單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法進(jìn)展(共13頁(yè))

1、食品微生物期末(q m)考核題目(tm)：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法(fngf)進(jìn)展姓名： 學(xué)號(hào)： 班級(jí)： 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法進(jìn)展康陽(yáng)妃西南大學(xué)(dxu)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715摘要(zhiyo)：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌是一種(y zhn)能引起人畜共患病的食源性致病菌之一，在自然界中分布廣泛。近年來(lái)，在許多國(guó)家，它是衛(wèi)生部門重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的幾種食源性致病菌之一。本文介紹了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性，流行病學(xué)特征。總結(jié)了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌現(xiàn)行有效的的常規(guī)和快速的檢測(cè)方法及流程，并對(duì)各方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較。關(guān)鍵詞：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌；生物學(xué)特征；流行病學(xué)特性；檢

2、測(cè)；致病菌The progress of detection methods to Listeria monocytogenes Kang yangfeiCollege of Food Science ,SouthwestUniversity,Chongqing400715Abstract:Listeria monocytogenes is one of foodborne pathogens that can cause zoonosis,it is found ubiquitously in the environment. In recent years, it is one of se

3、veral kind of foodborne pathogens that the Health department focus on surveillance to in many countries.This paper introduce the biological and epidemiological characteristics of Listeria monocytogenes. Summarize the current effective conventional and rapid detection methods and processes of Listeri

4、a monocytogenes.Key words:Listeria monocytogenes; biological characteristics;epidemiological characteristics ; Detection;pathogens引言單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種短小的革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌，是一種人畜共患病的致病菌，可使人和動(dòng)物患李斯特菌病。李斯特菌屬（listeria) 現(xiàn)在有2個(gè)群7個(gè)種, 分別是單核細(xì)胞增生性李斯特菌(L monocytogenes , LM) (亦稱產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌)、 伊氏李斯特（L.ivanovii)(亦稱綿羊李斯特菌)、英諾克李斯特菌

5、（L innocua)亦稱無(wú)害李斯特菌)、韋氏李斯特菌（L welshimei)、 塞氏李斯特菌（L seeligeri)、格氏李斯特菌（L.grayi) 和莫氏李斯特菌(L.murrayi) James M JAY. 代食品微生物學(xué)M杰伊( 美) 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001。食品中存在的李斯特氏菌對(duì)人類的安全具有較大威脅，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。本文擬對(duì)李斯特氏菌的生物學(xué)特性，流行病學(xué)特征，檢測(cè)方法及其當(dāng)前存在的問題等作系統(tǒng)介紹，以期為進(jìn)一步深入研究提供參考。1單核細(xì)胞增生(zngshng)李斯特氏菌的生物學(xué)特性1.1 形態(tài)學(xué)特

6、征(tzhng) 李斯特菌(以下簡(jiǎn)稱李氏菌)的幼齡菌(取1624h的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色), 呈革蘭陽(yáng)性小桿菌,長(zhǎng)0152Lm, 寬014 016Lm, 直或稍彎, 常呈V字形, 成對(duì)排列。但是陳舊培養(yǎng)物多轉(zhuǎn)為革蘭陰性,兩端濃染, 而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有柵欄狀排列的趨勢(shì), 易誤認(rèn)為白喉菌而錯(cuò)判。無(wú)芽胞, 一般不形成莢膜, 但在含血清(xuqng)的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖莢膜。在22 25e 環(huán)境中形成4根鞭毛, 故在25e 肉湯培養(yǎng)液中運(yùn)動(dòng)活潑, 用生理鹽水制成菌懸液, 在油鏡或相差顯微鏡下觀察, 該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng); 而在32e時(shí)僅形成一根鞭毛, 動(dòng)力緩慢

7、 何冬梅,鄧峰,賴蔚苳,嚴(yán)紀(jì)文,宋曼丹,朱海明,柯昌文,馬聰. 單核細(xì)胞增生李斯特菌生物學(xué)研究進(jìn)展J. 華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,06:26-29.。1.2 培養(yǎng)特征本菌為需氧或兼性厭氧菌。在340均可生長(zhǎng)。生長(zhǎng)需要生物素、核黃素、硫胺素各種氨基酸、水解吐溫。在含肝浸汁、腹水、血液中生長(zhǎng)良好。在EB和葡萄糖肉湯中呈混濁生長(zhǎng), 后者不產(chǎn)氣, 液面形成菌膜, 管底有少量沉淀。在SS平板和麥康凱上不生長(zhǎng)。在TSAYE平板上生長(zhǎng)為灰白色、半透明、圓潤(rùn)、邊緣整齊, 直徑為0. 710mm的菌落, 在血平板上菌落灰白色、圓潤(rùn)、直徑為1. 01. 5mm, 菌落周圍為3mm的清晰溶血環(huán)。4放置4天后,菌落和溶

8、血環(huán)直徑增至5mm呈典型奶油滴狀。在SIM或半固體培養(yǎng)基上沿穿刺成傘形生長(zhǎng)。在MMA 瓊脂上用Hemg側(cè)光檢查, 可見藍(lán)綠色光 王捷.李斯特氏菌食物中毒J.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，1999,26（4）：550-551。1.3 生化特性由于菌株不同，糖發(fā)酵結(jié)果有差別。本菌一般可分解葡萄糖及( 水) 楊苷，37時(shí)產(chǎn)酸; 對(duì)伯膠糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、鼠李糖、松甜糖、糊精、馬栗苷、山梨醇及甘油等糖類，于310d產(chǎn)酸不發(fā)酵; 對(duì)棉實(shí)糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、側(cè)金盞花醇及甘露醇等則不發(fā)酵。不利用枸椽酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸和鳥氨酸均陰性。VP、甲基紅和精氨酸雙水解陽(yáng)性。陳倩等

9、用VITEK對(duì)LM進(jìn)行系統(tǒng)的生化鑒定，結(jié)果顯示蛋白胨、桿菌肽、奧普托欽、6%Nacl、10%膽汁、七葉苷、紅四氮唑、右旋葡萄糖、水楊素、海藻糖和纖維二糖為陽(yáng)性; 半纖維素酶、40%膽汁、精氨酸、尿素、新生霉素、乳糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、阿拉伯糖、丙酮酸、淀粉、菊糖、蜜二 糖、松三糖、核糖、木糖為陰性 胡文忠,薩仁高娃,姜愛麗,劉程惠,何煜波. 產(chǎn)單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的研究進(jìn)展A. 中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì).中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第九屆年會(huì)論文摘要集C.中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì):,2012:2.。1.4 抗原(kngyun)特性LM具有(jyu)菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原, 采用凝集和粘

10、附試驗(yàn)可將LM分成四個(gè)血清型: 1, 2, 3, 4型,之后再進(jìn)一步分成16個(gè)血清變種。調(diào)查研究表明 Kessel JSV,Karns JS,Gorski L,et al.Prevalence of Salmonellae, Listeria monocytogenes, and fecal coliforms in bulk tank m ilk on US dairies. Journal of Dairy Science . 2004, 87: 2822-28301, 致使食源性李斯特菌病發(fā)生(fshng)的多由血清4b型引起,其次是1/2a、1/2b。2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行性

11、病學(xué)2.1 致病因子2.1.1 李斯特菌溶血素（Listeriolysion O,LLO) 李斯特菌溶血素是由hly基因編碼的蛋白,是一種孔形成毒素，是主要的毒力因子，可破壞吞噬體，使細(xì)菌進(jìn)入胞液并在其中繁殖，失去后導(dǎo)致細(xì)菌毒力的喪失。不產(chǎn)生LLO的可在非吞噬細(xì)胞的胞液中生存一段時(shí)間，但卻不能繁殖，可被吞噬細(xì)胞殺滅。近年的研究表明LLO是一個(gè)多功能的毒力因子，能引起宿主細(xì)胞很多反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、黏膜細(xì)胞外滲作用、巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)樹突狀細(xì)胞的凋亡、磷脂代謝及 引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等 朱獻(xiàn)忠. 單核細(xì)胞增生性李斯特菌研究進(jìn)展J. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,07:1333-1335.。2.

12、1.2 P60蛋白 P60蛋白是一種胞壁質(zhì)水解酶, 由iap基因編碼。通常P60蛋白于細(xì)胞表面產(chǎn)生, 并大量分泌到生長(zhǎng)介質(zhì)中, 對(duì)于細(xì)胞的分裂是必不可少的。分析P60蛋白編碼基因的突變體顯示, 對(duì)于LM的吞噬細(xì)胞溶解作用以及對(duì)機(jī)體的感染過程, P60蛋白是一個(gè)重要的因素。2.1.3 磷脂酶C 由plcB基因編碼,具有鋅依賴性, 分為性質(zhì)不同的兩類,即磷脂酰肌醇磷脂酶C( PI- PLC)和磷脂酰膽堿磷脂酶( PC-PLC)。PI-PLC系以活化的形式合成, 而PC- PLC則先以非活化的前肽被分泌出來(lái), 然后在胞外由mpl的基因產(chǎn)物Mpl蛋白酶加工。PI- PLC可輔助細(xì)菌逸出初級(jí)吞噬體,而細(xì)

13、菌在細(xì)胞與細(xì)胞之間的擴(kuò)散過程中, PC- PLC則表現(xiàn)出一定的活性作用。AngelikaGrundling等通過利用誘導(dǎo)PC- PLC表達(dá)系統(tǒng)證明, 缺乏LLO的LM, PC- PLC的活性不僅對(duì)在人類上皮細(xì)胞中初級(jí)吞噬體的溶解是必需的, 而且對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間的擴(kuò)散也是必需的。2.1.4 ActA蛋白 系由actA基因編碼的表面蛋白, 通過誘導(dǎo)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白分子的聚合作用促使細(xì)菌在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳遞, 同時(shí)也與細(xì)菌被宿主細(xì)胞內(nèi)化有關(guān)。2.1.5 PrfA蛋白 系由prfA基因編碼,是一種轉(zhuǎn)錄因子, 是李斯特菌所有基因簇(包括prfA本身)轉(zhuǎn)錄激活所必需, 是迄今鑒定出的李斯特菌的唯一毒力調(diào)節(jié)蛋

14、白; 在感染宿主細(xì)胞的過程中, 對(duì)于許多毒力因子的等位表達(dá)起到了關(guān)鍵調(diào)控因子的作用。2.1.6 內(nèi)化素( Internalis) LM通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞體內(nèi), 有些細(xì)胞如巨噬細(xì)胞是“專職”吞噬細(xì)胞, 通常吞噬細(xì)菌并將其殺滅; 而其它的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞則為非/專職0吞噬細(xì)胞, 但可經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生吞噬細(xì)胞的能力。InlA是被認(rèn)定的第一個(gè)LM表面蛋白, 對(duì)于LM穿入非吞噬細(xì)胞如上皮細(xì)胞來(lái)說是必需的, InlB在對(duì)肝細(xì)胞的侵襲過程中起著重要的作用, 即InlA和InlB是LM被非吞噬細(xì)胞內(nèi)化所必需。另外, 小的分泌性亞族在體內(nèi)對(duì)傳染過程有明顯影響, 實(shí)驗(yàn)證明, LM的inlC缺失后, 對(duì)小鼠的LD

15、50明顯增加。2.1.7 表面(biomin)蛋白P104 除了內(nèi)化素以外, LM另一種表面蛋白P104也已被證實(shí)對(duì)于腸道細(xì)胞的粘附非常(fichng)重要 李郁,魏建忠,王桂軍. 產(chǎn)單核李斯特菌的研究進(jìn)展J. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,08:1018-1020。2.2致病機(jī)理(j l)（1）寄生物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞； （2）抗活化的巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的過氧物（為殺菌的毒性游離基團(tuán)）分解； （3）溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，能引起宿主細(xì)胞很多反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、黏膜細(xì)胞外滲作用、巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因

16、子的表達(dá)樹突狀細(xì)胞的凋亡、磷脂代謝及 引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等 NIGHTINGALE K K，WINDHAM K，WIEDMANN M，et alEvolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods JJ Bacteriol，2005，187（16）：55375551。2.3傳播途徑及所致疾病 該菌廣泛存在于自然界，如土壤、污水、人和動(dòng)物糞便、蔬菜、青貯飼料及多種食物中。本菌可通過眼及破損皮膚黏膜進(jìn)入人體而造成感

17、染，孕婦感染該菌后出現(xiàn)類似流感癥狀，通過胎盤或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒，并致流產(chǎn); 棲居于陰道子宮頸也引起感染，獸醫(yī)師及從事相關(guān)職業(yè)的人員易患皮膚型李斯特菌病。主要表現(xiàn)為： 妊娠感染：可在妊娠的任何時(shí)期發(fā)生，更多發(fā)生在后 3 個(gè)月，有畏寒、背痛、發(fā)熱現(xiàn)象，不進(jìn)行血培養(yǎng)時(shí)，往往被疑為是尿路感染，癥狀可自限，也許不影響胎兒，但也可致胎兒早產(chǎn)或死胎；足月分娩經(jīng)產(chǎn)道感染新生兒，常會(huì)在產(chǎn)后一個(gè)月出現(xiàn)癥狀，多數(shù)表現(xiàn)為腦膜炎。 新生兒敗血性肉芽腫病：通過胎盤途徑感染，分娩后發(fā)病?；純河卸鄡?nèi)臟播散性膿腫或肉芽腫，包括腦、肺、腎、肝、脾等組織，常伴有皮膚紅丘疹、結(jié)膜炎、咽炎，多發(fā)于軀干及肢端，患兒可出現(xiàn)循環(huán)和呼吸衰

18、竭，致死率高達(dá) 33%100%，及早治療可以提高存活率。 敗血癥：成人和嬰幼兒均可發(fā)生，部分患者會(huì)出現(xiàn)感染性休克，成人患者常伴有免疫缺陷，新生兒出生后 3 天即可出現(xiàn)癥狀，臨床表現(xiàn)與其他革蘭氏陰性菌引起的敗血癥相似。 腦炎、腦膜炎：在新生兒出生 3 天后發(fā)病，成人患者大多數(shù)在器官移植、肝硬化、免疫球蛋白低下及惡性腫瘤等基礎(chǔ)上，顯亞急性過程，中度發(fā)熱，昏迷情況較少，共濟(jì)失調(diào)較為多見，李斯特菌腦膜炎應(yīng)與弓形體、新形隱球菌和肺炎球菌等引起的腦膜炎相鑒別。 腦干腦炎：患者均為成年人，發(fā)病率雖低，但臨床表現(xiàn)卻很嚴(yán)重，癥狀表現(xiàn)為顱神經(jīng)非對(duì)稱性偏癱、共濟(jì)失調(diào)等，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)呼吸衰竭，致死率高達(dá) 50%以上。

19、 局部感染：化膿性結(jié)膜炎及皮膚感染可以是嬰兒敗血(bi xu)肉芽腫的一部分。實(shí)驗(yàn)人員、獸醫(yī)可因直接接觸感染，淋巴結(jié)感染常見于頸部，可與結(jié)核性淋巴結(jié)感染混合存在；除此之外，李斯特菌尚可引起心內(nèi)膜炎、腦膿腫、肝膿腫、肝炎、膽囊炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎等 閻雪. 食源性單核增生性李斯特氏菌LIPI-1基因分布和致病力研究D.河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.- 薩仁高娃,胡文忠,姜愛麗,馬杰,馮可. 產(chǎn)單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌致病機(jī)制的研究進(jìn)展J. 食品工業(yè)科技,2013,01:372-376.。 本菌還可引起畜禽多種嚴(yán)重疾病，可引起家兔單核細(xì)胞增多癥，兔和鼠眼結(jié)膜炎；可引起綿羊和山羊一種所謂旋轉(zhuǎn)??；可引起羊羔、

20、豬敗血癥、腦膜炎、腦脊髓膜炎I禽類如 雞、鴨、火雞感染(gnrn)病死后剖驗(yàn)，心肌呈明顯退行性病變，心周圍有時(shí)伴有滲出液肝和腎局部壞死及壘身 水腫。馬、羊、牛、雞、兔、豬和尤有較高的病死率 (52100 ) 董麗麗,王春生,安笑秋,韓立卓. 單核細(xì)胞增生李斯特菌簡(jiǎn)介J. 中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2000,12:24-25。2.4 預(yù)防(yfng)控制措施單核細(xì)胞增生李斯特菌在自然界廣泛分布，主要是通過食源性傳播，污染食品的來(lái)源和途徑很多，所以預(yù)防此菌的感染要從多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行，如食品的生產(chǎn)、加工、包裝、儲(chǔ)存和銷售的過程及部門、家庭個(gè)人的飲食衛(wèi)生、牲畜的養(yǎng)殖等，減少細(xì)菌的污染，切斷細(xì)菌的傳播途徑并殺滅細(xì)菌。具

21、體措施如下：（1）單增李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌群，使單增李斯特氏菌在沒有競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達(dá)到70持續(xù)2分鐘以上。（2）單增李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產(chǎn)品已經(jīng)過熱加工處理充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產(chǎn)品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是極為重要的。（3）由于單增李斯特氏菌在4下仍然能生長(zhǎng)繁殖，所以未加熱的冰箱食品增加了食物中毒的危險(xiǎn)。冰箱食品需加熱后再食用。3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法及流程3.1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法分離培養(yǎng) 我國(guó)于1994年開始發(fā)布單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),即GB/T

22、4789.30-1994。目前,很多檢測(cè)部門和單位在進(jìn)行食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)時(shí),其主要依據(jù)依然是國(guó)標(biāo)法。國(guó)標(biāo)GB/T4789.30-1994自從頒布以來(lái),分別進(jìn)行了3次修訂,分別是GB/T4789.30-2003,GB/T4789.30-2008,直至現(xiàn)在正在實(shí)行中的GB/T4789.30-2010版本。修訂后的GB/T4789.30-2010法,對(duì)于樣品檢測(cè)依次進(jìn)行增菌、選擇性分離平板分離培養(yǎng)、初篩試驗(yàn)、鑒定等步驟,通過增加API鑒定試驗(yàn)代替生化試驗(yàn)和協(xié)同溶血試驗(yàn)。其主要流程如圖1。雖然近年來(lái)顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用和ATB生化鑒定儀的聯(lián)合使用已大大簡(jiǎn)化了鑒定步驟,縮短了檢測(cè)周期,但由

23、于ATB生化鑒定儀鑒定單核細(xì)胞增生李斯特氏菌主要依據(jù)10種生化反應(yīng)(主要為糖發(fā)酵),結(jié)果的判定主要是依據(jù)顏色變化,因此顏色變化不明顯或者(huzh)不好界定時(shí),其陰陽(yáng)性判定帶有一定的主觀性。而且使用的API試條和試劑質(zhì)量必須是符合有關(guān)的要求。另外,由于需要二次增菌、平板分離及生化鑒定,整個(gè)過程至少需要45 d。總之,傳統(tǒng)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌分離鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)、程序繁瑣、試劑和人力成本都比較高。 GB/T 4789.30-2008, 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)S. GB 4789.30-2010, 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)S.。3.2 酶聯(lián)

24、免疫(miny)法（ELISA)由于細(xì)菌菌體和鞭毛抗原的存在使得人們(rn men)可以建立基于抗原抗體反應(yīng)的方法來(lái)檢測(cè)食品中的致病菌。其檢測(cè)原理主要是將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面,再將抗原或抗體特定基團(tuán)與酶交聯(lián)成酶結(jié)合物,當(dāng)酶結(jié)合物同相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后,則形成酶-抗原抗體復(fù)合物;當(dāng)酶遇到相應(yīng)的底物時(shí),可以催化產(chǎn)物水解、氧化或還原,從而產(chǎn)生有色物質(zhì)。檢測(cè)時(shí)根據(jù)有色物質(zhì)的有無(wú)及其深淺,即可間接推斷被檢樣品中有無(wú)相應(yīng)抗原或抗體存在和數(shù)量多少,從而達(dá)到定性和定量檢測(cè)的目的。其檢驗(yàn)流程如下： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 前增菌：無(wú)菌操作取25g(mL)樣品(yngpn)到均質(zhì)

25、袋中，并向其中加入225mL Fraser = 1 * ROMAN * MERGEFORMAT I增菌液,充分(chngfn)均質(zhì)，于301培養(yǎng)(piyng)24h1h。 = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 增菌：移取1mL Fraser = 1 * ROMAN * MERGEFORMAT I 增菌液到9mL Fraser = 2 * ROMAN * MERGEFORMAT II 增菌液中，于301培養(yǎng)24h1h。 = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 增菌后處理：移取1mL增菌液到滅菌小試管中，于沸水中加熱15min。剩余的增菌液于4保存，以便于陽(yáng)性確認(rèn)。 = 4 *

26、GB3 * MERGEFORMAT 取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒，于1530的環(huán)境中放置30min。 = 5 * GB3 * MERGEFORMAT 取適量加熱處理后的增菌液到試劑盒測(cè)試孔中，通過自動(dòng)或手動(dòng)操作，經(jīng)過酶聯(lián)免疫反應(yīng)過程后，檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度（熒光強(qiáng)度或吸光度），與參照值比較，得出檢測(cè)結(jié)果 GB/T 22429-2008, 食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫法S.。該方法具有操作簡(jiǎn)便、通量高的特點(diǎn),可在同一時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品,并可將純?nèi)鉁囵B(yǎng)物中的分離物進(jìn)行屬水平的鑒定。但由于菌體及鞭毛抗原交叉反應(yīng)的存在,還難以進(jìn)行李斯

27、特氏菌種間特異分析。同時(shí),由于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌表面抗原極其豐富,且大部分優(yōu)勢(shì)表位與屬內(nèi)外細(xì)菌有廣泛的交叉抗原,給篩選特異性單克隆抗體帶來(lái)一定的困難,增加了假陽(yáng)性結(jié)果的幾率。因此,用ELISA方法從增菌培養(yǎng)物中篩選李斯特氏菌,一般還需要在選擇性分離平板上劃線培養(yǎng),這同時(shí)也延長(zhǎng)了檢測(cè)周期。 3.3 PCR檢測(cè)方法美國(guó)科學(xué)家KaryMullis在1985年發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），并在 Science 雜志上發(fā)表了關(guān)于該技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR 技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，KaryMullis 也因此而獲得 1993 年的諾貝

28、爾化學(xué)獎(jiǎng)。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR 方法被不斷改進(jìn)，它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定，從原先只能擴(kuò)增幾個(gè) kb 的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè) kb 的 DNA 片段。到目前為止，由傳統(tǒng)的 Direct-PCR 衍生出的技術(shù)已有十幾種之多，如 RT-PCR、nested-PCR、IMS-PCR、多重 PCR、Realtime-PCR、免疫捕捉 PCR 等等，許多研究者也將這些技術(shù)用于食品 LM的檢測(cè) 劉雅莉. 單核細(xì)胞增生性李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)研究D.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.。目前國(guó)標(biāo)規(guī)定的PCR檢測(cè)方法是多重PCR法。其檢測(cè)流程如下：3.3.1樣品的收集與處理 如為冷凍樣品，應(yīng)于2

29、-5解凍，且不超過18 h,若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于-1 5保存。非冷凍的易腐樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于4冰箱保存，在24 h內(nèi)檢驗(yàn)。 無(wú)菌取樣品25 g(mL)放人滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中加225 ml. BLEB增菌液，充分均質(zhì)。3.3.2增菌培養(yǎng)(piyng) 與樣品均質(zhì)混合(hnh)的BLEB增菌液（添加了丙酮酸鈉）置于30士1預(yù)增菌4h，再加入選擇性試劑(shj)放線菌酮溶液1.15 mL、吖啶黃溶液0.455 mL、萘啶酮酸溶液1.8 mL30士l繼續(xù)增菌培養(yǎng)。3.3.3分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基的分離培養(yǎng): 分別取30C+l培養(yǎng)24 h和30 h增菌液一環(huán)，劃線分離于選擇性

30、培養(yǎng)基OXA、PALCAM瓊脂平板上，37l培養(yǎng)24 h-48 h。黑色菌落觀察: 李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長(zhǎng)24 h后菌落呈現(xiàn)黑色，直徑為1 mm左右，在其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)，培養(yǎng)48 h，菌落仍呈黑色，直徑2 mm3 mm，除在菌落周圍有一環(huán)外，在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在OXA瓊脂平板上的菌落相似。在OXA瓊脂平板和PALCAM瓊脂平板上挑取5十或更多可疑菌落，接種于TSAYE瓊脂平板上，純培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定。3.3.4 PCR鑒定1、細(xì)菌的培養(yǎng)：挑取可疑李斯特菌菌落接種于6 mL TSB-YE肉湯，37過夜培養(yǎng)。2、細(xì)菌DNA抽提：離心

31、培養(yǎng)液收集細(xì)菌(4 000 r/min，10 min)，用1 mL滅菌水洗1次后離心(8 000 r/min，5 min)，加入等體積的滅菌水和TZ緩沖液重懸，使細(xì)菌濃度約為104 cfu/mL_108 cfu/mL（肉眼可見明顯渾濁），沸水浴處理8 min，冰水中冷浴10 min,8 000 r/min離心5 min，收集上清液即可用于PCR擴(kuò)增。3、PCR擴(kuò)增體系： 50 L反應(yīng)體系中：10PCR buffer 5L.、Taq酶(5 U/L) 1 L、MgCl2 (25 mmol/L)3L.dNTP(5 mmol/L)2 L、引物MonoA(20 mmol/L)和LisB(20 mmol/

32、L)各2.5L、HAl (20 mmol/L)和HA2 (20 mmol/L)各1.5L、模板DNA(5 L)，加雙蒸水26 L。4、PCR擴(kuò)增條件： 95預(yù)變性3 min，95變性45 s，62復(fù)性30 s，72延伸45 s，30次循環(huán)，72延伸3 min。5、反應(yīng)體系對(duì)照的設(shè)置 進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。 陽(yáng)性對(duì)照；用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(54007)提取的DNA作為模板。 陰性對(duì)照：用臘樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（63301）提取的DNA和英諾克李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 33090)提取的DNA作為模板(DNA捉取方法同單核細(xì)胞增生李斯特氏菌)。

33、空白對(duì)照：用配置反應(yīng)體系的實(shí)驗(yàn)室用水代替模板。 6、凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物： 用1TAE電泳緩沖液制備1.2%的瓊脂糖凝膠（凝膠融化后冷卻至60左右加入含量為0.5g/mL的溴化乙錠，或者在電泳后用0.5 g/mL溴化乙錠溶液進(jìn)行染色），將5L10L PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，分別加入到對(duì)應(yīng)的凝膠孔中，另在一孔加入適量的DNA分子量標(biāo)記物，選擇合適的電壓進(jìn)行電泳(一般控制在3 V/cm5 V/cm)，最后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析并記錄。 7、結(jié)果(ji gu)分析與判定 SN/T 0184.2-2006, 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法.第2部分:多重PCR方法S. 傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)

34、技術(shù)和常規(guī)檢測(cè)方法相比，由于特異性引物序列存在，大大增加了檢測(cè)的特異性和敏感性，同時(shí)也縮短了檢測(cè)時(shí)間，但尚存在著諸如同位素標(biāo)記探針的放射性污染、檢測(cè)步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等許多不足，因此使其在實(shí)際檢測(cè)工作中的使用受到很大的限制，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，利用了PCR技術(shù)核酸擴(kuò)增的高效性、探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性以及計(jì)量高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)可精確定量、反應(yīng)迅速、信號(hào)重復(fù)性好、靈敏度和特異性高，大大提高了定量的準(zhǔn)確性。此外，由于是在封閉的體系中完成整個(gè)擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)過程，不需要凝膠電泳過程，從而縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)環(huán)境造成的污染問題。因此，利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)(piyng)結(jié)合分子生

35、物學(xué)檢測(cè)，將是未來(lái)分析檢測(cè)發(fā)展的一個(gè)主要趨勢(shì) 劉書花,魏云波,林小靜,李景超. 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)方法研究進(jìn)展J. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010,19:327-328.。3.4免疫(miny)磁珠法免疫磁珠法的基本原理是抗原抗體反應(yīng)。樣品制備后, 在室溫下(1822)將載有抗體的磁珠加至樣品中, 振蕩2h。此間, 李斯特氏菌被吸附在磁珠的抗體上。在磁場(chǎng)的作用下, 與其它微生物和樣品殘?jiān)蛛x開來(lái), 從而將李斯特菌從樣品中直接分離出來(lái), 不需要進(jìn)行富集。將捕集的磁珠進(jìn)行清洗, 在平板上展開, 于37培養(yǎng)22h。將可疑菌落進(jìn)行免疫學(xué)確認(rèn),判定是否為李斯特菌。通過溶血反應(yīng)和鼠李糖反應(yīng)確認(rèn)是否

36、為單增李氏菌。其具體流程如下：1、樣品制備在均質(zhì)袋中加入25樣品，再加入225FB1增菌肉湯，30培養(yǎng)241。2、增菌取mL 1中制備好的樣品，加到10L FB2增菌液中，35培養(yǎng)241后，進(jìn)行免疫磁珠分離。3、免疫磁珠分離（IMS）免疫捕獲：混合2中的增菌培養(yǎng)液，沉淀所有的粗糙食物殘?jiān)瑥脑鼍囵B(yǎng)液中移取上層液體（要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒）加入Eppendorf管中，加20準(zhǔn)備好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液。分離:將Eppendorf管固定在磁架的管孔中，180輕緩擺動(dòng)磁架次次，使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的Eppendorf管管蓋，從磁極對(duì)面一側(cè)慢慢吸出液體，

37、注意不要接觸管壁上的磁珠，每一個(gè)樣品換一次槍頭；加滅菌的，并重新蓋好蓋子，將磁極從支架上移走，180輕緩擺動(dòng)磁架次次，使管內(nèi)各成分混合，然后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開，并加100滅菌的PBS到管中，重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒有磁性分離器，也可以用手搖代替。4、分離培養(yǎng)分離(fnl)培養(yǎng)：吸取50免疫磁珠懸液，加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM瓊脂(qingzh)平板上，用無(wú)菌接種環(huán)劃線，35培養(yǎng)(piyng)2448。篩選：李斯特氏菌在CHROMarar顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色，且在其周圍形成一個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在瓊脂平板上生長(zhǎng)后菌落呈現(xiàn)

38、黑色，直徑為，在其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)，培養(yǎng)，菌落仍呈黑色，直徑，除在菌落周圍有一環(huán)外，在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在瓊脂平板上與在瓊脂平板上菌落相似。在CHROMarar顯色培養(yǎng)基及或PALCAM瓊脂平板上挑取個(gè)或更多可疑菌落，接種于-瓊脂平板上，純培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。鑒定與結(jié)果判定 SN/T 0184.3-2008, 進(jìn)出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法.第3部分:免疫磁珠法S.這一方法的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時(shí)也可通過免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測(cè)，縮短前增菌時(shí)間，并進(jìn)一步降低了單增李斯特氏菌的檢測(cè)限。該方法也存在缺點(diǎn)，當(dāng)磁珠用單抗包被時(shí)無(wú)法識(shí)別所有的李斯特氏菌菌株，而用多抗

39、包被時(shí)又不能區(qū)分致病性和非致病性李斯特氏菌，因此，免疫磁性分析缺乏種間的特異性，不能消除交叉反應(yīng)，與其他雜菌可能發(fā)生非特異性結(jié)合，仍需用溶血實(shí)驗(yàn)等生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。3.5環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測(cè)方法環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 NotomiT 等（2000）在 2000 年提出來(lái)的一種新的高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的問世解決了基于核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的諸多難題，使快速、靈敏、特異檢測(cè)方法成為可能。該方法是根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特有的靶序列vir 基因設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物，特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，利用Bst酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在vir 基因序列啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物；從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物（焦磷酸鎂）形成乳白色沉淀，加入顯色液，即可通過顏色變化觀察判定結(jié)果。