分離組織膜蛋白的方法(共10頁)

1、分離組織(zzh)膜蛋白的方法：1）取組織適量，加入(jir)10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。2）1000g下4離心(lxn)10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。3）105000g，4離心 1 hr。棄去上清，沉淀用適量的 Buffer B重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管， Eppendorf臺式離心機(jī)10000rpm，4離心30min。4）收集所得上清液即為膜組份。Buffer A：0.32M surcose，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/

2、ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，1(W/V)SDS ,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上預(yù)冷。2、分離膜蛋白的方法（操作）1）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：1 冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融2次。2 5000轉(zhuǎn)4度離心，驅(qū)除核及未裂解的細(xì)胞。3 取上清12000轉(zhuǎn)4度離

3、心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。4 12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測蛋白濃度,SDS電泳，分裝后-20度保存?zhèn)溆?。buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer C : 0.5ug/ml Leup

4、eptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：1、細(xì)胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min3、刮下單層細(xì)胞，4度下10 000g 5min離心4、溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心7、按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積8、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污

5、相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)試劑：1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑2、緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）3、buffer C10mmol/L Tris HCl(pH7.5)150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA(PH7.5)3）分離細(xì)胞膜蛋白(dnbi)的方法：7M urea2M thiourea4%chaps2.5%sb3-101000000個(gè)細(xì)胞(xbo)，可用此 buffer 1ml。 冰浴勻漿。冰上置30分鐘。4度高速低溫(dwn)離心30min。取上清-20保存。

6、4）分離組織膜蛋白的方法：1、取組織，加入10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。2、J6-HC離心機(jī)800rpm，4離心10min后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。3、100000g，4離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的 Buffer B重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管， Eppendorf臺式離心機(jī)10000rpm，4離心30min。4、收集所得上清液即為膜組份。Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin

7、 A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上預(yù)冷。5）分離組織膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP400.5去氧膽酸鈉0.1%SDS以下用時(shí)加入10mg/ml PMSF異丙醇（終濃度10ul/ml）Aprotinin（30ul/ml）1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）冰

8、凍組織100mg/細(xì)胞1000000個(gè)，可用RIPA buffer 1ml。 冰浴勻漿。冰上置30分鐘。4度高速離心30min，20000轉(zhuǎn)低溫離心最佳。取上清-20保存。6）分離(fnl)細(xì)菌膜蛋白的方法： 于20ml 營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)(piyng)細(xì)菌，37，200rpm。 10000g、20min、4離心(lxn)，去上清。 20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液。 超聲波破碎細(xì)菌。 3000g，10min、室溫下離心去除未破碎細(xì)菌。小心吸取上清（含有胞質(zhì)成分和細(xì)菌外被成分）。 超速離心I：100,000g，60min，4，去除上清（胞

9、質(zhì)成分），收集細(xì)菌外被成分。 用10ml含2的SLS的Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min。 超速離心II：70,000g，60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細(xì)胞質(zhì)膜）。重復(fù)、兩步。 充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重懸沉淀物。根據(jù)公式：蛋白濃度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260測定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品-70貯存。試劑 Tris-Mg 緩沖液10mM Tris-Cl5mM MgCl2pH 7.3，4保存 2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)7）來源于Method

10、s Enzymology (1974)1.取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓，以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。2用Potter-Elvehiem勻漿器，桿與壁間間隙0.50.6m,14.4kr/min上下勻漿46次，每次5S。3過濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部分加入50l介質(zhì)，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。4合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于100l介質(zhì)，離心10min，棄上清，留沉淀。5將

11、沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個(gè)離心管中，上面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。6700kg離心90min，分離介質(zhì)在1.161.18之間形成介面。7收集d為1.161.18g/ml之間的細(xì)胞膜，加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min，洗滌2次。8保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中，用于細(xì)胞膜的研究分析8）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法：（所有(suyu)操作都在4攝氏度下進(jìn)行）1.在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復(fù)上述(shngsh)操作，直至組織碎成

12、1mm3大小的碎片，且無可見的血。2.加入(jir)5倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃勻漿器中，抽研10-20次，勻漿組織。3.勻漿4攝氏度600g離心10min，上清含細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞溶膠。沉淀中有未破碎的細(xì)胞及細(xì)胞核。棄沉淀。4.上清4攝氏度8000g離心10min，沉淀線粒體。棄沉淀。5.上清4攝氏度10000g離心20min，棄上清。6.用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續(xù)勻漿，再次4攝氏度，10000g離心20min，棄上清。7.用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。8.粗制的樣品可于干冰/乙醇中速凍，保存于-80攝氏度。9）用特殊的去污劑選擇性的分離。簡單

13、，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。原理：4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，但在37度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。方案1、放射性標(biāo)記受試細(xì)胞2、將標(biāo)記的細(xì)胞放在冰上3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min5、刮下單層細(xì)胞，4度下10 000g 5min離心6、溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min7、收集水相留作分析8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心9、按

14、步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積10、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)試劑：1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑2）緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）3）buffer C10mmol/L Tris HCl(pH7.5)150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA(PH7.5)膜蛋白提取試劑盒產(chǎn)品簡介 一、描述(mio sh) 本試劑盒提供獨(dú)特的組份提取細(xì)胞及組織中的膜蛋白。其原理是裂解細(xì)胞后，先離心分離出

15、質(zhì)膜粗提物，再利用特殊(tsh)的抽提Buffer，選擇性地分離提取膜蛋白，抽提Buffer含一種特殊的去污劑，在4時(shí)所有(suyu)的蛋白質(zhì)均可都溶于抽提Buffer，但在37時(shí)，抽提Buffer分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中，根椐該性質(zhì)分離出膜蛋白。產(chǎn)物不僅含細(xì)胞膜蛋白，也含胞器質(zhì)膜蛋白。提取方法簡單，可靠，快速。獲得的膜蛋白純度高，可用于PAGE電泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后續(xù)研究。 二、試劑盒 組份 P350（50 tests） P3100（100 tests） Lysis Buffer 25 mL 2 25 mL 4 抽提Buf

16、fer 25 mL 2 25 mL 4 蛋白酶抑制劑 50L 100L 溶解Buffer 5 mL 10 mL TCA試劑 2.5 mL 5 mL Loading Buffer 1 mL 2 mL 三、 操作步驟 1、收集不少于1107細(xì)胞，用冷PBS （pH7.4）洗滌細(xì)胞兩次（每次3000 rpm離心5 min）； 組織樣本（200300mg）盡量去除脂肪組織和結(jié)締組織等非目的組織，于冰上剪碎； 2、在上述細(xì)胞或組織樣本中加入1mL Lysis Buffer（注：使用前，每mL Lysis Buffer加入1L蛋白酶抑制劑和1mM DTT），置玻璃均漿器冰上均質(zhì)3050次，或超聲破碎細(xì)胞，

17、每次30 S ， 34次，每次間隔1 min， 置于冰上冷卻。均質(zhì)或超聲破碎細(xì)胞后應(yīng)鏡檢，細(xì)胞破碎率不小于90； 3、將均漿液轉(zhuǎn)移至冷的離心管中，于4, 3000 rpm 離心10 min，棄沉淀； 4、取上清轉(zhuǎn)移至新冷離心管中，于4, 14 000 rpm 離心30 min，上清轉(zhuǎn)至新管中，為胞漿蛋白，冷凍保存； 5、取沉淀，加入1mL冷的抽提Buffer， 渦旋振蕩混勻后，4放置10 15min； 注：因抽提Buffer在室溫時(shí)會分層，請務(wù)必于4混勻后加入 6、4, 3000rpm 離心5min，取上清轉(zhuǎn)移至新管（注意勿將沉淀帶入上清），進(jìn)行下步提?。?7、置于37水浴10min； 8、室

18、溫,13 000rpm離心5min，樣品分成上層和下層（含膜蛋白）； 注：建議使用進(jìn)口透明性較好的微量離心管，可見下層為含膜蛋白的有機(jī)相。上下兩層因均為透明，只在交界處有一折光線，需仔細(xì)觀察才可見到?；蚴覝仂o置30分鐘1小時(shí)亦可見分層。以下亦同。 9、 取下層(xicng)，加入500L冰冷(bnglng)滅菌水，4放置(fngzh)5min； 10、置于37水浴10min； 11、室溫,13 000rpm離心5min，樣品分成上層和下層（含膜蛋白）； 12、取下層，加入500L冰冷滅菌水，4放置5min； 13、置于37水浴10min； 14、室溫,13 000rpm離心5min，樣品分成上

19、層和下層（含膜蛋白）； 15、最終得到的下層即為膜蛋白提取物，BCA法測定蛋白含量（因殘留有機(jī)相可能影響測定結(jié)果，此含量為相對參考值），分裝冷凍保存； 四、 SDS PAGE 電泳操作步驟 1、 進(jìn)行PAGE電泳前，取該提取物，每100L膜蛋白提取物，加入約300L的溶解Buffer 和約100L三氯乙酸 （TCA）試劑， 混勻后置冰上2030 min后， 13 000rpm，離心15 min，盡可能除去上清； 2、 沉淀加入1mL丙酮，室溫靜置10min后，13 000rpm離心15 min； 3、 棄上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥約10 min（敞開離心管蓋），加入適當(dāng)體積的Loading

20、 Buffer（使用前每100L Loading Buffer加入25L巰基乙醇）溶解，徹底分散（槍頭反復(fù)吹吸或劇烈渦旋）； 注：加入Loading Buffer后如有部分難溶物，可取上清繼續(xù)上樣；如加入Loading Buffer后溴酚藍(lán)轉(zhuǎn)呈黃色，此為少量TCA殘留所致，不影響電泳結(jié)果，請參照Marker標(biāo)準(zhǔn)。 4、 上樣進(jìn)行SDS PAGE電泳。產(chǎn)品特征 商標(biāo) Bipec 產(chǎn)品型號 Bipec 產(chǎn)品規(guī)格 50T/100T 產(chǎn)品產(chǎn)量 999999999 產(chǎn)品價(jià)格 600 公司名稱 南京博泰生物技術(shù)有限公司核蛋白提取試劑盒產(chǎn)品簡介 一、描述 本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取核蛋白和/

21、或胞質(zhì)蛋白，提取制備過程簡便。制備的核蛋白和胞漿蛋白能保持天然活性，并且純度較高。提取的蛋白可用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄因子活性分析、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性測定等后續(xù)蛋白質(zhì)研究。 二、試劑盒組份 組份 P150 （50 test） P1100 （100 test） Buffer A 25 mL 25 mL 2 Buffer B 1.5 mL 30 mL Buffer C 12.5 mL 25 mL DTT 50L 100L 蛋白酶抑制劑 250L 500L PMSF（MW：170.3） 1.0mg 2.0mg 異丙醇 800L

22、 1.5mL 三、操作步驟 1、 取培養(yǎng)(piyng)細(xì)胞51061107個(gè)/mL，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞(xbo)用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍； 2、 用1mL預(yù)冷的PBS刮下細(xì)胞(xbo)轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5mL 微量離心管中； 3、 4離心，500g,3 min收集細(xì)胞，用移液槍盡可能取去上清，勿留殘液，估計(jì)細(xì)胞壓積PCV（離心后的緊實(shí)細(xì)胞體積）； 【如果是組織樣本，將組織剪切成小塊，加入適量的冰冷PBS均漿后，靜置5 min ，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，棄沉淀，上清4離心500g，3 min，棄上清，估計(jì)細(xì)胞壓積】。 4、 每20L細(xì)胞壓積中，加入200L預(yù)冷的Buffer A【使用前每mL

23、Buffer A加入1L DTT，5L PMSF（用戶自配：濃度100mM，溶于異丙醇)，5L蛋白酶抑制劑】，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15s，放置冰上1015min； 5、 加入11L冷Buffer B，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5s，放置冰上1min； 6、 再次最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5s后， 4離心，16000g,5min； 7、 盡快將上清轉(zhuǎn)入另一預(yù)冷的潔凈微量離心管，置于冰上，即得胞質(zhì)蛋白； 8、 在離心沉淀物（細(xì)胞核）中加入100L預(yù)冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1L DTT，5LPMSF，5L蛋白酶抑制劑)，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15s，放置冰上40min，每間隔10

24、 min渦旋劇烈振蕩15 seconds； 9、 4離心，16000g,10min，盡快將上清轉(zhuǎn)入一預(yù)冷的潔凈微量離心管，即得核蛋白； 10、 上述提取的胞質(zhì)蛋白和核蛋白進(jìn)行蛋白定量（Braford法或BCA法），分裝并保存于-80，避免反復(fù)凍融。 四、備注 1、 所有的試劑及器具均需預(yù)冷后使用； 2、 細(xì)胞(xbo)的數(shù)量不應(yīng)少于25107個(gè)/mL；， 3、 以上(yshng)各緩沖液的使用量是以20L細(xì)胞壓積為例，如細(xì)胞壓積不同(b tn)，請參考下表加入各緩沖液。 細(xì)胞壓積PCV Buffer A Buffer B Buffer C 10L 100L 5.5L 50L 20L 200L

25、11L 100L 50L 500L 27.5L 250L 100L 1mL 55L 500L 4、 一般常規(guī)提取的蛋白樣品，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)不需要透析，但如果需要較大量的提取蛋白或后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果不理想，則需要將提取的蛋白樣品進(jìn)行透析脫鹽，建議透析后進(jìn)行后續(xù)分析。 五、儲存 -20，保存一年。產(chǎn)品特征 商標(biāo) Bipec 產(chǎn)品型號 Bipec 產(chǎn)品規(guī)格 50T/100T 產(chǎn)品產(chǎn)量 999999999 產(chǎn)品價(jià)格 500 公司名稱 南京博泰生物技術(shù)有限公司總蛋白提取試劑盒產(chǎn)品簡介 一、描述 本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液Lysis Buffe

26、r勻漿裂解組織或細(xì)胞，作用溫和，提取過程簡便高效。獲得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后續(xù)研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 二、試劑盒組份 組份 P250 （50 tests） P2100（100 tests） Lysis Buffer 25 mL2 100 mL 磷酸酶抑制劑 250 L 500L 蛋白酶抑制劑 50 L 100 L PMSF（MW：170.3） 2mg 4mg 異丙醇 800L 1.5mL 三、 操作步驟 A 實(shí)體組織蛋白(dnbi)的提取 1 在每mL 冷Lysis Buffe加入(jir)5 L磷酸酶抑制劑， 1 L蛋白酶抑制劑和5L PMSF（用戶自配：濃度(nngd)200mM，溶于異丙醇） ，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。 2 每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成3mm3mm左右的小塊，加入0.51 mL冷 Lysis Buffer，玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作； 3 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL預(yù)冷的離心管，離心10000轉(zhuǎn)/分，4離心5 min； 4 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Braford法或BCA法）； 5 分裝保存于-70,避免反復(fù)凍融。 B 培養(yǎng)