(xiàn)象，而氧化-還原反應所提供的能量介于其中，因此大多數(shù)化學發(fā)光反應為氧化-還原反應。第二個條件是吸收了化學能而處于激發(fā)態(tài)的分子或原子，必須能出光子或者能將能量轉移到另一個物質的分子上并使其激發(fā)，當這種激發(fā)分子回到基態(tài)時一些化學反應能出光子。足夠的能量把參加反應的物質激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應產(chǎn)物分子，則這種反應過程稱為直接

3、化學發(fā)光。二、化學發(fā)光效率化學發(fā)光反應的發(fā)光效率又稱化學發(fā)光反應量子產(chǎn)率。化學發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率。化學發(fā)光反應的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質的性質所決定，每一個發(fā)光反應都具有其特征性的化學發(fā)光光譜和不同的化學發(fā)光效率。因此，可設計出不同的反應模式。第二節(jié) 化學發(fā)光劑和標記技術一、化學發(fā)光劑在化學發(fā)光反應中參與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式能量的化合物。能作為化學發(fā)光劑的有機化合物必須具備下列條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理、化學特性要與被標記或測定的物質相匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結合物；其化學發(fā)光常是氧化反應

4、的結果；在所使用的濃度范圍內對生物體沒（一）直接化學發(fā)光劑性。在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用。包括吖啶酯和三聯(lián)吡啶釕。（二）酶促反應發(fā)光劑利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。目前化學發(fā)光酶免疫分析中常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶。辣根過氧化物酶催化的發(fā)光劑為堿性磷酸酶催化的發(fā)光底物為 AMPPD。及其衍生物。二、發(fā)光劑的標記技術發(fā)光劑的標記是通過化學反應將發(fā)光劑連接到抗體或抗原上。標記反應分為“直接偶聯(lián)”和“間接偶聯(lián)”兩種方式。（一）常用標記方法碳二亞胺縮合法過碘酸鈉氧化法重氮鹽偶聯(lián)法4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法（二）影響標記的發(fā)光劑的選擇被標記蛋白質的性質標

5、記方法的選擇原料比標記率溫度純化與保存第三節(jié) 化學發(fā)光免疫分析的類型一、直接化學發(fā)光免疫分析直接化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體（抗原），與待測標本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和糾正液（NaOH）使呈堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光，由集光器和光電倍增管接收，時間內所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。二、化學發(fā)光酶免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶

6、（ALP）來標記抗體（或抗原），與待測標本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相抗體一待測抗原一酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。三、電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）與一般化學發(fā)光分析不同，是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場中因電子轉移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。在電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體抗體（抗原），用三聯(lián)吡啶釕標記抗體（抗原），在反應體系內待測標本與相應的抗體發(fā)生免疫反應，形成磁性微?？贵w-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入室，同時引入 TPA 緩沖液。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應，使三聯(lián)吡啶釕和 TPA 在電極表面進行電子轉移，產(chǎn)生電化學發(fā)光。光信號由安裝在室上方的光信號檢測器檢測，光的強度與待測抗原的濃度