診斷酶學ppt課件

1、第六章 診 斷 酶 學教學目的與要求掌握血清酶變化的病理生理機制，血清酶測定在臨床診斷中運用。熟習血清酶的分類，同工酶及其亞型測定的臨床意義。了解其生理變異、組織分布、測定方法、標本處置等對測定結果的影響。 主要內(nèi)容1概述酶的組成、作用機制、分類2酶促反響動力學3血清酶血清酶分類、變化的病理生理機制4酶活性濃度測定技術5酶的免疫化學測定6同工酶及其亞型的測定 7臨床常規(guī)酶類測定第一節(jié) 酶學概述 一、酶的概念、構造及功能 (一)根本概念 1. 酶、核酶ribozyme和脫氧核酶deoxyribozyme2. 酶的催化特：極高的催化效率、高度的特異性、 催化作用的可調理性。3.酶促反響：酶催化的反

2、響； 酶活性(activity)：酶催化反響的才干； 底物(substrate，S)：酶所作用的物質； 產(chǎn)物(product，P)：酶促反響的生成物； 酶的激活劑(activator：加速酶促反響的物質； 酶的抑制劑(inhibitor ：減慢或終止酶促反響的物質二酶的構造及功能 1單純酶和結合酶單純酶：只含多肽鏈，是單純蛋白質。結合酶：由酶蛋白apoenzyme和輔因子cofactor組成。 兩者結合后構成的復合物稱為全酶holoenzyme。 與酶蛋白結合疏松的稱為輔酶coenzyme。 與酶蛋白結合結實的稱為輔基prosthetic group。2酶的活性中心active center

3、酶與底物結合并將底物轉變成產(chǎn)物發(fā)生在酶外表的一個特 定區(qū)域。二、酶的命名、分類及編號 臨床上常用的酶 EC編號 習慣用名 英語縮寫 EC編號 習慣用名 英語縮寫1.1.1.27 乳酸脫氫酶 LD、LDH 2.7.3.2 肌酸激酶 CK、CPK1.1.1.37 蘋果酸脫氫酶 MD、MDH 3.1.1.3 脂肪酶 LPS1.1.1.41 異檸檬酸脫氫酶 ICD、ICDH 3.1.1.8 膽堿酯酶 CHE1.1.1.49 6-磷酸葡萄糖脫氫酶 G6PDH 3.1.3.1 堿性磷酸酶 ALP、AKP1.4.1.3 谷氨酸脫氫酶 GLD、GLDH 3.1.3.2 酸性磷酸酶 ACP1.4.3.4 單氨氧

4、化酶 MOD 3.1.3.5 5-核苷酸酶 5-NT2.1.3.3 鳥氨酸氨甲?；D移酶 OCT 3.2.1.1 -淀粉酶 AMY、AMS2.3.2.2 -谷氨?；D移酶 -GT、GGT 3.2.1.30 -N-乙?；?2.4.1.1 糖原磷酸化酶 GP D氨基葡萄糖苷酶 NAG2.5.1.18 谷胱甘肽轉移酶 GST 3.2.1.51 -L-巖藻糖苷酶 -FU、AFU2.6.1.1 門冬氨酸氨基轉移酶 AST、GOT 3.4.23.1 亮氨酸氨基肽酶 LAP2.6.1.2 丙氨酸氨基轉移酶 ALT、GPT 4.1.2.13 果糖二磷酸醛縮酶 ALD第二節(jié) 血清酶一、血清酶的來源 一血漿特異酶

5、：為血漿蛋白的固有成分，在血漿中發(fā)揚特定的催化作用。多數(shù)由肝臟合成并以酶原方式分泌入血，在一定條件下被激活，從而引起相應的生理或病理變化。出凝血有關的酶或酶原、膽堿酯酶、銅氧化酶及脂蛋白脂肪酶等。二非血漿特異酶：外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌進入血漿的酶，包括胰淀粉酶、胰脂肪酶、前列腺酸性磷酸酶等。血液中的含量與相應分泌腺的功能及疾病有關。細胞內(nèi)酶：存在于細胞內(nèi)進展物質代謝的酶，隨著細胞的不斷更新或破壞可少量釋入血液。當其大量出現(xiàn)于血清中時，提示酶的來源組織細胞受損，最常用于臨床診斷。二、血清酶的去路(一) 血清酶的半壽期 (T1/2) 1. 定義： 酶失活至原來一半時所需時間。 2. 半壽期

6、代表酶從血中去除的快慢。 半壽期長的酶，在血清中繼續(xù)時間長。 二血清酶的失活和排泄 1. 酶的去除主要是在血管內(nèi)失活或分解。 2.血清酶受蛋白酶水解而產(chǎn)生的低分子多肽或 氨基酸可經(jīng)小腸粘膜排至腸腔，再徹底分解 成氨基酸后被重吸收，其中大部分氨基酸可 被組織利用，不能利用的氨基酸那么隨尿排出 體外。 三、血清酶的生理變異 (一) 性別 少數(shù)酶如CK、ALP及GGT等有性別差別，與血清酶的來源組織有關。二年齡 血清酶的活性隨年齡而變化，ALP和GGT到老年時可有輕度升高。年齡差別也見于同工酶。三進食 過量飲酒可使血清GGT明顯升高。四運動 多種血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT等

7、，其升高的幅度與運動量、繼續(xù)時間、運動頻率及骨骼肌所含的酶量有關。五妊娠 胎盤組織可分泌一些酶進入母體血液，如耐熱ALP、LD、LAP和ALT少數(shù)等，引起血清中這些酶活性升高。六其他 一些酶活性與體重、身高的增長、體位改動、晝夜變化及家庭要素有關。四、血清酶變化的病理機制 一血清酶變化機制 二血清酶變化的病理機制1. 酶合成異常1合成減少 2合成增多2. 酶釋放添加 大多數(shù)血清酶增高的主要緣由1細胞內(nèi)外酶濃度差別2酶在細胞內(nèi)定位和存在方式3酶蛋白分子量的大小3. 酶在細胞外間隙的分布和運送 細胞中的酶有三種途徑進入血液。 4.酶的去除異常 有少部分分子量小于60 000的酶可從腎小球濾過，如A

8、MY。當腎功能減退時，血中AMY活性升高，闡明酶排泄妨礙而導致在血液中滯留。另外膽道梗阻時，梗阻區(qū)ALP合成加強，同時ALP排泄受阻而逆流入血，呵斥血液中ALP升高。第三節(jié) 酶活性測定 一米-曼公式Michaelis 和Menten提出的酶作用的中間產(chǎn)物學說: 1913年提出了著名的酶促反響速度與底物濃度關系的方程式，即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation)： (二) Km與Vmax 1. Km值：等于酶促反響的初速率為最大速率Vmax一半時的底物濃度，即VVmax時，那么KmS。Km在臨床上的運用：1反映酶與底物的親合力，且與親合力成反比；2用來計算不同底物濃度時

9、酶促反響速度相當于最大反響速度的百分率，當?shù)孜餄舛葹?020Km時，反響速度可到達最大反響速度的9095；3根據(jù)Km值選擇酶的最適底物；4確定工具酶用量；5確定代謝酶系中的限速反響和作為鑒別酶的根據(jù)。2. Vmax：酶完全被底物飽和時的反響速度，代表了在一定酶量下的最大反響速率。三影響酶促反響的要素1.底物濃度對酶促反響的影響 1當SKm時，反響速率與底物濃度S無關，VVmaxK E，稱為零級反響，反響速率與酶濃度E成正比。酶學測定時普通底物濃度可選擇為Km的1020倍。 2. 酶濃度 當?shù)孜餄舛冗h遠大于酶濃度時，酶促反響速率與酶的濃度成正比。在病理情況下，樣品酶濃度很高，此時可因底物過早而且

10、過多地被耗費，而影響酶活性測定，故需用生理鹽水或其他緩沖液進展適當?shù)南♂?。但需留意稀釋對測定結果的影響。3.緩沖液的種類、離子強度和pH 根據(jù)對酶活性的影響不同可將緩沖溶液分為活性、抑制、惰性三類。各種體液樣品也是緩沖液，應嚴厲掌握測定樣品與底物的用量比例，樣品在總體積中所占的比例應不超越10%。4.溫度 測定酶活性時所用溫度的誤差應嚴厲控制在0.1。5.激活劑與抑制劑 在進展酶偶聯(lián)法測定酶活性時，反響體系中還必需參與指示酶甚至輔助酶，對其濃度等條件也應思索。同時反響時間及產(chǎn)物對酶促反響也有影響。三、酶活性濃度的測定 一酶活性濃度測定方法 酶活性濃度測定就是要使酶促反響的初速度v到達最大速度V

11、max，即在過量底物存在下的零級反響期的速度，此時反響速度與酶濃度E之間存在線性關系。按照酶促反響時間的不同可將酶活性濃度測定方法分為兩大類: 定時法fixed time assay 延續(xù)監(jiān)測法continuous monitoring assay。 1.定時法固定時間法定時法：測定酶與底物作用反響一定時間后底物或產(chǎn)物變化的總量，計算酶促反響平均速度。優(yōu)點：比較簡單，最后測定時因酶促反響已被終止，故所用儀器無需恒溫安裝，顯色劑的選擇也可不思索對酶活性的影響。缺陷：無法知道在整個酶促反響進程中能否都處于線性期。利用該法測定酶活性濃度，必需保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要非常準確，否那么會引

12、起較大誤差。2. 延續(xù)監(jiān)測法又稱速率法或動力學法，指在酶促反響過程中用儀器監(jiān)測某一反響產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化量，求出酶反響初速度，間接計算酶活性濃度的方法。優(yōu)點：無須終止酶促反響，不需添加其它成色試劑，就能將反響物變化的多點測定結果銜接成線，察看到整個反響過程，選擇線性反響期來計算酶活性，結果準確可靠。要求檢測儀器具有恒溫安裝及自動檢測功能，自動生化分析儀都能到達這些要求。二酶偶聯(lián)測定法1. 酶偶聯(lián)反響 1最簡單的方式為： Ex 為待測酶，A為底物，B為中間產(chǎn)物。 A、B二物質的變化無法直接監(jiān)測，此時可外加第二個酶Ei為指示酶，其底物為B，反響產(chǎn)物為P可直接測定。2假設一些酶促反響找不到

13、適宜的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時還可在始發(fā)反響和指示反響之間參與另一種酶，將二者連在一同，此反響稱為輔助反響。方式為：其中，B、C均為中間產(chǎn)物，Ea、Ei都為工具酶。最后一個酶稱指示酶Ei，其他外加的酶都為輔助酶Ea。2酶偶聯(lián)反響原理1 當用酶偶聯(lián)法測定時，在偶聯(lián)反響中存在幾個時期：預孵育期、延滯期、恒態(tài)期、非恒態(tài)期。2延滯期是酶偶聯(lián)反響與普通酶反響的一個重要區(qū)別。從酶反響開場至穩(wěn)態(tài)期間，指示酶反響較慢且不穩(wěn)定，稱為延滯期。在這期間指示酶反響速度不能代表測定酶量多少。3設計和選擇酶偶聯(lián)測定方法時，延滯期越短越好，測定時間要避開此期。 酶偶聯(lián)法測定ALT的吸光度變化圖 3對酶偶聯(lián)反響的要求1指示酶

14、反響必需是一級反響，酶反響速度與指示酶底物濃度相關。工具酶催化的最大反響速度必需遠遠大于測定酶，其所催化的反響必需在中間產(chǎn)物濃度很低的條件下進展，并且將此很快轉變?yōu)樽罱K產(chǎn)物，反響體系中不應有中間產(chǎn)物堆積，否那么導致誤差。2工具酶 作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶。最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩類：一類是氧化酶系統(tǒng)，利用氧化酶產(chǎn)生過氧化氫H2O2，再加上氧化發(fā)色劑進展比色，如常用的Trinder反響。另一類是脫氫酶系統(tǒng)，利用氧化-復原酶反響使其銜接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反響后，經(jīng)過分光光度法或其他方法直接測定NAD(P)H的變化量。3酶循環(huán)法enzymatic cycl

15、ing methods 固相酶immmobilized enzymes(三)血清酶活性濃度測定條件的選擇 1方法條件的選擇 盡能夠采用延續(xù)監(jiān)測法；減少操作步驟；化學試劑須具有一定純度，不含影響反響速度的雜質；實驗用水最好是純水或雙蒸水；建議運用液體雙試劑。2測定參數(shù)的設置 內(nèi)容包括：方法類型、波長、樣品量與試劑量、稀釋水量、試劑吸光度上、下限、試劑空白速率、反響時間、孵育時間、延遲時間、監(jiān)測時間、底物耗盡限額、線性范圍及計算因子F值。3標本的采集、運輸與保管 個別酶在低溫時反而不如室溫穩(wěn)定如LD。 4干擾要素的控制 一些副反響或旁路反響干擾。其他酶的污染。底物自行發(fā)生反響。四、酶活性濃度的單位

16、一酶活性單位1慣用單位 慣用單位是酶活性測定方法的建立者所規(guī)定的單位。由于單位定義不同，參考值差別很大，難以進展比較。2國際單位international unit，IU 在特定的條件下，每分鐘轉化1mol底物的酶量為一個國際單位。以IU表示，1IU=1mol.min-1。3Katal單位 在規(guī)定條件下，每秒鐘轉化1mol底物的酶量為1kat， 1kat=1mol.s-1。常用單位為katal或 nkatal。Kat與IU的換算關系為：1IU=1molmin-1=16.67nmols-1= 16.67nkatal二酶活性濃度單位臨床上酶活性濃度采用每單位體積升所含的酶活性單位數(shù)表示。1酶活性濃

17、度單位的計算延續(xù)監(jiān)測法根據(jù)摩爾消光系數(shù)進展酶活性濃度的計算，公式如下：2系數(shù)F值的計算及運用 上述公式可簡化為： 如LD活性濃度，知NADH的為6.22103cm-1.mol-1，血清量為50l，底物液為1ml，比色杯光徑為1cm，那么 F=1.05106/6.22 1030.051=3376。五、酶的免疫化學測定 1. 酶的免疫化學測定方法： 放射免疫測定RIA、免疫抑制法、化學發(fā)光免疫測定CLIA、酶免疫測定EIA、熒光酶免疫測定FEIA。2. 免疫化學法的結果報告方式：1用酶活性濃度單位，結果以U/L表示。2用質量濃度單位，結果直接用ng/ml或g/L表示。3. 血清酶活性與酶質量的變化

18、的關系4. 免疫化學測定法的優(yōu)點： 靈敏度高，能測定樣品中少量或痕量酶； 特異性高，不受體液中其他物質的影響； 能測定一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白； 特別適用于測定同工酶。5. 免疫化學測定的局限性： 制備足夠量的提純酶和抗血清非常困難且任務量大； 測定步驟多，操作繁瑣；測定本錢高。第四節(jié) 同工酶及亞型的測定一、同工酶的概念及分類同工酶isoenzyme是摧化一樣的化學反響，而酶蛋白的分子構造、理化性質不同的一組酶。二、同工酶的分析方法 方法同工酶或亞型的性質差別同工酶、亞型電泳法電荷不同一切同工酶、亞型色譜法 離子交換色譜電荷不同CK，LD免疫分析法免疫抑制法特異性抗體反響性不同CK、LD、AC

19、P免疫化學測定法特異性抗體反響性不同CK、LD、ACP、ALP、AMY動力學分析法 底物特異性分析法底物Km、親和力不同ACP 、CK、LD-羥丁酸 抑制劑分析法對小分子量的抑制劑的特異性抑制不同LD草酸、ACPL-酒石酸、ALPL-苯丙氨酸 pH分析法最適pH不同LD、AST 熱失活分析法熱穩(wěn)定性不同LD、ALP蛋白酶水解法對蛋白水解酶敏感度不同LD、AST一 電 泳 法 1. 電泳資料：醋酸纖維素薄膜、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、等電聚焦及毛細管電泳等。2. 區(qū)帶顯色：各同工酶區(qū)帶進展酶促反響，利用底物、產(chǎn)物及衍生物等的顏色變化或他們與染料結合后的顏色變化進展檢測，采用光密度計或熒光計掃描

20、定量，而顏色的深淺與同工酶活性成正比。 3. 巨分子酶產(chǎn)生的緣由： 酶與免疫球蛋白構成復合物，如CK-BB-IgG、CK- MM-IgA、LD-IgA等； 酶與其他蛋白質構成復合物，如LD-脂蛋白等； 酶亞基或酶分子之間構成聚合物，如CK-Mt聚合物、 LD亞基本身聚合等。 血清LD同工酶瓊脂糖凝膠電泳圖譜 二色譜法 1. 色譜法：利用同工酶分子量大小、所帶電荷多少的不同，以及受某些離子交換劑吸附的強弱程度不同來進展分別鑒定的方法。2. 常用的是柱色譜，如離子交換色譜和親和色譜等。3. 因操作方法費時繁瑣，普通不用于臨床同工酶常規(guī)檢測，而主要用于同工酶的分別、制備、純化。三免疫化學法 1免疫抑

21、制法 根據(jù)同工酶的某一種亞基與相應的抗體結合后，酶活性遭到抑制，而不含這種亞基的同工酶那么不受影響，測定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化，即可算出該型同工酶的活性。2免疫沉淀法 該法利用分別提純的同工酶作為抗原制備的抗體與含該型同工酶的待測樣品混合，在一定條件下構成抗原抗體復合物沉淀，離心后測定上清液中其他型別的酶活性。利用參與抗體前測得的總酶活性減去上清液中的酶活性，即可算出被沉淀的同工酶的活性。3其他免疫學方法測定酶蛋白 利用酶是蛋白類抗原但含量極微的特點，可運用靈敏度較高的免疫電泳、RIA、EIA和CLIA等方法。這類方法的最大特點就是與酶活性無關，而是測定酶的質量。四動力學分析法 1

22、底物特異性分析法 利用不同的同工酶對底物的Km及親和力的差別即可進展分析。如人的LD1對-羥丁酸的親和力較大Km為0.84mmol/L，而LD5對-羥丁酸的親和力較小Km為10mmol/L。2抑制劑分析法 利用同工酶之間構造的不同而對同一種抑制劑有不同的親和性和反響性來進展分析。 3pH分析法 利用不同的同工酶可有不同的最適pH進展分析。如AST的最適pH為7.4，當pH降為6.5時，血漿ASTASTs活性明顯降低，而線粒體ASTASTm那么仍堅持活性。4熱失活分析法 利用不同同工酶的耐熱性不同來進展分析與鑒定。如ALP同工酶對熱的反響差別很大，胎盤ALP在70高溫下酶活性也無變化，而骨ALP

23、在5510min活性那么喪失過半。 五蛋白酶水解法 利用不同的同工酶對蛋白水解酶的敏感度不同，選擇適宜的蛋白酶濃度和反響時間，將某些同工酶水解而使其喪失活性，另一些同工酶那么不受影響。如LD同工酶、AST同工酶等。 此法簡便、快速、易于自動化。 第五節(jié) 常用血清酶及其同工酶測定和運用 血清中酶濃度的改動常提示細胞壞死或細胞膜通透性添加，闡明機體的臟器或組織發(fā)生了損傷。假設改動是由細胞內(nèi)酶的合成添加所引起，那么表示組織有再生、修復、成骨或異位分泌，或有惡性腫瘤存在的能夠；假設改動是由酶的排泄妨礙所導致，那么闡明機體內(nèi)有梗阻的存在。臨床上根據(jù)血清中酶濃度的改動可對疾病進展輔助性診斷。 為了提高診斷

24、的敏感度與特異性，常采用同時測定一組性質不同的酶“譜型 ，比較其酶活性的變化，根據(jù)其酶活性增高或降低的做出診斷。一、轉氨酶及其同工酶一生化特性與組織分布1. 生化特性丙氨酸氨基轉移酶alanine aminotransferase，ALT天門冬氨酸氨基轉移酶aspartate transaminase，AST以磷酸吡哆醛維生素B6作為輔基，單純的酶蛋白無催化活性。血清中除了含有有活性的全酶外，還存在部分不含輔基的酶蛋白。2. 組織分布ALT有兩種同工酶：胞漿ALTALTs、線粒體ALTALTmAST有兩種同工酶：細胞質ASTs和線粒體ASTm。正常血清主要為ASTs，當細胞遭到輕度損傷時AST

25、s 顯著升高。假設血清中出現(xiàn)大量的ASTm，那么表示細胞嚴重受損。二臨床意義 1. 急性肝損害 ALT的升高常與病情輕重相平行，可作為判別急性肝炎能否恢復的目的。重癥肝炎出現(xiàn) “酶 ALT膽膽紅素分別景象，常是肝壞死的前兆。2. 心臟、骨骼肌等組織受損、肝膽疾病時血清ALT程度也可出現(xiàn)不同程度的升高。有些藥物如異煙肼、利福平等可引起急性或慢性的肝損害，血中ALT活性升高。3. 在AMI患者胸前區(qū)疼痛發(fā)作后6h8h，血清AST可明顯升高，其升高的幅度與心肌損傷的程度成正比。發(fā)病后48h60h達峰值，4天5天可降至正常。4. 轉氨酶輕度添加(1ULN3ULN) ：胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、肉芽

26、腫、腫瘤等；中度添加(3ULN10ULN)的疾病：傳染性淋巴增多癥、慢性活動性肝炎、肝外膽道堵塞、心肌梗死等；重度添加(20ULN)的疾?。翰《拘愿窝住⒅卸拘愿窝?。 二、堿性磷酸酶及其同工酶 一生化特性與組織分布1. 生化特性 堿性磷酸酶alkaline phosphatase，ALP是一組底物特異性較低,在堿性條件下最適pH為10左右能水解很多磷酸單酯化合物的酶。2. 組織分布ALP廣泛分布定位于細胞膜外表，其含量依次為肝、腎、胎盤、小腸、骨骼等。血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼，是膽汁淤滯的酶學目的。根據(jù)ALP的來源不同可以分為小腸IAP、胎盤PALP、生殖細胞GCAP和組織非特異性堿性磷

27、酸酶TUAP四種同工酶。二測定方法與臨床意義1. 測定方法1磷酸苯二鈉比色法：測定ALP水解底物產(chǎn)生的酚。2延續(xù)監(jiān)測法：IFCC正式引薦的參考方法。2. 臨床意義1肝膽疾病 各種肝內(nèi)、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾病，ALP明顯升高，且ALP升高與膽紅素平行；肝癌血清ALP升高并可與膽紅素、黃疸添加不平行。肝炎等累及肝本質細胞的肝膽疾病，ALP僅輕度升高。嚴重肝壞死，假設黃疸添加而ALP下降那么表示病情惡化；假設黃疸減退而ALP升高那么表示病情惡化。2甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、Pagets病、骨折、指端肥大癥所致骨損傷等，均可引起ALP活性升高，尤其是骨ALP同工酶的增高。3妊娠后期及兒童生長期

28、ALP增高。4血清ALP活性降低：主要見于呆小病、維生素C缺乏癥、甲狀腺功能低下、惡性貧血等。三、-谷氨酰轉移酶及其同工酶 一生化特性與組織分布 1. 生化特性-GT或GGT L-glutamyltransferase是一種含巰基的線粒體酶。2. 組織分布分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。GGT在細胞中有膜結合型疏水型和可溶型親水型兩種。血清中GGT主要來源于肝膽系統(tǒng)。肝臟中的GGT主要分布在肝細胞的毛細膽管側和整個膽管系統(tǒng)，因此肝內(nèi)GGT合成增多或膽管系統(tǒng)病變膽汁排泄受阻時，均可引起血清GGT增高。二測定方法與臨床意義1. 測定方法1重氮試劑為代表的比色法。2

29、延續(xù)監(jiān)測法。2. 臨床意義1膽道疾病 膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻等升高明顯。2肝本質疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化時中度升高。 慢性肝炎活動期GGT多增高，非活動期那么多正常。 原發(fā)性或轉移性肝癌時不同程度的增高。3誘導作用 對乙醇性中毒的判別有一定的價值。 長期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者升高。 (4) 同工酶 用醋酸纖維薄膜電泳可將GGT同工酶分為GGT1、 GGT2、GGT3和GGT4四種，正常人只需GGT2和GGT3。 重癥肝膽疾病和肝癌時有GGT1出現(xiàn)；乙醇性肝壞死、 膽總管結石及胰腺炎時GGT2添加；GGT4與膽紅素增高 相關。四、單胺氧化酶 一生化特性與組織分布1. 生化特性

30、單胺氧化酶monoamine oxidase,MAO是一種主要作用于CH2NH2基團，催化各種單胺類物質氧化脫氫的含銅酶。位于線粒體膜外外表的MAO與膜嚴密結合，并以FAD為輔酶。位于結締組織中的MAO以磷酸吡哆醛為輔酶。2. 組織分布廣泛分布于體內(nèi)各組織器官，以肝、腎、腦等組織含量最多。神經(jīng)組織中的MAO參與調理胺類神經(jīng)遞質的含量；結締組織中的MAO參與膠原纖維的交叉銜接；肝組織中的MAO那么參與各種胺類生物轉化。MAO的兩個亞單位是MAOA和MAOB，三種同工酶是MAO、MAO和MAO。二測定方法與臨床意義1. 測定方法MAO可作用于多種底物，多用芐胺和對苯甲胺偶氮萘酚為底物。也可運用MA

31、O催化胺類如丙烯胺釋放出的H2O2氧化發(fā)色劑，如10N甲基氨基甲酰基3，7二甲氨基10氫吩噻嗪MCDP進展測定。2. 臨床意義 1血清MAO活性能反映纖維化的程度肝硬化。 2各種急性肝炎血清MAO活性多正常，迸發(fā)性和急性壞死性肝炎時，線粒體釋放大量MAO，活性明顯升高。 3糖尿病可因合并脂肪肝、充血性心力衰竭，繼發(fā)肝纖維化，使血清MAO活性升高。甲亢、肢端肥大時，血清MAO活性也可出現(xiàn)程度不同的升高。 4老年性癡呆、帕金森氏病和抑郁癥病人血清和腦內(nèi)MAO活性可明顯升高。 五、肌酸激酶及其同工酶 一生化特性與組織分布1. 生化特性肌酸激酶creatine kinase，CK為巰基酶，易受金屬離子

32、Ca2、Cu2、Zn2、Mn2等的抑制，Mg2是CK的必需激活劑。由兩種不同亞基M和B亞基組成的二聚體。按電泳速率的快慢分為：CK-BBCK1、CK-MBCK2、CK-MMCK3和CKMt(CK4)四種同工酶。2. 組織分布廣泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦組織。CK-BB在腦和脊髓內(nèi)含量最高稱為腦型同工酶。CK-MB主要存在于心肌細胞內(nèi)稱為心型同工酶。骨骼肌中幾乎全部為CK-MM，稱為肌型同工酶。二測定方法與臨床意義1. 測定方法 有比色法、酶偶聯(lián)法和熒光法等。1肌酸顯色法2和酶偶聯(lián)法 是IFCC引薦的參考方法，偶聯(lián)己糖激酶HK和葡萄糖6磷酸脫氫酶G6PD參與催化反響。 3CK同

33、工酶的測定常用電泳法和免疫抑制法。2. 臨床意義 主要用于早期診斷AMI1 血清CK總活力 心肌梗死后2h4h開場升高，10h24h達峰值，3天4天恢復正常 。2CK同工酶及亞型 AMI胸痛發(fā)作后，血清CK-MB的上升先于其CK總活性，CK-MB/CK0.03可診斷為AMI。CK-MM亞型的測定：以CK-MM3/CK-MM11.0作為診斷AMI的規(guī)范。在AMI發(fā)病2h4h內(nèi)比值開場升高，8h12h達峰值，因此對AMI的早期診斷具有重要價值。CK-MB2亞型：在AMI早期診斷和判別有無再灌注上同樣有很高的靈敏度和特異性。普通以CK-MB21.9U/L或CK-MB2/CK-MB11.5作為AMI的

34、診斷規(guī)范。 六、乳酸脫氫酶及其同工酶 一生化特性與組織分布1. 生化特性乳酸脫氫酶lactate dehydrogenase，LD或LDH是糖酵解途徑中的一種重要酶。LD除催化L-乳酸外還可催化-羥丁酸、-酮丁酸進展脫氫反響。2. 組織分布LD位于細胞質中，是一種含鋅的糖酵解酶。LD是由H心型和M型肌型兩種不同亞基組成的四聚體。兩種亞基分子量一樣，但氨基酸組成不同，理化性質亦不同，構成5種同工酶。假設用-羥基丁酸作為底物，可測定H亞基的活性。由于H亞基可以催化-羥基丁酸脫氫，所以又稱為-羥基丁酸脫氫酶-HBD，實踐上就是測定的LD1和LD2活性之和。二測定方法與臨床意義1.測定方法 LD-L法

35、與LD-P法。 LD同工酶常用電泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。2. 臨床意義1心肌梗死 LD心肌酶中升高最晚，繼續(xù)時間長。2急性肝炎、慢性活動性肝炎和肝癌(尤其轉移性肝癌)時，LD明顯升高。3LD同工酶主要用于AMI和肝病的診斷 A. AMI LD1升高最為顯著，LD1/LD21，視為診斷AMI的一個特異目的。 B. 肝膽疾病 LD5升高常表示有肝細胞壞死。肝細胞性黃疸時LD5LD4，阻塞性黃疽時LD4LD5。 C.腫瘤 肝癌(尤其轉移癌)時可伴有LD4和LD5明顯增高；白血病、膠原病時以LD3、LD4增高為主。 D. 惡性貧血 LD活性極度升高(原始巨幼紅細胞可產(chǎn)生并釋放LD)，伴有LD1

36、明顯升高，LD1LD2。表5-7 AMI時血清酶學變化 酶開場升高時間h達峰值時間h恢復正常時間h CK41012367296 CK-MB3612244872 AST612244835天 LD122448721012天 LD1101248721012天AMI時心肌酶時相變化 七、酸性磷酸酶及其同工酶 一生化特性與組織分布1. 生化特性酸性磷酸酶acid phosphatase，ACP是一組對底物專注性不強、在酸性條件下水解各種正磷酸單酯的酶。2. 組織分布ACP主要存在于體內(nèi)一切細胞的溶酶體中。血清中ACP主要來源于前列腺，稱為前列腺ACPPAP，它可被酒石酸抑制；其活性約為其他組織中酶活性的

37、100倍。非前列腺ACP，不被酒石酸抑制。正常男性血清中的ACP約有1/31/2來自前列腺，其他那么與女性血中的ACP一樣能夠來自血小板或破骨細胞。二測定方法與臨床意義1. 測定方法 采用化學法和免疫法血標本采取后必需盡快分別血清并立刻測定。2. 臨床意義1前列腺疾病 血清PAP測定是診斷前列腺癌最重要的目的之一。在前列腺肥大、前列腺炎、急性尿潴留時亦可升高。酒石酸抑制實驗可區(qū)別PAP與非PAP。2骨?。簮盒怨悄[瘤、變形性骨炎、多發(fā)性骨髓瘤、骨質疏松、代謝性骨病等輕度增高。3肝病 肝癌、肝硬化肝炎時ACP增高。4血液病 溶血性疾病、白血肉、血小板疾病等，ACP均有不同程度的升高。八、淀粉酶及其

38、同工酶 一生化特性與組織分布1. 生化特性 -amylaseAMY或AMS是一種不均一性的鈣依賴金屬蛋白酶。AMY作用的最適pH在6.57.5，鹵素和其他陰離子有激活作用ClBrNO3I。分子量40 00050 000，易從腎臟排出。半壽期很短，約為2h。2. 組織分布-AMY分為兩種同工酶：S-AMY和P-AMY。利用醋酸纖維薄膜電泳或瓊脂糖電泳可將S-AMY分為S1、S2、S3和S4四個亞型；P-AMY分為P1、P2、P3三個亞型。P-AMY和S-AMY可單獨或結合與抗淀粉酶本身抗體以非共價方式結合，構成高分子循環(huán)復合物，稱為巨淀粉酶Macroamylase，M-AMY。M-AMY的分子量

39、較大，不易從腎小球濾過，因此容易呵斥高淀粉酶血癥。二測定方法與臨床意義1. 測定方法AMY總活性測定：化學法、酶偶聯(lián)法同工酶測定：瓊脂糖電泳法、免疫抑制法。2. 臨床意義1AMY活性增高 急性胰腺炎發(fā)病后3h6h 開場升高，12h24h達峰 值，2天5天下降恢復至正常。超越500U有意義。 慢性胰腺炎急性發(fā)作、胰腺癌等AMY升高。 急腹癥如急性闌尾炎、腸梗阻、潰瘍現(xiàn)穿孔等，血清 AMY可升高。這些病變可涉及胰腺，較急性胰腺炎為低。2AMY活性降低 主要見于肝炎、肝硬化等。3AMY同工酶增高 急性胰腺炎和慢性胰腺炎急性發(fā)作P型增高； 腮腺炎、肺癌、卵巢癌等S型增高。九、脂肪酶測定1. 生化特性脂

40、肪酶lipase，LPS又稱甘油三酯酶，其專注性不高，是一種單鏈糖蛋白?？杀粠€基化合物、膽汁酸、Ca2+及輔脂肪酶等激活劑激活，而被重金屬、絲氨酸所抑制。血清中LPS主要來源于胰腺的腺泡細胞。2. 測定方法 比濁法和分光光度法酶偶聯(lián)顯色比色法3. 臨床意義 主要用于診斷胰腺疾病，血清LPS在急性胰腺炎時活性升高的時間早，上升幅度大，繼續(xù)時間長，故其診斷價值優(yōu)于AMY。在急性胰腺炎發(fā)作后2h12h，血清LPS可顯著升高，24h至峰值，48h72h能夠恢復正常，但隨后又可繼續(xù)升高8天15天。在酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血清LPS也可有不同程度的升高。十、膽堿酯酶cholin

41、esterase，ChE一生化特性 乙酰膽堿酯酶AChE和擬膽堿酯酶PChE。二測定方法有兩類方法：一類以乙酰膽堿為底物，另一類是以人工合成的底物測定膽堿衍生物的生成。丁酰硫代膽堿法是目前測定血清ChE最常用的方法。三臨床意義 用于肝臟損傷和有機磷中毒的診斷。1有機磷中毒：兩種ChE活性均減低，由于有機磷與ChE活性中心結合，使其喪失催化才干。ChE活性在5070為輕度中毒；3050為中度中毒；30以下為重度中毒。亞急性及慢性中毒，AcbE可降至O。2肝本質損害：肝臟具有合成膽堿酯酶的功能。肝本質性損傷時，ChE合成降低；當肝功能恢復后，ChE合成亦隨之逐漸轉為正常。3增高 腎臟疾病(排泄妨礙

42、或合成亢進)；脂肪肝、甲亢、糖尿病等可出現(xiàn)ChE的增高。 十一、酶學檢測工程的選擇及運用 檢測工程 運用肝病有關酶ALT與AST 肝細胞損害 輕、中度損傷ALT升高為主，重度損傷以AST升高明顯。 ALP與GGT 膽汁淤滯，在膽汁排泄受阻的肝膽疾病時升高。骨疾病時升高。 MAO 肝臟纖維化，肝纖維化病變及肝硬化時可升高。 ChE 肝本質細胞功能，肝本質損害致肝功能不全時，ChE減低。心肌損傷有關酶 CK與CK-MB AMI、心肌炎和肌病、骨骼肌損傷目的。AMI時出現(xiàn)變化及達峰 值 時間早，但繼續(xù)時間短；CK-MB敏感性高于CK。 AST AMI 時可升高，其變化僅晚于CK和CK-MB，但早于L

43、D及LD1。LD及LD同工酶 AMI等心肌病變、肝臟及骨骼肌病變的目的。AMI時LD及LD1升 高，繼續(xù)時間長，晚于CK、AST；肝臟病變時LD及LD5升高。胰腺疾病有關酶 AMS 血、尿AMS升高反映急性胰腺炎、慢性胰腺炎急性發(fā)作、胰腺癌和 胰腺導管阻塞。血AMS變化早于尿，但尿AMS升高繼續(xù)時間長。 LPS 急性胰腺炎時LPS明顯升高，但晚于AMS，而繼續(xù)時間比AMS長，可 用于急性胰腺炎晚期診斷。與AMS同時測定可提高診斷敏感度。其他酶 ACP 血清ACP升高反映前列腺癌等前列腺疾病；骨病、肝病和血液病時， ACP也可升高。底物濃度與Km比值相當?shù)淖畲蠓错懓俜直?S/KmV/100100

44、.099.010.091.01.050.00.19.00.010.99普通以為酶測定時底物濃度最好為Km的20倍乃至100倍。在實踐任務思索究竟物溶解度的限制，價錢的昂貴，可將底物濃度降為Km的10倍。再低就不適宜酶的測定，能夠產(chǎn)生較大誤差。乳酸脫氫酶，當丙酮酸濃度超越一定量時，酶活性反而下降，故丙酮酸濃度不能過高。 酶 偶 聯(lián) 反 應 1. 酶偶聯(lián)反響有一個明顯的延滯期。反響一開場只存在底物A，不存在指示酶的反響，隨著產(chǎn)物B的出現(xiàn)和添加，指示酶反響隨之加快，Ex和Ei反響速度相等，也就是到達穩(wěn)態(tài)。從酶反響開場至穩(wěn)態(tài)期間，指示酶反響較慢且不穩(wěn)定，稱為延滯期。設計或選擇酶測定方法時，假設用酶偶聯(lián)

45、法，延滯期越短越好，測定時間一定要避開此期。2. 在酶偶聯(lián)法，此值無法直接求出A/t ，而是經(jīng)過測定指示酶反響C/t間接求出。要使酶偶聯(lián)法測得的酶活性濃度準確可靠，那么VindVx。換言之，指示酶的最大反響速度必需等于或接近測定酶的最大反響速度。3. 在延滯期后即B到達頂峰后的時期，C和A的變化速度要非常一致。也就是只需在些情況下，才是測定酶濃度的理想條件。4. 用酶偶聯(lián)反響測酶活性濃度時，最好條件應是測定酶反響為限速反響，動力學上為零級反響。指示酶為一級反響，酶反響速度與指示酶底物濃度相關。測定最大反響速度與初速度1. 設計和選擇測定酶活性濃度方法時必需是在“最適條件下測定最大反響速度。所測

46、的最大反響速度應該是初速度V0。2. 實際上的V0在實踐任務中是不存在的，必需讓酶和底物作用一段時間，耗費掉一定量的底物，才干測出反響速度。如耗費底物在5內(nèi)所測到的反響速度都可以為是初速度，如底物濃度很高時，底物耗費在20以內(nèi)的反響往往還在線性反響期 。3. 延續(xù)監(jiān)測法由于不需停頓酶反響，很容易得到整個酶反響曲線，然后根據(jù)反響曲線情況，避開延滯期和非線性反響期，只在線性反響期測定最大反響初速度。同時延續(xù)監(jiān)測法能在很短時間，甚至在1分鐘反響時間，準確測定反響速度，從而求出準確的酶活性濃度?！肮潭〞r間法測定時間長達30分鐘，很難滿足上述方法學上測定初速度V0的要求。 指示酶、輔助酶的濃度計算方法一

47、根據(jù)Vx/(Km)x：Vi/(Km)i的比值來選擇指示酶的用量Vi，式中Vx為測定酶的測定上限。比值為1:10、 1:100、 1:1000時，誤差28、 4、 0.7。實例：在肌酸激酶測定法中，CK的Km為2.4mmol/L，指示酶G-6-PD的Km為0.27mmol/L，如將CK測定上限定為450U/L實踐測定時標本稀釋60倍，實踐為7.5U/L，如希望上述比例為1:100。代入上式： Vx/(Km)x：Vi/(Km)I=1：100Vi3.1103min10.27mmol1008.37102mmolmin1 L 183.7U/L如反響體系為1ml，只需0.0837U的G-6-PD 即可。指

48、示酶、輔助酶的濃度計算方法二根據(jù)米氏方程式來計算，在酶偶聯(lián)反響中，指示酶催化速度Vi的米氏方程式為： 以天冬氨酸氨基轉移酶AST為例希望中間產(chǎn)物P濃度很低，定為0.001mmol/L，指示酶蘋果酸脫氫酶Km為0.0165mmol/L，如設定AST上限為300U/L標本為1:12稀釋，實測上限為25U/L。代入上式：Vi0.0014mmol min11.4U得1.4U，如反響體系為3ml，那么試劑中蘋果酸脫氫酶用量為466U/L，目前試劑中用量為600U/L。從以上計算來看，試劑中用量是足夠的。輔因子、活化劑的種類和濃度 輔因子cofactors:一種酶的活性所需求的一種非蛋白質成分。金屬離子激活劑或一種有機分子輔酶。1. 輔酶Coenzyme。NAD、NADP、ATP等，與酶蛋白結合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開。在作用方式上和底物類似，在酶反響過程中與酶結合、分別及反復循環(huán)。在方法學上，將它們按底物處置。2. 輔基 脫輔基酶蛋白apoenzyme，全酶holoenzyme。 是酶蛋白不可分割部分，轉氨酶需求磷酸吡哆醛為其輔基。 顯著特點之