蛋白質(zhì)組學與分析技術(shù)課復習思考題終結(jié)(共6頁)

1、蛋白質(zhì)組學與分析技術(shù)(jsh)復習思考題名詞解釋1. 蛋白質(zhì)組學：是研究與基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)組的學科。指一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)，即包括一個基因組、一種細胞(xbo)或組織，乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。 對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是(b shi)局限于一個或幾個蛋白質(zhì)；其目的是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。雙向電泳原理：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量的特異性將蛋白質(zhì)混合物在第一個方向上按照等電點高低進行分離（等點聚焦（IEF），在第二個方向上按照相對分子質(zhì)量大小進行分離（

2、SDS凝膠電泳（SDS） 二維電泳分離后的蛋白質(zhì)點經(jīng)顯色，通過圖象掃描存檔，最后是呈現(xiàn)出來的是二維方向排列的，呈漫天星狀的小原點，每個點代表一個蛋白質(zhì)。 三步純化策略： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 粗提：分離、濃縮和穩(wěn)定樣品；把蛋白質(zhì)從原來的組織和細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然活性。 = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 中度純化：取出大部分雜質(zhì)；一般使用鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級分離和超濾等。 = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 精細純化：進一步純化、達到最高純度。一般使用凝膠過濾、離子交換層析等層析技術(shù)。4. 高效液相色譜：是 H

3、YPERLINK /view/28457.htm t /_blank 色譜法的一個重要分支，以 HYPERLINK /view/115153.htm t /_blank 液體為 HYPERLINK /view/331237.htm t /_blank 流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同 HYPERLINK /view/744185.htm t /_blank 極性的單一 HYPERLINK /view/62561.htm t /_blank 溶劑或不同比例的 HYPERLINK /view/3451662.htm t /_blank 混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的 HYPERLIN

4、K /view/680305.htm t /_blank 色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對 HYPERLINK /view/1526329.htm t /_blank 試樣的分析。在蛋白組學的研究中可以從復雜混合物中分離某種蛋白質(zhì)組分5. 吸附色譜：又叫液固色譜，流動相是液體，吸附劑是固相；當混合物隨著流動相通過吸附劑時，由于吸附劑對不同物質(zhì)有不同的吸附力而使混合物分離。這是一種早期的色譜分離技術(shù)，主要適用于分子量不大的物質(zhì)的分離。 6. PCR擴增：即聚合酶鏈式反應(yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行

5、，使目的DNA得以迅速擴增。7 基因組文庫：基因文庫(gene library)，也稱基因組文庫（genomic library）：這是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。即用適當?shù)姆椒▽⒛骋环N生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片段，并將這些片段與適當?shù)妮d體進行體外重組，在引入到相應(yīng)的宿主細胞中繁殖和擴增，從而形成含有重組DNA分子的群體。 從理論上講，這些重組子應(yīng)包含整個基因組DNA序列，即包含某種生物細胞的全部基因。因此，稱之為基因組文庫，或基因文庫。8. cDNA文庫：細胞全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和?；蛐酒?j yn xn pin)：又叫DNA芯片（DNA c

6、hip)，DNA微陣列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸陣列（oligonucleotide array）。是一種將核酸分子雜交原理與微電子技術(shù)相結(jié)合而形成的高新生物技術(shù)。 將靶標樣品核酸或探針中的任一方(y fn)按陣列形式固定在固相載體（硅片、尼龍膜、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、玻璃片等）上，另一方用熒光分子標記后，加樣至微陣列上雜交，然后用熒光掃描或攝像技術(shù)記錄，通過計算機軟件分析處理，獲得樣品中大量的基因序列和表達信息。10. 基因(jyn)敲除：基因敲除（gene knock out），又稱基因打靶（gene targeting）,

7、是指用外源的DNA與受體細胞基因組中順序相同或非常相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細胞基因組中并得以表達的一種外源DNA導入技術(shù)。對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，將該基因敲除，或用其他順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動（植）物，推測相應(yīng)基因的功能。11. 同源建模：是一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測方法，具體指是利用同同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為模板來預測未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。同源性大于50時，結(jié)果比較可靠；3050之間， 其結(jié)果需要參考其它蛋白的信息。同源性小于30時，人們一般采用折疊識別方法。同源性更小時，從無到有法更有效。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)氨基酸序列為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。簡答題蛋白質(zhì)組學

8、主要包括那些分析技術(shù)及各自特點蛋白質(zhì)組學分析主要包括：樣品的制備、蛋白質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定、蛋白質(zhì)的互作 = 1 * GB2 * MERGEFORMAT 樣品的制備：主要包括超聲波破碎、液氮冷凍破碎、細胞研磨。酶解法等。 = 2 * GB2 * MERGEFORMAT 蛋白質(zhì)的分離與純化：根據(jù)分子大小不同的純化方法：透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾；利用溶解度差別的純化方法 ：等電點沉淀；鹽溶和鹽析；有機溶劑分級分離法 ；依據(jù)蛋白質(zhì)的電荷：電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳、等電聚焦、層析聚焦、離子交換層析；吸附性質(zhì)：羥磷灰石層析、疏水層析；對配體的特異親和力：親和層析 = 3

9、* GB2 * MERGEFORMAT 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定 = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的測定：X射線衍射、圓二色譜、核磁共振、同源建模等蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測定：Edman化學降解法、酶降解法、質(zhì)譜法、根據(jù)核苷酸序列的推定法 。 = 4 * GB2 * MERGEFORMAT 蛋白質(zhì)的互作：酵母雙雜交、雙分子熒光互補、pull-down assay、表面等離子體共振（SPR技術(shù)）、免疫共沉淀等。此外還包括有：基因芯片、基因敲除、雙向電泳、蛋白質(zhì)芯片、蛋白質(zhì)雜交、蛋白質(zhì)酶學技術(shù)、蛋白質(zhì)的生物信息等。蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖功能蛋白蛋白分離（硫酸氨、乙醇沉

10、淀、離心、獲得功能粗蛋白制品純化（液相色譜、蛋白質(zhì)分析制備儀、雙向電泳、液質(zhì)聯(lián)儀氨基酸測序基因克隆蛋白質(zhì)藥物作用于植物的蛋白表達譜藥物與植物的相互作用。 蛋白樣品的制備原則與純化原理（一）實驗(shyn)樣品的制備原則1)應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有(jyu)可重現(xiàn)性。 2)防止樣品(yngpn)在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 3)防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。4)完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 5)盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。（二）、蛋白質(zhì)的分離純化原理

11、根據(jù)分子大小不同的純化方法：透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾、 利用溶解度差別的純化方法 ：等電點沉淀；鹽溶和鹽析；有機溶劑分級分離法 依據(jù)蛋白質(zhì)的電荷：電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳、等電聚焦、層析聚焦、離子交換層析吸附性質(zhì)：羥磷灰石層析、疏水層析對配體的特異親和力：親和層析簡述高效液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜、液質(zhì)聯(lián)儀的工作原理及用途高效液相色譜：高效液相色譜以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。高效液相色譜具有快速、靈敏、高效的特點，其使用的

12、固定相支持及顆粒很細，表面積大；溶劑系統(tǒng)采用高壓，洗脫速度大。主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化、氨基酸分析、與質(zhì)譜聯(lián)合使用、樣品純度的初步鑒定。氣相色譜：在該層析系統(tǒng)中，以氣體為流動相，多為氫氣、氮氣、氦氣等；固定相為涂在固體顆粒表面的液體。利用氣相層析進行分離也是基于分配過程，即利用樣品組分在流動相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同達到分離的目的。樣品在進樣之后有一個氣化的過程。氣相色譜儀適用于分析具有一定蒸氣壓且熱穩(wěn)定性好的組分，多用于化工組分的分析，也可以分離、分析氨基酸等生物組分。質(zhì)譜：基本原理是待測樣品通過一定方式發(fā)生電離、形成帶電的分子或分子碎片，再借助電場或磁場的作用使這些離子依質(zhì)

13、荷比的不同獲得分離，并按質(zhì)合比大小為序沖擊檢測器，獲得質(zhì)樸圖，通過對質(zhì)譜的分析（試樣分子可能產(chǎn)生的各種離子碎片分析）和根據(jù)已知的大量化合物質(zhì)譜圖的信息，來了解試樣分子的結(jié)構(gòu)、組成及其分解歷程。質(zhì)譜分析是解決核酸一級結(jié)構(gòu)測定的最有利手段之一，包括分子量測定、核酸的序列分析； 同時利用質(zhì)譜測定寡糖和多糖的結(jié)構(gòu)。 利用質(zhì)譜可以測定寡糖鏈和多肽鏈的序列液質(zhì)聯(lián)用（HLPC-MS）：以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。蛋白質(zhì)樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖、通過質(zhì)譜圖進一步分析鑒定。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復雜樣品

14、的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜有哪些主要特點高效液相色譜有三高一廣一快的特點： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。2高效，分離效能高，可選擇固定相和流動相分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。3：靈敏度高，紫外檢測器可達0.001ng,進樣兩在uL級。4、應(yīng)用范圍廣，百分之七十的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、極性強的化合物的分

15、離和分析。5：分析速度快、載液流速快：比經(jīng)典液體色譜法速度快很多，通常分析樣品在1530分鐘之內(nèi)。怎樣進行蛋白質(zhì)和多肽(du ti)的氨基酸序列測定策略(cl)： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 測定蛋白質(zhì)分子(fnz)中多肽鏈的數(shù)目，根據(jù)蛋白質(zhì)N端或C端的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可以確定蛋白質(zhì)分子中的多肽數(shù)目。2、 如果蛋白質(zhì)是由一條以上多肽鏈構(gòu)成，則需要拆分多肽鏈，常用尿素等變性劑。3斷開多肽鏈的二硫鍵。4、分析每一條多肽鏈的氨基酸組成，經(jīng)分離純化的多肽鏈的部分樣品進行完全水解，測定氨基酸組成，計算出氨基酸的分子比和數(shù)目。5、鑒定多肽鏈的N端C端。6、裂解多肽鏈成較小的

16、片段。7、測定各肽段的氨基酸序列8、利用多套多肽段的氨基酸序列彼此間的交錯重疊拼湊出原來完整的氨基酸序列。肽段氨基酸序列測定的方法：Edman化學降解法：又稱為苯異硫氰酸酯（PITC）法，反應(yīng)時，PITC與多肽鏈末端游離氨基作用，每次從多肽鏈氨基端切下一個氨基酸，切下的氨基酸可以被氨基酸分析儀檢測出來。這樣每進行一輪反應(yīng)就可以測定一個氨基酸序列。酶降解法：有一種肽鏈外切酶或稱外肽酶，例如氨肽酶和羧肽酶，它們分別從肽鏈的N端和C端逐個向里切，因此，只要跟隨酶水解的過程分別測量釋放出來的氨基酸，就能測定氨基酸序列。質(zhì)譜法：多肽鏈被處理成帶有不同質(zhì)荷比的分子碎片，經(jīng)過質(zhì)譜儀檢測器，獲得質(zhì)樸圖，通過對

17、質(zhì)譜的分析 就能得到多肽鏈N段或C端的氨基酸序列，但是僅能測定較短的序列，長度不超過15個氨基酸殘基。根據(jù)核苷酸序列的推定法通常首先測定多肽鏈N端或c端的一小段氨基酸序列（例如：質(zhì)譜） ，根據(jù)這個序列設(shè)計PCR引物，通過PCR獲得多肽鏈對應(yīng)的核苷酸序列，再根據(jù)密碼子就可以推導出對應(yīng)多肽鏈氨基酸序列 ?；蚪M文庫和cDNA文庫的構(gòu)建各有哪些基本步驟基因組文庫的構(gòu)建 （1）細胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備； （2）載體DNA的制備；（3）載體與外源大片段連接；（4）體外包裝及基因組DNA文庫的擴增；（5）重組DNA的篩選和鑒定。 構(gòu)建cDNA文庫通常包括 1）mRNA的提取及其完整性的確

18、定； 2）cDNA的合成和克?。?（1）cDNA第一鏈的合成 （2）雙鏈cDNA的合成 （3）cDNA基因與載體的重組 （4）轉(zhuǎn)化 （5）目的cDNA克隆的鑒定 （6）特定cDNA的克隆 目的cDNA的鑒定等步驟。簡述基因芯片操作流程制作芯片、合成探針、雜交、結(jié)果掃描、分析數(shù)據(jù) 1）DNA微陣列的制備 靶DNA的制備和純化：以cDNA文庫克隆作為靶DNA. 點樣：選用(xunyng)Corning GAPS玻片（用-amino saline包被(bo bi)）,自動點樣儀點樣 點樣后處理：玻片置于下紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)（ 70 mj ），80下烘烤(hn ko)2-4h 2）探針的制備和純化：提取

19、兩個不同基因品系中的mRNA，用氨基酸修飾的dUTP合成cDNA,分別用Cy3和Cy5標記3）預雜交：制備預雜交溶液4）雜交：制備雜交緩沖液；探針變性；探針與芯片雜交5）雜交后處理：洗去未結(jié)合的探針6）掃描、數(shù)據(jù)讀取和分析：將玻片置于激光共聚焦掃描顯微鏡（掃描儀）中進行掃描，應(yīng)用數(shù)據(jù)讀取和分析軟件進行分析。 酵母雙雜交技術(shù)具有哪些用途1、檢驗對功能已知蛋白間的相互作用 優(yōu)點快速和高靈敏度，且反映了蛋白在體內(nèi)的相互作用；還能檢測出瞬間發(fā)生的信號反應(yīng)，而用體外檢測法檢測蛋白要經(jīng)過一系列洗滌過程，常致使相互作用不再發(fā)生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而變得更加穩(wěn)定。并且雜合蛋白一般都是由高拷

20、貝質(zhì)粒的強啟動子過量表達的蛋白，在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生了一些復合酶使信號得以放大。 2、研究一對蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域 可應(yīng)用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測定了多種重要的結(jié)構(gòu)域，當證實了兩個蛋白有相互作用后，可以對其進行缺失實驗而找到相互作用發(fā)生所必須的氨基酸殘基。通過該方法還能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。通常需要對待測蛋白做點突變或缺失突變的處理。3、發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì) 用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白，是雙雜交系統(tǒng)最廣泛和最有價值的應(yīng)用。4、尋找具有藥物治療作用的小分子多肽 通過雙雜交系統(tǒng)篩選和目標蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是藥物設(shè)計的目標，則有可能得到一些具有藥物治療作用的小分子多肽藥物。 5、分析新基因的生物學功能 即以功能未知的新基因蛋白克隆在BD載體上，而把將要篩選的cDNA文庫克隆在AD載體上，利用雙雜交技術(shù)可以找到一個新的結(jié)合蛋白，這個結(jié)合蛋白可能是已知基因也可能是未知基因所編碼，然后根據(jù)調(diào)到的已知基因的功能推測該新基因的功能。