重組DNA技術(shù)基礎(chǔ)1ppt課件

1、與基因工程學(xué)科建立相關(guān)的1、4個(gè)里程碑事件：2、3大技術(shù)發(fā)現(xiàn)/發(fā)明：第二章重組技術(shù)根底DNA組成與構(gòu)造一級(jí)構(gòu)造 堿基的陳列順序二級(jí)構(gòu)造 DNA的雙螺旋方式高級(jí)構(gòu)造 DNA的超螺旋方式核酸 分子組成DNA的分子構(gòu)造一核酸的分類 90%以上分布于細(xì)胞核，其他分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫氧核糖核酸 核糖核酸攜帶遺傳信息，決議細(xì)胞和個(gè)體的基因型(genotype)。參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。.戊 糖構(gòu)成RNA12345-D-呋喃核

2、糖(ribose)構(gòu)成DNA-D-2-脫氧呋喃核糖 (deoxyribose)2. 堿 基嘌呤(purine) 嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶(thymine, T)腺嘌呤(adenine, A)鳥嘌呤(guanine, G)核苷：AR, GR, UR, CR脫氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR3. 核苷(ribonucleoside)堿基核糖脫氧核糖 銜接方式：CN 糖苷鍵堿基9 /1位 戊糖1，位 11核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP . 核苷酸(

3、ribonucleotide)核苷脫氧核苷磷酸磷酸酯鍵5端3端. 核苷酸的銜接 ，磷酸二酯鍵CGA二、核酸的一級(jí)構(gòu)造定義： 核酸中核苷酸的陳列順序堿基序列。5端3端CGAA G P5 P T PG PC PT P OH 3 書寫方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3豎式橫式簡化式DNA的空間構(gòu)造一、DNA的二級(jí)構(gòu)造一雙螺旋構(gòu)造DNA雙螺旋構(gòu)造模型要點(diǎn) Watson, Crick, 1953兩條DNA單鏈分子反向平行環(huán)繞，右手螺旋走向，外表大溝與小溝相間。螺旋直徑為2nm， 主鏈：戊糖 磷酸骨架位于外側(cè) 側(cè)鏈：堿基對(duì)位于內(nèi)側(cè)堿基平面垂直于螺旋軸 堿基距：0.3

4、4nm； 螺距： 3.4nm； 周長：1 0對(duì)堿基。堿基構(gòu)成氫鍵配對(duì)，配對(duì)方式為：A=T; GC 。堿基互補(bǔ)配對(duì) TACG穩(wěn)定要素：1.氫鍵維持橫向穩(wěn)定性，2.堿基堆積力維持縱向穩(wěn)定性。3.介質(zhì)中陽離子可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力 二與DNA堿基順序相關(guān)的特殊構(gòu)造 堿基順序顛倒反復(fù)而具有2倍對(duì)稱的DNA段落 鏡像反復(fù)序列 tsDNA是在DNA雙螺旋構(gòu)造的根底上構(gòu)成的，三條鏈均為同型嘌呤homopurine，Hpu或同型嘧啶homopyrimidine，Hpy，即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。三三股螺旋DNAtsDNA,也稱H-DNA Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中穩(wěn)定，較多見 (四) 酶

5、活性DNA1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)了具有酶活性的DNA，再次豐富了酶學(xué)。 Cuenoud根據(jù)共有序列設(shè)計(jì)并合成了由47個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA-E47，以此銜接兩個(gè)底物DNAS1和S2 二、DNA的超螺旋構(gòu)造及其在染色質(zhì)中的組裝一DNA的超螺旋構(gòu)造超螺旋構(gòu)造(superhelix 或supercoil)DNA雙螺旋鏈再環(huán)繞即構(gòu)成超螺旋構(gòu)造。 正超螺旋(positive supercoil)環(huán)繞方向與DNA雙螺旋方同一樣 負(fù)超螺旋(negative supercoil)環(huán)繞方向與DNA雙螺旋方向相反 意義DNA超螺旋構(gòu)造整體或部分的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作

6、用。 二原核生物DNA的高級(jí)構(gòu)造三DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其根本單位是 核小體(nucleosome)。 DNA：約200bp 組蛋白：H1 , H2A, H2B, H3, H4核小體的化學(xué)組成RNA的構(gòu)造Structure of RNARNA的種類、分布、功能mRNArRNAtRNA一 、mRNA的構(gòu)造與功能hnRNA 內(nèi)含子(intron)mRNA 外顯子(exon)* 真核細(xì)胞mRNA構(gòu)造特點(diǎn)5末端有甲基化鳥苷帽子構(gòu)造：m7GpppNm- 2. 3末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子構(gòu)造促進(jìn)mRNA由胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位維持mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始

7、的調(diào)控 帽子構(gòu)造和多聚A尾的功能* mRNA的功能 把DNA的堿基序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸順序。DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細(xì)胞 * tRNA的一級(jí)構(gòu)造特點(diǎn) 含 1020% 稀有堿基，如 DHU 3末端為 CCA-OH 5末端大多數(shù)為G 具有 TC 二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的構(gòu)造與功能* tRNA的二級(jí)構(gòu)造三葉草形 氨基酸臂 DHU環(huán) 反密碼環(huán) 額外環(huán) TC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)* tRNA的三級(jí)構(gòu)造 倒L形* tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。* rRNA的構(gòu)造三、rRNA的構(gòu)造與功能* rRNA的

8、功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。 rRNA的種類真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNAS沉降系數(shù)：單位時(shí)間內(nèi)的沉降速度核 酸 的 理 化 性 質(zhì)The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid1. 核酸的溶解度核酸是極性分子，微溶于水，不溶于乙醇或異丙醇。DNA+蛋白質(zhì)脫氧核糖核蛋白DNP： 在1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白質(zhì)核糖核蛋白R(shí)NP：在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。一、核酸的普通理

9、化性質(zhì) 核酸屬于兩性電解質(zhì)，但由于磷酸的酸性較強(qiáng)，因此總體呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性。具有較低的等電點(diǎn)。當(dāng)溶液的pH4時(shí)，呈多負(fù)離子形狀，容易與金屬離子結(jié)合構(gòu)成鹽。2. 酸堿性3. 核酸的高分子性質(zhì)粘度： DNARNA dsDNA ssDNA4. 核酸的紫外吸收(OD260)單核苷酸 ssDNA(或RNA) dsDNA5.核酸的化學(xué)性質(zhì) 核酸中的嘌呤和嘧啶能進(jìn)展脫氨、聚合、烷基化等反響等。脫氨：CU脫氨：CUATCGAATTGCATUGAATTAC千萬年后，GC 將不復(fù)存在 聚合 紫外光誘導(dǎo)兩個(gè)相鄰嘧啶之間構(gòu)成二聚體二、DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化要素作用下，DNA雙鏈解開成兩

10、條單鏈的過程。方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性量變化：OD260增高粘度下降浮力密度升高 酸堿滴定曲線改動(dòng)生物活性喪失DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改動(dòng)DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的景象。熱變性解鏈曲線：假設(shè)在延續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對(duì)A260absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。 Tm：DNA變性時(shí)紫外光吸收值到達(dá)最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(melting temperature

11、, Tm)。影響Tm的要素： 1. G+C含量: G+C越高，Tm 越高 2. DNA樣品均一性： 均一的DNA樣品，Tm范圍較狹窄。 3.核酸的種類： 雙鏈RNA RNA-DNA雜交鏈 DNA雙鏈 4.溶液的離子強(qiáng)度 ： 離子強(qiáng)度高，Tm值高 。三、DNA的復(fù)性與分子雜交 DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一景象稱為復(fù)性。減色效應(yīng) DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低的景象。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing) 。不同來源的核酸鏈分子復(fù)性時(shí)構(gòu)成雜化雙鏈過程叫分子雜交。這種雜化雙鏈可以在

12、不同的DNA與DNA之間構(gòu)成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間構(gòu)成。這種景象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization) 核酸分子雜交的運(yùn)用研討DNA分子中某一種基因的位置確定兩種核酸分子間的序列類似性檢測(cè)某些專注序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的根底 核 酸 酶 核酸酶是指一切可以水解核酸的酶核酸酶的分類根據(jù)底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)：專注降解DNA。RNA酶 (ribonuclease, RNase)：專注降解RNA。根據(jù)切割部位不同核酸內(nèi)切酶：分為限制性核酸內(nèi)切酶和非特異性限制性核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。參與DNA的合成與修復(fù)、RNA合成后的剪接等重要基因復(fù)制和基因表達(dá)