GFP發(fā)展歷程及展望

1、XXXX大學(xué)研究生作業(yè)（論文）專用封面作業(yè)（論文）題目：GFP發(fā)展歷程及展望課程名稱：植物學(xué)任課教師姓名：XXX研究生姓名：XXXXX學(xué) 號：XXXXXXXXXXXXXXXXXX年級：XXXXXXXXXXX專業(yè)：植物學(xué)學(xué)院（部、所）：生命科學(xué)學(xué)院任課教師評分：GFP發(fā)展歷程及展望摘要：綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用前景廣闊。就GFP 的發(fā)現(xiàn)以及發(fā)展歷程與應(yīng)用研究進行了綜述。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白(GFP)；熒光特性；應(yīng)用。GFP及其突變體已被廣泛應(yīng)用于基因表達調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位、生物分子 之間相互作用、轉(zhuǎn)基因動物等方面。基于新型功能熒光蛋白(如光激活熒光蛋白 和

2、光轉(zhuǎn)換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等)的光學(xué)分子成像技術(shù)的發(fā)展.為在活 細(xì)胞乃至活體動物內(nèi)研究基因表達和蛋白質(zhì)功能提供了更多的選擇空間。GFP的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程2008年10月8日，瑞典皇家科學(xué)院在斯德哥爾摩宣布，將2008年諾貝爾化學(xué) 獎授了3位美國科學(xué)家：美國Woods Hole海洋生物學(xué)實驗室的下村修(Osamu Shimomura)、哥倫比亞大學(xué)的馬丁 沙爾菲(Martin Chalfie)和加州大學(xué)圣地亞 哥分校的錢永健(Roger Y.Tsien).以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋。其中， Shimomura首次從水母(Aequorea victoria)中分離出GFP，他發(fā)現(xiàn)該蛋

3、白質(zhì)在紫 外線照射下會發(fā)出明亮的綠光；Chalfie首次發(fā)現(xiàn)在無任何底物和輔助因子情況 下GFP在活細(xì)胞內(nèi)發(fā)熒光.因此.GFP可標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)：Tsien則率先提出了 GFP發(fā)光的化學(xué)機制，并發(fā)展了不同顏色的GFP突變體。1962年下村修等1在太平洋的多管水母(Aequorea vitofia)中發(fā)現(xiàn)了能夠釋 放出生物熒光的蛋白質(zhì).1974年，他們純化了該蛋白質(zhì)一一綠色熒光白(green fluorescent protein，GFP)。GFP純化后的30年中，并沒有太多研究人員關(guān)注并 開展該方面的研究。直到1992年，道格拉斯普雷沙(Douglas Prasher)才克隆 出GFP的cDN

4、A序列2.但遺憾的是他并沒有繼續(xù)深入研究。真正意識到GFP應(yīng)用前 景的是Chalfie，1994年他在科學(xué)(Science)上發(fā)表了題為Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression的論文.在該文中首次報道 GFP 可以在細(xì)菌和線蟲內(nèi)發(fā)光.為標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)提供了較好的方法3。與此同時， Tsien率先提出了GFP發(fā)光的化學(xué)機制4，詳細(xì)闡述了GFP是如何發(fā)光的，并于1995 年通過單點突變(S65T)技術(shù)獲得了熒光強度和光穩(wěn)定性大大增強的GFP突變(GFP 一S65T)，該突變體激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488 nm，而發(fā)射峰仍保持在509

5、 nm5。此后，Tsien 發(fā)展了顏色迥異的GFP突變體6、7：藍色熒光蛋白BFP(blue fluorescent protein) 青色熒光蛋白CFP(cyan fluorescent protein)和黃色熒光蛋白YFP(yellow fluorescent protein)，這些不同顏色熒光蛋白的出現(xiàn)為光學(xué)分子成像的發(fā)展打 下了堅實的基礎(chǔ)。1996年GFP晶體結(jié)構(gòu)首次被解析7、8,從此掀起了GFP研究的狂潮。 GFP被譽為“當(dāng)代生物科學(xué)最重要的工具之一”。GFP的熒光性質(zhì)和應(yīng)用優(yōu)點GFP的熒光性質(zhì)特殊，具有諸多優(yōu)點而備受關(guān)注。易于檢測，靈敏度高。GFP熒光反應(yīng)不需要外加底物和輔助因子，

6、只需紫外光 或藍光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到。其次， 即便是未經(jīng)純化的GFP發(fā)射的綠光也是相當(dāng)強的，在正常室內(nèi)光線下仍清晰可辨。 對于單細(xì)胞水平的表達也可識別。熒光性質(zhì)穩(wěn)定GFP對光漂白(一種熒光衰減現(xiàn)象)有較強的耐受性，能耐受長 時間的光照.從而延長了可探測時問；GFP在pH值712范圍內(nèi)也能正常發(fā)光，對 高溫(70C)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數(shù)普通酶都有較強的抗性。對細(xì)胞無毒害。從目前的研究結(jié)果來看，GFP對生活的細(xì)胞基本無毒害，與目 的基因融合后，對目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。構(gòu)建載體方便。由于編碼GFP的基因序列較短，所以

7、很方便地同其他序列一起 構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率?？芍苯佑糜诨罴?xì)胞測定GFP是可在異源細(xì)胞內(nèi)表達后，能自發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋 白，并且GFP的分子量較小，N一端和C一端都能忍受蛋白的融合，是理想的標(biāo)記 物，可進行活細(xì)胞實時定位觀察，更能接近自然真實的狀態(tài)。如在活細(xì)胞中直接 觀察蛋白向細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運動的狀態(tài)，還可實時觀察到外界信號刺激下目的蛋 白的變化過程，借助熒光顯微鏡觀察，使研究更為方便。使用激光共聚焦顯微鏡， 其圖像效果更佳，如果同時結(jié)合現(xiàn)代的計算機軟件，可進行三維顯示。不受假陽性干擾。由于其他生物本身不含有GFP，因此不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果， GFP作為分子探針可以代替熒光染

8、料，避免由于染料擴散造成的定位不準(zhǔn)，使結(jié) 果真實可靠。廣譜性。表現(xiàn)在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物 中都獲得了成功的表達，其次是GFP沒有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個部位 都可以表達發(fā)出熒光。易于得到突變體。如GFP中氨基酸的替換可產(chǎn)生不同光譜特性的突變體，且增 強了熒光強度，適合在不同物種中專性表達。3 GFP帶來的科學(xué)革命從在生物學(xué)方面的應(yīng)用前景來看，GFP的優(yōu)點主要有：分子的亮度非常高， GFP從細(xì)胞內(nèi)發(fā)出信號的信噪比很高；分子的光穩(wěn)定性強；激發(fā)和發(fā)射光譜 范圍寬，通過蛋白質(zhì)工程可以制備具有不同激發(fā)和發(fā)射波長的GFP類分子； 在 細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，GFP分子能夠

9、快速有效折疊，并快速形成發(fā)色團；易于與目 標(biāo)蛋白融合；當(dāng)存在2個不同熒光蛋白分子，且給體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā) 光譜相匹配時它們之間將會發(fā)生有效的能量傳遞，根據(jù)FRET原理可以估算出2 個熒光蛋白之間的距離，甚至可以延伸到同時存在3個熒光蛋白發(fā)色團的情況。GFP用途廣泛，在生物學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。GFP作為報告基因，可用來 檢測轉(zhuǎn)基因效率，把GFP基因連接到目的基因的啟動子之后，通過測定GFP的熒光 強度就可以對該基因的表達水平進行檢測。GFP可作為標(biāo)簽融合到主體蛋白中來 檢測蛋向質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子問的相互作用，或者靶向標(biāo)記 某些細(xì)胞器。GFP具有同宿主蛋白構(gòu)成融合子的性

10、質(zhì)，利用這一性質(zhì)，可以將GFP 定位到特定的細(xì)胞器和膜系統(tǒng)中，進行細(xì)胞生理過程、細(xì)胞動力學(xué)等的實時觀測， 或直接應(yīng)用于定量分析。GFP還可以作為生物傳感器檢測活細(xì)胞的pH值，檢測亞 細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鹵素離子的濃度和傳遞。GFP還可以用于細(xì)胞的篩選和藥物的篩選。 GFP帶來的科學(xué)革命體現(xiàn)在諸多方面。最常見的GFP應(yīng)用，是用來觀察目標(biāo)蛋白在表達過程中的位置、遷移及其化學(xué) 反應(yīng)。例如在細(xì)胞周期中，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同時期的定位；在用GFP標(biāo)記后， 通過在MinDE系統(tǒng)中的兩極間振動，可以確定出細(xì)菌細(xì)胞中心點的位置，進而研 究隔膜的形成和細(xì)胞分裂。用一些不同發(fā)射波長的GFP標(biāo)記細(xì)胞中的不同蛋白群 體，可以提供

11、這些蛋白對化學(xué)抑制劑變異以及基因突變做出相應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)。 另一個應(yīng)用是觀察基因的時序表達，比如鞭毛等運動大分子的形成。基于GFP熒光的單細(xì)胞、單分子顯微技術(shù)提供了另一個研究細(xì)胞內(nèi)詳細(xì)動力學(xué) 過程的窗口。例如，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與一個熒光蛋白分子緊密結(jié)合時，可以檢測到 清晰的熒光。如果這個熒光蛋白自由分散在細(xì)胞內(nèi)，并沒有與細(xì)胞內(nèi)特定物質(zhì)相 結(jié)合，那么它的熒光就會淹沒在背景熒光之中。2個目標(biāo)蛋白分別用具有不同發(fā)射波長的2種GFP分子標(biāo)記，將它們混合在一起 后，通過激光光照，使2種不同波長的熒光相互重疊，再分析光信號，就可以分 辨出這2種目標(biāo)蛋白是各自獨立分散的，還是以一種結(jié)合物的形式存在的。許多基于G

12、FP的技術(shù)已經(jīng)被用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的遷移作用。通過GFP標(biāo)記蛋 白發(fā)現(xiàn)，高爾基體可以接收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌物，又不停地將它自己的成分循環(huán)回內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)再利用，在有絲分裂期間又會分解。在細(xì)胞核結(jié)構(gòu)方面，基于GFP的研究表 明，在細(xì)胞間期的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)是動態(tài)的和自我組裝起來的。4問題與展望從1994年Chalfi e等首次在果蠅、大腸桿菌等生物體內(nèi)成功表達GFP基因到現(xiàn) 在已有十幾年的歷史，越來越多的研究人員將其作為又一快速高效的研究工具。 雖然GFP在分子生物學(xué)的眾多研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，GFP本身也將不斷地被改 進及優(yōu)化，GFP的應(yīng)用在技術(shù)上將出現(xiàn)更多的創(chuàng)新，其應(yīng)用范圍將會越來越開闊。 但在研究中仍然存

13、在著一系列的問題，包括： 檢測靈敏度還有待提高，而且 其熒光信號強度方面的非線性性質(zhì)使得定量非常困難也有待于進一步研究。 新生GFP通過折疊和加工成為具有活性的形式其過程十分緩慢。紫外激發(fā)對某 些GFP有光漂白和光破壞作用，會導(dǎo)致熒光信號快速喪失。多數(shù)生物具有微弱 的自發(fā)熒光現(xiàn)象，并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長，這些熒光背景會影響某些GFP 的檢測。目前為止.大約有幾十種不同特性的熒光蛋白可供選擇使用，這些蛋白質(zhì)的 熒光光譜幾乎覆蓋了整個可見區(qū)9。一個好的熒光蛋白需具備以下幾個特點：抗 酸、抗漂白、亮度高、成熟快及單體結(jié)構(gòu)。隨著對GFP的基礎(chǔ)理論研究的深入， 新一代GFP衍生物熒光信號和蛋白的可溶

14、性等的明顯提高，成像技術(shù)和顯微鏡的 改進，新型計算機及應(yīng)用程序的出現(xiàn)，相信這些問題終將得到解決。與此同時， 隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)的日益成熟，GFP一定會帶來更多的應(yīng)用價值， 并進一步揭開生命的未解之謎。但是，基于細(xì)菌間高頻的基因轉(zhuǎn)移而帶來的安全 性的問題。研究者應(yīng)該謹(jǐn)慎地在開放的環(huán)境中使用含有GFP基因的轉(zhuǎn)基因工程菌， 從而減少由此可能帶來的對人類及環(huán)境潛在的風(fēng)險。參考文獻：Shimomura 0， Hohason F H， Saiga Y. Extraction， purification and properties of aequorin， a bioluminescent p

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