藥物分析學(xué)：生物藥物分析概論

1、第十章 生物藥物分析概論生物藥物分析的特點(diǎn)（書P236）相對分子量的測定生物活性檢查安全性檢查效價(jià)測定結(jié)構(gòu)確證第一節(jié) 生化藥物一、生化藥物種類例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。二、鑒別方法1、化學(xué)鑒別法例：谷氨酸(Glutamic Acid)片的鑒別 取本品的細(xì)粉適量(約相當(dāng)于谷氨酸5 mg)加水5ml，加熱使谷氨酸溶解，濾過，取濾液，加茚三酮約5 mg，加熱，溶液顯藍(lán)至藍(lán)紫色。2、光譜鑒別法利用藥物的光譜特性如UV或IR特征吸收而進(jìn)行鑒別例：細(xì)胞色素C的鑒別 取含鐵量項(xiàng)下的供試品溶液1ml，置50 ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉約15 mg，搖勻，測定，在

2、520、550 nm波長處有最大吸收，在535 nm波長處有最小吸收。原理：細(xì)胞色素C是以含鐵卟啉為輔基的結(jié)合蛋白，當(dāng)其結(jié)構(gòu)中鐵原子為三價(jià)(Fe3+)時(shí)，它是氧化型的細(xì)胞色素C，但接受一個(gè)電子變成二價(jià)鐵(Fe2+)后，就成了還原型的細(xì)胞色素C。在磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)中，其還原型在550、520與415nm波長處有最大吸收，而其氧化型在280、361、410與529nm波長處有最大吸收，故可采用UV進(jìn)行鑒別。3、HPLC法利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。例：胰島素的鑒別 采用HPLC法，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠(5 m)，柱溫40，流動(dòng)相為0.1

3、mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=3.0)乙腈(7327)，檢測波長214 nm。取胰島素(豬或牛)對照品及供試品適量，分別加0.01mol/L鹽酸溶液制成濃度為40 U/ml的溶液，各取5 L進(jìn)樣，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與同種屬對照品主峰的保留時(shí)間一致。4、酶法例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法原理：5、電泳法：以肝素鑒別為例與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動(dòng)位置相應(yīng)6、生物鑒別法利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素利用胰島素的降糖作用，給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。7、肽圖鑒別法肽圖譜分析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白

4、水解酶，一般為肽鏈內(nèi)切酶，作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)，將蛋白質(zhì)裂解成較小的片斷，經(jīng)分離檢測形成特征性指紋圖譜。三、檢查 有效成分在生物材料中濃度很低，雜質(zhì)的含量相對比較高，因此，雜質(zhì)檢查和安全性檢查就顯得非常重要。生化藥物應(yīng)保證符合無毒、無菌、無熱源、無致敏源和降壓物質(zhì)等一般安全性要求。（一）雜質(zhì)檢查 一般雜質(zhì)檢查：氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬等 特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查 如：原料藥純度分析多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質(zhì)酶類藥物-酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。例：糜蛋白酶中胰蛋白酶的檢查吸取供試品溶液(10 mg/ml) 50l與0.1

5、%胰蛋白酶對照品溶液5l，分別置白色點(diǎn)滴板上，各加對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽試液0.2 ml，放置后，供試品溶液應(yīng)不呈現(xiàn)紫紅色或呈色時(shí)間晚于胰蛋白酶對照品溶液(1.0)。（二）安全性試驗(yàn)1、熱源與細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn) ：ChP中的熱原檢查采用家兔法，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用鱟試劑法2、異常毒性試驗(yàn)：急性毒性物質(zhì)用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。3、過敏試驗(yàn)：異性蛋白有可能存在異性蛋白的藥物應(yīng)作過敏試驗(yàn)。4、降壓物質(zhì)試驗(yàn)：降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)

6、。5、無菌試驗(yàn)檢查藥品及敷料是否染有活菌： 無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢測手段。要使藥品真正達(dá)到無菌，首先應(yīng)嚴(yán)格 執(zhí)行GMP管理制度。四、含量測定1、含量表示方法：百分含量適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物生物效價(jià)或酶活力單位適用于酶類、蛋白質(zhì)類藥物理化分析法： 化學(xué)分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學(xué)分析法光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法色譜分析法：HPLC法（RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、灌注色譜法、HPCE法）酶法：酶活力測定法、酶分析法電泳法生物檢定法2、酶分析法以酶能專一而高效地催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶反應(yīng)速度的測定或?qū)ι晌?/p>

7、等濃度的測定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量。包括酶活力測定法和酶法分析兩種類型。3、酶活力測定法（1）概念：（2）酶活力評價(jià)指標(biāo) 酶的活力單位（enzymatic activity unit）定義：一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化一定量底物所需酶的量。酶在25以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、最適當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量為一個(gè)活性單位，用IU表示。 酶的比活性（specific activity）定義：每毫克蛋白質(zhì)中所含的酶單位數(shù)，用IU/（mg 蛋白質(zhì)）表示錯(cuò)誤的說法：每毫克酶的活力單位數(shù)在酶高度純凈，酶的分子量已知時(shí)，可采用分子活力表示（3）酶促反應(yīng)的條件及影響因素：如

8、何選擇酶促反應(yīng)的條件：使所有待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。 底物濃度影響：反應(yīng)速率受到底物濃度影響 S100Km pH影響：pH影響酶的活性和反應(yīng)方向 溫度影響： 直接影響化學(xué)反應(yīng)速度，影響酶通常選用25，30或37 （0.1） 輔助因子影響：有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時(shí)需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。 空白和對照：空白是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量；通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經(jīng)過失效處理）；提供未知因素的影響。對照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要用于比較或標(biāo)定。（4

9、）測定方法包括物理法、化學(xué)法和酶分析法常用方法有：按取樣和檢測方式分為取樣測定和連續(xù)測定： 取樣測定酶反應(yīng)開始后不同的時(shí)間，取出一定量反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，對產(chǎn)物和底物進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。加入酶變性劑加熱使酶變性 連續(xù)測定基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測的方法。從準(zhǔn)確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。取樣測定法目前仍廣泛采用，這是因?yàn)椋篴. 它不需要特殊儀器；b. 幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出具體測定方法c. 由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色

10、基團(tuán)或熒光基團(tuán)。 檢測方法：常用UV-Vis和熒光分光光度法UV-Vis分光光度法：產(chǎn)物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。如：細(xì)胞色素氧化酶的底物為細(xì)胞色素C，該物質(zhì)的還原態(tài)在550nm的摩爾吸收系數(shù)為2.18104，而氧化態(tài)為0.80104，可利用這種吸收度差別來進(jìn)行測定。熒光分光光度法產(chǎn)物和底物之一有熒光，熒光強(qiáng)度變化可指示反應(yīng)速度。特別適于酶量或底物量極低時(shí)的快速分析。旋光度法某些酶反應(yīng)過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的方法可用時(shí)，可考慮用旋光度測定法其它法酶偶聯(lián)測定、電化學(xué)測定、放射化學(xué)法等（5）計(jì)算：第二節(jié) 生物制品生物制品：是應(yīng)用普通的生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及組織

11、等生物材料制備用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。一、生物制品的分類1、疫苗類藥物：細(xì)菌疫苗、病毒疫苗、聯(lián)合疫苗、 2、抗毒素及抗血清類藥物：被動(dòng)免疫制劑3、血液制品4、重組DNA制品：細(xì)胞因子、生長因子、酶、抗體5、診斷制品 6、其他制品二、質(zhì)量控制特點(diǎn)生物制品的質(zhì)量需要從原材料、生產(chǎn)過程到最終產(chǎn)品進(jìn)行全過程控制，對原液、半成品和成品進(jìn)行微生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)檢定。質(zhì)量突出體現(xiàn)在安全性和有效性。三、物理化學(xué)檢定生物制品的物理化學(xué)檢定包括鑒別、物理性狀檢查、分子量測定法、蛋白質(zhì)含量測定、防腐劑含量測定、純度檢查、安全性檢查、生物制品的效力測定等1、生物制品的鑒別生鑒別方法包括理化方法和生物學(xué)方

12、法理化方法：常用的有HPLC法生物學(xué)方法：依據(jù)生物制品的生物學(xué)特點(diǎn)，利用免疫學(xué)等方法進(jìn)行真?zhèn)蔚呐袛?，常用的有免疫印跡法、免疫斑點(diǎn)法、免疫雙擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫法等例 重組人生長激素的鑒別：在相關(guān)蛋白質(zhì)檢查項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間響應(yīng)與相應(yīng)的對照品(重組人生長激素或甲?；亟M人生長激素對照品)的保留時(shí)間一致；取對照品溶液和供試品溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品的肽圖譜應(yīng)與對照品的肽圖譜一致。例 ChP中注射用重組人促紅素(CHO細(xì)胞)、注射用重組人干擾素1b、注射用重組人干擾素2a、注射用重組人干擾素2b、注射用重組人白介素-2等33種生物制品均采用免疫印跡法鑒

13、別。該法是以供試品與特異性抗體結(jié)合后，抗體再與酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合，通過酶學(xué)反應(yīng)的顯色，對供試品的抗原特異性進(jìn)行檢查。2、物理性狀檢查主要包括外觀、真空度及溶解時(shí)間檢查。制品外觀異常往往會(huì)涉及制品的安全和效力，一般以澄明度來檢查外觀類型不同的制品。真空封口的凍干制品應(yīng)進(jìn)行真空度及溶解時(shí)間檢查，通?？捎酶哳l火化真空測定器檢查其真空度，凡有真空度者瓶內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)紫色輝光。3、分子量的測定通常采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。多數(shù)蛋白質(zhì)與陰離子表面活性劑SDS按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白質(zhì)分子的凈電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)，使蛋白質(zhì)按分子

14、大小分離。4、蛋白質(zhì)含量測定很多生物制品的有效成分是蛋白質(zhì)。類毒素、抗毒素、血液制品和基因工程產(chǎn)品等需要測定蛋白質(zhì)含量，以檢查其有效成分，計(jì)算純度和比活性。ChP采用的測定方法有凱氏定氮法、酶試劑法(Lowry法)和雙縮脲法。凱氏定氮法：通過測定供試品的總氮含量以及經(jīng)鎢酸沉淀法去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。一般步驟是將一定量的供試品置于凱氏燒瓶中，加硫酸、硫酸鹽及適當(dāng)?shù)拇呋瘎訜嵯?，使有機(jī)分子破壞分解，將氮完全轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，加氫氧化鈉溶液堿化，將游離出的氨蒸餾出來，并由2硼酸溶液吸收，然后用硫酸滴定液進(jìn)行滴定。5、純度檢查抗毒素、類毒素、血液制品和基因工程產(chǎn)品在

15、制造中，經(jīng)過精制提純，故要求檢查純度，通常采用電泳法和高效液相色譜法檢查。四、安全性檢定生物制品的安全檢定有一般安全檢查；殺菌、滅活和脫毒情況的檢查；外源性污染物檢查和過敏性物質(zhì)檢查。1、一般安全檢查包括無菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)等。2、 疫苗和類毒素制品的菌毒種多為致病性強(qiáng)的微生物，如未被殺死或解毒不完全，在生物制品的使用中就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重事故，因此需要進(jìn)行活毒檢查、解毒試驗(yàn)和殘余毒力試驗(yàn)。3、抗毒素是采用異種蛋白為原料所制成，因此需要檢查過敏原是否符合限度要求。4、外源性污染物檢查主要有野毒檢查、支原體檢查、乙肝表面抗原和丙肝抗體檢查、外源DNA測定和殘余宿主細(xì)胞蛋白測定。宿主細(xì)胞蛋白殘留量的檢查目的：控制異源蛋白的含量以防超量后引起機(jī)體免疫反應(yīng)測定法：酶聯(lián)