神經(jīng)生物學(xué)的常用研究方法ppt課件

1、五、神經(jīng)生物學(xué)常用的研究方法（一）形態(tài)學(xué)方法（二）生理藥理學(xué)方法（三）生物化學(xué)方法（四）電生理學(xué)方法 （五） 分子生物學(xué)方法 （六）腦成像（Brain imaging）技術(shù) .（一）形態(tài)學(xué)方法1、束路追蹤法2、免疫組織化學(xué)法3、原位雜交法4、受體定位法.束路追蹤法 研究神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的一個基本問題，其研究方法主要有三：（1）利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象的追蹤法，是目前應(yīng)用最廣者；（2）利用神經(jīng)元胞體受損或軸突離斷后遠(yuǎn)側(cè)軸突的變性，或軸突切斷后胞體的反應(yīng)特性的變性追蹤法；（3）利用某些熒光染料在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜擴(kuò)散的神經(jīng)元質(zhì)膜熒光追蹤法。.（1）軸漿運(yùn)輸追蹤法 軸漿運(yùn)輸：神經(jīng)元有長

2、短不等的軸突，由于軸突內(nèi)缺乏參與蛋白質(zhì)合成的核糖體，所以需要從細(xì)胞體不斷地將各種成分運(yùn)輸至軸突及其分支以維持其代謝；在神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽及合成經(jīng)典遞質(zhì)的酶也需在胞體合成；從末梢也有影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)如神經(jīng)營養(yǎng)因子等逆向傳送至胞體。不同物質(zhì)的運(yùn)輸速度不同。順行運(yùn)輸：從胞體向軸突及其終末的運(yùn)輸。逆行運(yùn)輸：從軸突及其終末向胞體的運(yùn)輸。.常用方法：a 辣根過氧化物酶追蹤法 1971年，Kristenson和Olsson首先報(bào)道辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體，然后用組織化學(xué)方法即可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而創(chuàng)建了HRP追

3、蹤神經(jīng)元示蹤技術(shù)，即HRP法。 HRP即可作逆行追蹤劑使用，也可作順行追蹤劑使用。 基本步驟： 將HRP注射至實(shí)驗(yàn)動物中樞核團(tuán)或周圍器官、神經(jīng)的一定部位；存活一定時間后灌注、固定動物，取材作冰凍切片；然后用雙氧水（H2O2）及呈色劑四甲基聯(lián)苯胺（TMD）或二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯示HRP反應(yīng)產(chǎn)物。 .將HRP注射于周圍神經(jīng)感覺末梢或神經(jīng)干逆向標(biāo)記背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞后，HRP還可進(jìn)一步沿背根節(jié)細(xì)胞的中樞突順向標(biāo)記其在脊髓的中樞終止部位，稱作跨節(jié)標(biāo)記。.HRP：1.游離HRP： 通過非特異性整體胞飲的方式被攝入 2.結(jié)合HRP：通過與細(xì)胞膜的特異性受體結(jié)合的介導(dǎo)進(jìn)入神經(jīng)元 麥芽凝集素（WGA）-HRP

4、 霍亂毒素（CT）-HRP 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，用量較少， HRP在胞內(nèi)降解時間明顯延長，能清晰地顯示包括細(xì)微分支在內(nèi)的整個神經(jīng)元的全貌。 注意：因?yàn)镠RP到達(dá)預(yù)定部位的時間取決于運(yùn)輸速度和距離，運(yùn)輸速度因動物及纖維種類而異。同時HRP被運(yùn)至胞體后即被送入溶酶體內(nèi)水解。因此在聚集和降解兩個相反的過程中求得最佳存活期必須具體測試。呈色劑： 1.二氨基聯(lián)苯胺(DAB): DAB作為供氫體，HRP在H2O2存在的情況下，能使DAB發(fā)生氧化，生成不溶性棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，定位在抗原所在處。 2.二鹽酸聯(lián)苯胺(BDHC) 3.鄰-聯(lián)茴香胺(OD) 4.四甲基聯(lián)苯胺(TMB)用途： 研究臟器的神經(jīng)支配、中樞內(nèi)

5、核團(tuán)間的聯(lián)系等。還可與免疫組織化學(xué)、電鏡技術(shù)等結(jié)合。.HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat 10 40.HRP labelling neurons in dLGN40.b 熒光素追蹤法-主要作逆向追蹤 1977年，荷蘭著名神經(jīng)解剖學(xué)家Kuypers及其同事首先發(fā)現(xiàn)部分熒光化合物可被神經(jīng)纖維的末梢攝取，并通過軸漿流逆行運(yùn)輸?shù)礁髯缘纳窠?jīng)元胞體，切片后在熒光顯微鏡下可直接觀察到這些胞體的定位，從而建立了研究神經(jīng)纖維聯(lián)系的熒光素逆行追蹤法。 原 理： 將熒光物質(zhì)注射至神經(jīng)元的軸突分布區(qū), 經(jīng)分支的末梢吸收后，循軸突逆行輸送至胞體。在熒光顯

6、微鏡 下可看到胞體內(nèi)呈現(xiàn)熒光標(biāo)記物。 .熒光素追蹤劑是一種暴露在一定激發(fā)波長光照下，以一定發(fā)射波長發(fā)出一定顏色熒光的化合物。每一種熒光素都有各自的激發(fā)波長和發(fā)射波長，不同的發(fā)射波長決定了這些熒光素發(fā)出的熒光顏色各異。不同熒光素在神經(jīng)元內(nèi)的標(biāo)記特征不同： 絕大多數(shù)標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)，如熒光金（Furogold，靈敏度高，能較好顯示樹突分支，只標(biāo)記胞漿；在胞體內(nèi)分解慢，甚至在注射后存活2個月標(biāo)記強(qiáng)度仍無明顯變化；比較耐紫外線的照射，褪色比較緩慢；可以經(jīng)受許多組織學(xué)染色處理，因而可以和HRP、免疫組織化學(xué)等結(jié)合使用），fast bule（固藍(lán)）等。 只有少數(shù)僅標(biāo)記細(xì)胞核，如nuclear yellow（核黃

7、 ）, diamidino yellow（雙脒基黃）等。. Fast blue labelling neuronsDRGSpinal cord2020.Fast Blue LadellingGanglion Cells of Retina 20.優(yōu)點(diǎn)：可靠性，靈敏性， 利用其不同顏色可同時追蹤和顯示多重神經(jīng)聯(lián)系。因此可選擇一種或兩種以上的熒光素分別對神經(jīng)元進(jìn)行單標(biāo)、雙標(biāo)或多重標(biāo)記。 雙重標(biāo)記和多重標(biāo)記可用來研究神經(jīng)元軸突的分支投射。若在腦內(nèi)不同核團(tuán)或區(qū)域分別注射兩種（或三種）不同熒光，在同一神經(jīng)元胞體內(nèi)能觀察到兩種（或三種）不同顏色的熒光，即說明該神經(jīng)元的軸突分支分別投射到注射這些熒光劑的兩個

8、（或三個）腦內(nèi)不同核團(tuán)或區(qū)域。 需要注意的是各種熒光素逆行運(yùn)輸?shù)乃俣炔煌?，所以動物存活時間也有差異。雙重標(biāo)記是，有時需要做兩次手術(shù)先注射運(yùn)輸慢的熒光素，過一定的時間后，再注射運(yùn)輸較快的熒光素。缺 點(diǎn)：激發(fā)光照射下很快褪滅，因此允許觀察的時間較短，保存時間也有限。應(yīng) 用：研究神經(jīng)元的軸突分支至不同部位的投射?？膳c免疫組織化學(xué)結(jié)合，研究投射神經(jīng)元的化學(xué)性質(zhì)。.（2）變性束路追蹤法 利用神經(jīng)元的軸突被損傷之后，在損傷的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端分別發(fā)生逆行和順行潰變；神經(jīng)元胞體受損后，其發(fā)出的軸突從胞體向終末方向的遠(yuǎn)側(cè)端發(fā)生順行潰變，來研究纖維的聯(lián)系。.損傷手段：物理性方法 銳器的切割、電凝、電離破壞、超聲破壞

9、等 特點(diǎn)：無選擇性，除了損傷神經(jīng)元和發(fā)出的纖維以外，也能破壞通過此損傷部位的纖維，導(dǎo)致非特異性標(biāo)記?；瘜W(xué)性破壞 單胺類神經(jīng)毒劑：6-羥多巴胺（可選擇性被兒茶酚胺類神經(jīng)元攝入，經(jīng)過自氧化形成若干具有細(xì)胞毒性的產(chǎn)物。由于整個神經(jīng)元的細(xì)胞膜均可攝入6-羥多巴胺，故兒茶酚胺類神經(jīng)元的任何部位都可被6-羥多巴胺破壞。不易通過血腦屏障，因此如欲造成中樞性破壞，需做腦室或腦內(nèi)注射）、6-羥多巴、5,6-雙羥色胺和5,7-雙羥色胺（選擇性破壞5-羥色胺能神經(jīng)元） 膽堿類神經(jīng)毒劑：乙基膽堿氮芥丙啶正離子 興奮性氨基酸：海人酸和鵝高蕈氨酸（能夠非選擇性損傷神經(jīng)元的胞體，而不損傷軸突，故無過路纖維受損問題）.研究方

10、法： 20世紀(jì)從40年代，鍍銀染色法，根據(jù)銀染潰變纖維的形態(tài)變化來判斷、追蹤潰變纖維的方法。 20世紀(jì)從50年代，Nauta法，一種改進(jìn)的潰變鍍銀法，能抑制正常纖維的染色而僅染出潰變纖維。 20世紀(jì)70年代，變性束路追蹤法逐漸被軸漿運(yùn)輸追蹤法所代替。可與逆行標(biāo)記法、順行標(biāo)記法、免疫組織化學(xué)、原位雜交等技術(shù)結(jié)合運(yùn)用。.（3）神經(jīng)元質(zhì)膜熒光染色法這類染料是利用它們能溶于細(xì)胞膜脂層內(nèi)并在膜內(nèi)擴(kuò)散的特點(diǎn)?？捎迷诨铙w或固定的標(biāo)本上追蹤纖維聯(lián)系。這類染料中DiI、DiA和DiO最常用。主要優(yōu)點(diǎn)是可用于固定標(biāo)本，一些難以在活體注射的小核團(tuán)在固定標(biāo)本上常比較容易做到。缺點(diǎn)是其在膜內(nèi)擴(kuò)散的速度很慢，而且有效距離

11、比較短，因此最適用于胚胎或小動物。.免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)法 20世紀(jì)70年代，免疫組織化學(xué)技術(shù)被引入腦研究領(lǐng)域，它以特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，使神經(jīng)元內(nèi)所含的神經(jīng)活性物質(zhì)、受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體可視化，給形態(tài)學(xué)研究開辟了新的途徑。.基本原理 利用免疫學(xué)中抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)以及組織化學(xué)的原理，在組織或細(xì)胞標(biāo)本中加入特定的標(biāo)記抗體，然后對標(biāo)記物進(jìn)行顯示，從而對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進(jìn)行定性、定位或定量研究。免疫酶技術(shù)顯示Caspase-3免疫熒光技術(shù)顯示MOR.因?yàn)榭乖c抗體的結(jié)合是高度特異的，所以免疫組織化學(xué)方法具有高度的特異性、靈敏性和精確性。免疫組織化學(xué)的抗原通常是肽或蛋白，有數(shù)量不等的抗原決

12、定簇。抗原決定簇由暴露于抗原表面、在空間上相鄰的3-8個氨基酸組成。一個抗原上可以有多個抗原決定簇。故由此而產(chǎn)生的抗血清中可能含有針對不同決定簇的多克隆抗體。用雜交瘤技術(shù)可以制成針對單個決定簇的單克隆抗體?？贵w僅識別特定的抗原決定簇，而不識別抗原本身，因此不同物質(zhì)只要有相同的抗原決定簇，均可被同一抗體識別，所以在免疫組織化學(xué)法中應(yīng)注意抗體的特異性及交叉反應(yīng)。. 抗體（antibody, Ab）機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B 細(xì)胞漿細(xì)胞合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由兩條相同的重鏈（heav

13、y chain, H）和兩條相同的輕鏈（light chain, L）借二硫鍵連接而成。在氨基端，重鏈的1/4和輕鏈的1/2氨基酸序列變化很大，為可變區(qū)（variable region, V）；其他部分氨基酸序列相對恒定，為恒定區(qū)（constant region, C）。.Fab即抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding），由一條完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1）組成。該片段具有單價(jià)抗體活性，能與一個相應(yīng)的抗原決定族特異性結(jié)合。Fc即可結(jié)晶片段（fragment crystalline），F(xiàn)c段含有兩條重鏈C端的一半，包含CH2和CH3兩個功能區(qū)，它無抗體活性。Ig在異

14、種間免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同時Fc段還具有活化補(bǔ)體、親細(xì)胞、通過胎盤和介導(dǎo)與細(xì)菌蛋白結(jié)合等生物學(xué)活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可將其裂解為兩個完全相同的Fab和一個Fc片段。 . 多克隆抗體（polyclonal antibody, PcAb） 大多數(shù)天然抗原物質(zhì)(如細(xì)菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體。多克隆抗體是多個抗原決定簇刺激機(jī)體后，由多個免疫淋巴細(xì)胞分泌的多種抗體的混合物。 PcAb 特異性差，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。.由單一克隆B細(xì)胞雜交骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，只識別一種抗原表位的具有高度特異性的抗體。

15、優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、易大量制備。制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得針對單一表位的漿細(xì)胞克隆，使其在體外擴(kuò)增并分泌抗體。但漿細(xì)胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。于是，將可產(chǎn)生特異性抗體但短壽的漿細(xì)胞與無抗原特異性但長壽的惡性漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，建立了可產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)。 單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）. 組織（細(xì)胞）化學(xué)是介于細(xì)胞學(xué)與化學(xué)之間的一門科學(xué)。細(xì)胞化學(xué)的目的是使用細(xì)胞學(xué)和化學(xué)的方法使細(xì)胞（組織）內(nèi)的某些化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)，在局部形成有色反應(yīng)物，藉此對各種活性物質(zhì)在顯微鏡水平進(jìn)行定性、定位和定量分析。 酶組織

16、化學(xué)：利用酶對底物的催化作用，使底物發(fā)生顏色變化，其次對該酶進(jìn)行定位、定量分析。. 在應(yīng)用組織化學(xué)技術(shù)顯示組織和細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)及定位和定量以及代謝狀態(tài)時，需要滿足以下要求：保持組織和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的良好狀態(tài)，以便反應(yīng)產(chǎn)物的定位精確。如果形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞而失真，則定位困難。具備一定的特異性，以便獲取正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具備一定的靈敏性，以便含量極微的物質(zhì)也能被顯示出來。 生成的反應(yīng)產(chǎn)物必須是有色沉淀，顆粒微細(xì)不溶，定位于原位。反應(yīng)物沉淀的顏色深度與相應(yīng)物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的量效關(guān)系。反應(yīng)產(chǎn)物具有穩(wěn)定性，以便于重復(fù)觀察要有重復(fù)性。 選擇的試劑必須是分析純，對被檢測物質(zhì)或酶應(yīng)無任何影響；實(shí)驗(yàn)所用器皿必須

17、清潔無污染雜質(zhì)，使用的蒸餾水應(yīng)為雙蒸水。為了保證實(shí)驗(yàn)的可靠性、科學(xué)性，防止假陽性的發(fā)生，必須同時作對照實(shí)驗(yàn)。.免疫組織化學(xué)的技術(shù)分類 根據(jù)AgAb結(jié)合方式分成： 直接法 間接法 多層法 根據(jù)染色方式分成： 貼片染色 漂浮染色.按標(biāo)記物的性質(zhì)分成：免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)抗體法、橋法、PAD法、 ABC法）免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）標(biāo)記物必要性：組織細(xì)胞內(nèi)AgAb結(jié)合反應(yīng)一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標(biāo)記物。所以需要用標(biāo)記的方法將某種標(biāo)記物（如酶、熒光素）結(jié)合到抗體上，再用組織化學(xué)方法顯示此標(biāo)記物或在熒光顯微鏡下觀察熒光素發(fā)出的熒光。

18、.常用標(biāo)記物 熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） 熒光顯微鏡下呈綠色熒光；Texas red 熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光 酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。 生物素：Biotin 鐵蛋白金等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。 其他：如同位素（因涉及污染和防護(hù)難一般不用）.應(yīng) 用 凡是組織細(xì)胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示，因而目前在基礎(chǔ)與臨床科研中被廣泛應(yīng)用。最近幾年，分子生物學(xué)研究異常活躍，但最終還要?dú)w到形態(tài)上來。用免疫組織化學(xué)方法對所研究的大分子分子進(jìn)行定位，進(jìn)而深入研究其

19、功能。.免疫組織化學(xué)染色的基本過程固定：由于在進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)時，蛋白質(zhì)或肽類在體內(nèi)易分解，并從活體存在的部位流失，而必須盡可能在接近活體的狀態(tài)下，在盡可能短的時間內(nèi)用固定劑將之交聯(lián)起來，在原位固定那些物質(zhì)。常用的固定液包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。制片：切片（冰凍切片對抗原保存性好，石蠟切片，樹脂切片，震動切片）、鋪片（視網(wǎng)膜）、細(xì)胞爬片反應(yīng).固定方法：推注，滴注滴注步驟： 1、開胸 2、暴露心臟 3、自心尖剪開左心室 4、插入灌流針至主動脈弓 5、固定灌流針 6、快速注入沖洗液（有時可免） 7、先快后慢注入固定液 8、慢注畢，將動物裝入含 有少量固定液的塑料袋 置4C冰箱內(nèi)靜置2h后取

20、材.染色方法ABC法PAP法.熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)酶聯(lián)免疫組織化學(xué).1、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法（1）直接法 熒光素直接標(biāo)記在特異性第一抗體上，熒光素標(biāo)記的抗體直接與組織切片上相應(yīng)的抗原結(jié)合，一次孵育成功，在熒光顯微鏡下觀察檢測抗原。 優(yōu)點(diǎn)：簡單，時間短，特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟(jì)）。應(yīng)用：基本不用了.（2）間接法 先用第一抗體孵育組織切片，在第一抗體與組織中的抗原結(jié)合后，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體孵育，第二抗體是抗產(chǎn)生第一抗體的動物（如兔、羊、小鼠等）的IgG的抗體。通過上述步驟用熒光素標(biāo)記的第二抗體與第一抗體結(jié)合的方法來間接顯示抗原所在的部位。 優(yōu)點(diǎn)：較直接法靈敏，而且只

21、需標(biāo)記一種抗IgG抗體即可鑒定多種抗原。.免疫熒光雙標(biāo)記法（1）直接法甲熒光標(biāo)記的抗甲抗原抗體乙熒光標(biāo)記的抗乙抗原抗體甲抗原乙抗原.（2）間接法甲抗原乙抗原抗甲抗原抗體抗乙抗原抗體乙熒光標(biāo)記的第二抗體（二抗）甲熒光標(biāo)記的第二抗體（二抗）. 兩種第一抗體需來自不同種屬的動物。將兩種第一抗體混合后與組織孵育，然后用不同熒光素（如FITC和Texas Red）標(biāo)記的二抗混合孵育，各自與其一抗結(jié)合。兩種熒光素在熒光顯微鏡下發(fā)出不同熒光，可以更換濾色片系統(tǒng)分別進(jìn)行觀察。.免疫熒光雙標(biāo)記法的應(yīng)用：1.將兩種抗體分別用不同的熒光素加以標(biāo)記，用來顯示含有不同成分的兩種細(xì)胞在同一區(qū)域的定位模式激光掃描共聚焦顯微

22、鏡觀察.免疫熒光雙標(biāo)記法的應(yīng)用：2. 將兩種抗體分別用不同的熒光素加以標(biāo)記，用來定位同一細(xì)胞內(nèi)存在的兩種不同成分.2、免疫酶組織化學(xué)染色方法 用酶標(biāo)記抗體和用組織化學(xué)方法顯示結(jié)果，間接的對抗原物質(zhì)進(jìn)行定位。酶類標(biāo)記物滿足的條件：酶催化底物必須是特異的，并容易被顯示（產(chǎn)物易于鏡下觀察）；酶反應(yīng)形成的終產(chǎn)物必須是穩(wěn)定的沉淀，不能從酶活性部位向周圍組織彌散；容易獲取（純）；中性pH值時，具有穩(wěn)定性；酶標(biāo)記至抗體上不影響酶和抗體的活性。 .常用酶類標(biāo)記物辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP），H2O2和DAB（diaminobenzidine, 二氨基聯(lián)苯胺）為其常用

23、底物，產(chǎn)物為穩(wěn)定的棕黃色沉淀.堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）：BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽) 和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四氮唑藍(lán)）是AP的常用底物組合，其中，NBT作為氧化劑, BCIP作為AP底物。BCIPBCIP被AP水解成一種藍(lán)色的中間物，后者然后被NBT氧化形成二聚體（不溶性紫藍(lán)色沉淀）。.（1）PAP法 過氧化物酶抗過氧化物酶（Peroxidase anti-peroxidase method, PAP）法PAP作為特異性顯色基團(tuán)。

24、每個PAP復(fù)合物含個抗HRP的IgG分子及個HRP分子。DAB作為供氫體，HRP在H2O2存在的情況下，能使DAB發(fā)生氧化，生成不溶性棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，定位在抗原所在處。首先，特異性第一抗體（多為兔、羊或小鼠IgG）孵育組織切片。其次用抗第一抗體的抗體（如羊抗兔IgG 或驢抗小鼠IgG ）作橋接。然后用PAP復(fù)合物與橋抗體結(jié)合。最后，用HRP的底物來顯示PAP復(fù)合物。.優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，所用第一抗體的濃度可低于間接熒光法倍左右，并可長期保存。注意：橋抗體IgG分子有兩個Fab段，一個與第一抗體結(jié)合，另一個與PAP復(fù)合物結(jié)合。橋抗體的兩個Fab段是相同的，因此第一抗體及PAP復(fù)合物中的抗HRP抗

25、體必須來自同一種動物。.（2）ABC法卵白素-生物素- HRP復(fù)合物染色法（Avidinbiotinylated horeseradish peroxidase complex method，ABC法） Avidin：卵白素，一種糖蛋白，每個分子上有4個與生物素親和力極高的結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合4個生物素。Biotin ：生物素，為一小分子維生素，易于很多生物分子交聯(lián)。ABC是卵白素-生物素結(jié)合的 HRP復(fù)合物的簡稱，每一個卵白素分子上結(jié)合個帶HRP 的生物素，留出一個能與其他生物素結(jié)合的空位。ABC復(fù)合物HRP卵白素生物素.ABC法是在第一抗體反應(yīng)后，用生物素結(jié)合的IgG抗體（ biotinyl

26、ated IgG）橋接。然后用ABC孵育，使橋抗上的生物素與ABC中卵白素上的空位結(jié)合。最后仍用HRP的底物呈色。B-IgGABCHRP卵白素生物素優(yōu)點(diǎn)：由于生物素與卵白素間的親和力極強(qiáng)，故ABC法比PAP法靈敏度更高。操作時間短，可長期保存。注意： ABC復(fù)合物與橋抗體之間是通過生物素結(jié)合的，因此ABC復(fù)合物沒有種屬特異性，可適合于任何種類的第一抗體。當(dāng)然生物素結(jié)合的第二抗體必須是針對第一抗體屬性的。.熒光顯微鏡在照明系統(tǒng)的光源中使用高壓汞燈提供全波段激發(fā)光為延長汞燈壽命，打開后不可立即關(guān)閉（至少15min），以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極；汞燈關(guān)閉后則不可馬上打開（至少30min），否則燈內(nèi)

27、汞蒸汽尚未恢復(fù)液態(tài)，內(nèi)阻極小，再次施加電壓會引起短路，導(dǎo)致汞燈爆炸。.激光共聚焦顯微鏡用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時成像的物點(diǎn)。分辨率，是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用于觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測量。./hbchendl/article/i5275.htm.免疫組織化學(xué)染色的對照實(shí)驗(yàn)陽性對照，用已經(jīng)證實(shí)的含有靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果應(yīng)為陽性，稱陽性對照。證明靶抗原有活性，抗體的特異性高，染色過程中各個步驟以及所使用的試劑都合乎標(biāo)準(zhǔn)，染色方法

28、可靠。陰性對照，用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，結(jié)果應(yīng)為陰性?？膳懦旧^程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的假陽性結(jié)果。 常用空白試驗(yàn)：即用稀釋一抗的稀釋液， 如10% NSS等，或 PBS替代一抗，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；檢查顯示系統(tǒng)本身能否使組織染色。 替代試驗(yàn)：正常兔血清或 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；吸附實(shí)驗(yàn)：先將抗體與過量的與其針對的抗原（通常用10-6M）混合孵育，兩者形成特異性結(jié)合，再用結(jié)合后的混合物孵育切片，染色結(jié)果應(yīng)為陰性。若染色結(jié)果仍為陽性，則為非特異性染色。此法可證明待檢組織切片的陽性結(jié)果是該抗體與組織內(nèi)靶抗原特異性反應(yīng)的結(jié)果。.免疫

29、組織化學(xué)法中的交叉反應(yīng)抗體僅識別特異的抗原決定簇而不識別抗原本身，具有相同抗原決定簇的不同物質(zhì)可以和同一種抗體結(jié)合。解決的最可靠的方法是將抗體用可能與之有交叉反應(yīng)的抗原吸收，去除有交叉反應(yīng)的抗體后，再用作免疫染色，或用已證明沒有交叉反應(yīng)的單克隆抗體。制成針對抗原不同片段的抗體，如各抗體均得出相同的染色結(jié)果，則存在交叉反應(yīng)的可能性要小得多。但是，無絕對對照實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果也是相對的。.原位雜交組織化學(xué)法 原位雜交組織化學(xué)（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后再應(yīng)用與標(biāo)記

30、物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)在核酸原有的位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。.原位雜交組織化學(xué)法創(chuàng)于1969年。在神經(jīng)形態(tài)學(xué)研究中，ISHH法主要用于顯示細(xì)胞內(nèi)的mRNA。此法目前很成熟，其靈敏度已達(dá)到可以顯示細(xì)胞內(nèi)僅幾個拷貝的mRNA的程度。ISHH法是用標(biāo)記的單鏈核酸探針與組織切片反應(yīng)的方法。.探針的類型1）按標(biāo)記物 放射性探針（32P、35S及氚） 非放射性探針（生物素、堿性磷酸酶等物質(zhì)標(biāo)記的探針）2）按核酸性質(zhì) cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針 分別于組織內(nèi)相互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，形成DNA- RNA或RNA- RNA雜交體。.cDNA是指與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈，由克隆技術(shù)產(chǎn)生，原

31、位雜交的特異性強(qiáng)，比RNA探針簡便，應(yīng)用較廣。主要缺點(diǎn)是cDNA探針通常是雙鏈的，必須在使用前加溫，使之分離成兩條單鏈，其中之一條為cDNA鏈，能參與雜交。但無關(guān)DNA鏈可以和cDNA鏈重新結(jié)合（退火），在雜交過程中與mRNA爭奪cDNA，而且其與cDNA鏈的結(jié)合可能比與mRNA的結(jié)合更容易。.RNA探針也是由克隆技術(shù)產(chǎn)生，技術(shù)上比cDNA困難。其優(yōu)點(diǎn)是所產(chǎn)生的探針是單鏈的，不存在退火問題，因此靈敏度更高， RNA- RNA結(jié)合還比DNA- RNA結(jié)合穩(wěn)定。寡核苷探針是人工合成的一段與mRNA互補(bǔ)的短核苷鏈。短探針有利于透入組織，寡核苷探針的制備容易，針對性強(qiáng)，因而特異性強(qiáng)。但由于探針短，其與

32、mRNA結(jié)合不夠牢固，故雜交及雜交后清洗的條件不能太苛刻。.原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法 由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，故具體應(yīng)用技術(shù)方法上有差異，但基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為： 雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等； 雜交； 雜交后處理； 顯示（visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。.固定 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針

33、易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。 DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。 在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。 .玻片和組織切片的處理 玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150或以上過夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效

34、果。.增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存量和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。 蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶k 1g/ml(于0.1mol/l Tris/50mm

35、ol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37孵育1520min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。 在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。 .減低背景染色 雜交后（Posthybridization ）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交

36、點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 防止RNA酶的污染 在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150左右。 .雜交（Hybridisation） 是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。 探針的濃度和長度，雜交的溫度和時間。探針的長度，一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長度應(yīng)在50100個堿基之間。探針

37、短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時間短。 雜交反應(yīng)溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。.雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。 顯示（Visualization） a 放射性自顯影 b 非放射性標(biāo)記顯示：堿性磷酸酶標(biāo)記

38、探針雜交結(jié)果用硝基四氮唑藍(lán)等底物顯示。.對照實(shí)驗(yàn)同時設(shè)置證明特異性 由于mRNA分子僅由4種核苷組成，因此存在著不同mRNA分子有某些相同核苷片段的可能性。因此原位雜交也存在與免疫組織化學(xué)相類似的交叉反應(yīng)問題。探針越短，交叉反應(yīng)的可能性越大。 首先，在決定探針的堿基序列時，可用 Northern Blot法檢查該探針能否識別正確的mRNA位置。.在組織切片上的對照可采用：用核糖核酸酶進(jìn)行雜交前處理， mRNA應(yīng)不再出現(xiàn)；用有意義探針在相鄰切片進(jìn)行雜交，應(yīng)為陽性結(jié)果。用過量的未標(biāo)記探針作競爭試驗(yàn)，標(biāo)記探針的特異結(jié)合將大為減弱。在相鄰切片對同一mRNA使用數(shù)種針對不同片段的探針進(jìn)行雜交，能否得到同

39、樣結(jié)果。.原位雜交法和免疫組織化學(xué)法都是顯示細(xì)胞化學(xué)成分的方法，兩者相輔相成。兩者的一個共同問題是反應(yīng)的特異性問題。兩種方法的互相印證可以彼此作為其特異性的證據(jù)。原位雜交法能更確切地反映某種物質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)。mRNA量的消長通常反映了其表達(dá)的下調(diào)和上調(diào)，而免疫組織化學(xué)雖然也能反映細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的量的變化，但這種變化可以是由于其在細(xì)胞內(nèi)合成量的變化，也可以是其從胞體釋放或被代謝、分解量的變化。.受體定位法神經(jīng)活性物質(zhì)擔(dān)負(fù)著在神經(jīng)元間傳遞信息的作用，在其所作用的神經(jīng)元上（內(nèi)）存在著特異性地與某一具有特定構(gòu)造的神經(jīng)活性物質(zhì)特異性結(jié)合，而使其發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)的物質(zhì)，稱為受體。受體不僅分布在細(xì)胞體的胞膜上，也存在

40、于樹突、軸突等的膜上，還存在于胞核和胞漿內(nèi)（兒茶酚胺類和肽類等親水性物質(zhì)的受體存在于胞膜上，類固醇激素等疏水性物質(zhì)的受體存在于胞核或胞漿內(nèi)）。免疫組織化學(xué)法：用針對受體的特異性抗體原位雜交法：已知受體的氨基酸序列，人工合成針對它們的特異性分子探針。配體法：主要在組織切片上進(jìn)行，利用標(biāo)記的配體和受體結(jié)合以示蹤其部位。配體是與受體有親和力的物質(zhì)的總稱。此法目前很少用。.（二）生理藥理學(xué)方法1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測定2、神經(jīng)遞質(zhì)功能的測定 3、行為學(xué)方法.1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測定（1）推挽灌流（2）腦內(nèi)微透析術(shù)（3）伏安法（4）微穿刺術(shù)（5）腦片. 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，復(fù)雜的神經(jīng)聯(lián)系要通過突觸來傳遞。當(dāng)

41、動作電位到達(dá)突觸前末梢時，突觸前膜去極化，Ca2+內(nèi)流，引起突觸前膜內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入突觸間隙后，通過擴(kuò)散到達(dá)突觸后膜，與位于突觸后膜上的受體結(jié)合，引起突觸后神經(jīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)發(fā)生變化。從生理功能上來看，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放是整個神經(jīng)遞質(zhì)代謝各環(huán)節(jié)中的最重要的一環(huán)，它代表了中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的主要方面。.神經(jīng)遞質(zhì)釋放的動態(tài)變化可用在體和離體方法進(jìn)行研究。推挽灌流是在體研究中樞核團(tuán)遞質(zhì)釋放的有用方法，通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)的變化。腦內(nèi)微透析術(shù)是在推挽灌流基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，其特點(diǎn)是灌流液在半透膜管內(nèi)流動，不與腦組織直接接觸，可測定腦組織細(xì)胞外液中

42、不同生理狀態(tài)下基礎(chǔ)的、對藥物反應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物釋放量及其變化。伏安法是應(yīng)用微電極測定腦內(nèi)的生物胺及其代謝產(chǎn)物的方法，其時間分辨率比腦內(nèi)微透析術(shù)高。微穿刺術(shù)能快速、簡便獲取腦核團(tuán)組織進(jìn)行化學(xué)測定。同位素標(biāo)記腦片是離體研究神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程及其機(jī)制的重要手段。.在體研究特定腦區(qū)或核團(tuán)遞質(zhì)釋放的方法，通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)的變化。實(shí)驗(yàn)裝置由三部分組成：灌流液泵和進(jìn)液系統(tǒng)、灌流探頭、灌流液收集系統(tǒng)。灌流液泵和進(jìn)液系統(tǒng)由一個恒速泵和進(jìn)液管組成。灌流液在恒速泵的推動下通過進(jìn)液管進(jìn)入到灌流探頭內(nèi)。灌流液通常為人工腦脊液。為減輕對腦組織的刺激，灌流時灌流液通常維

43、持在36-37。灌流探頭有多種形式，并列式推挽灌流探頭結(jié)構(gòu)較簡單，但對腦組織損傷較大。同心圓式推挽灌流探頭對腦組織損傷較小，是目前國內(nèi)外常用的灌流探頭。（1）推挽灌流.同心圓式推挽灌流裝置由直徑不同的同心圓不銹鋼內(nèi)、外套管和灌流泵組成。灌流時，灌流液經(jīng)內(nèi)套管進(jìn)入局部腦組織，再由外套管經(jīng)側(cè)管吸出流入收集器。為了防止套管末端處的負(fù)壓對腦組織的局部抽吸作用，減少腦組織的損傷，在外套管與側(cè)管交接處開一小孔，在抽吸灌流液時讓空氣從小孔進(jìn)入側(cè)管，避免套管末端形成負(fù)壓。. 收集的樣品可通過高效液相層析、放射免疫測定等方法進(jìn)行測定。兩個問題：1 推挽灌流時，灌流液直接與腦組織接觸，可能造成灌流部位腦組織的損傷

44、；2 腦組織所釋放的各種化學(xué)物質(zhì)，包括各種蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和小分子化學(xué)物質(zhì)均可進(jìn)入灌流液中，為測定灌流液中的特定神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)帶來干擾。 因此，發(fā)展起來一種新的腦組織灌流技術(shù)，即腦組織微透析方法。.（2）腦內(nèi)微透析術(shù)腦內(nèi)微透析術(shù)是在特定的腦區(qū)內(nèi)，植入由透析膜組成的透析管。當(dāng)用灌流液持續(xù)灌流透析管時，待測的物質(zhì)可順濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)散，或從腦組織的細(xì)胞外液進(jìn)入透析管，或從透析管擴(kuò)散至細(xì)胞外液，通過收集灌流液，測定其中的待測物質(zhì)的含量，就可監(jiān)測該物質(zhì)的含量變化。腦內(nèi)微透析時可以選用通透性不同的透析膜，以選擇性地允許分子量在某一范圍內(nèi)（小于透析膜孔徑）的化學(xué)物質(zhì)通過透析膜進(jìn)入灌流液中。所以，腦內(nèi)微透析

45、所能監(jiān)測的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)主要是一些分子較小的神經(jīng)遞質(zhì)和較小的神經(jīng)肽，如去甲腎上腺素、多巴胺、腦啡肽等。.腦內(nèi)微透析術(shù)的裝置包括探頭、導(dǎo)管、微量灌流泵、樣品收集器和定量分析儀等。探頭由流入管、流出管和中空纖維管構(gòu)成。中空纖維管是能通過最大分子量為5000-50000的物質(zhì)的透析管。探頭按植入的方式可分為跨腦探頭、U型探頭和型探頭。所有探頭的植入均根據(jù)腦立體定位圖譜，借助腦立體儀進(jìn)行。.常用透析液是人工腦脊液，透析的速度一般為0.1-10l/min。樣品的采集一般在透析開始后30-60min開始，這時透析液中的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的回收率趨于穩(wěn)定。注意灌流液中鈣離子濃度要合適，過高或過低都會影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋

46、放和更新。分析結(jié)果時注意，所得結(jié)果僅僅是神經(jīng)末梢釋放到突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)濃度的平均變化，這是以分鐘或小時為單位時間的變化，而不能檢測突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)濃度的瞬時變化。.應(yīng)用測定體內(nèi)不同腦區(qū)各種內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)的濃度；刺激不同核團(tuán)或神經(jīng)通路對不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量的影響；動物自然行為的變化以及外界各種刺激引起的反應(yīng)與內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)釋放的關(guān)系；研究腦內(nèi)各化學(xué)系統(tǒng)的功能性的相互作用；研究藥物對腦內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的影響；通過測定體內(nèi)回收率的變化，可研究神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和攝取及它們的調(diào)節(jié)；研究影響腦化學(xué)的病理變化如腦缺血時腦組織內(nèi)的興奮性氨基酸含量的變化等。.（3）伏安法 活體內(nèi)包括腦內(nèi)的細(xì)胞外液中存在一些具有氧

47、化還原電活性的物質(zhì)，如生物胺神經(jīng)遞質(zhì)（去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺） 及它們的代謝產(chǎn)物、抗壞血酸、尿酸、谷胱甘肽等。若在細(xì)胞外液中加入2個電極，接通電源，在電極處就會出現(xiàn)電解反應(yīng)（在陰極出現(xiàn)氧化反應(yīng)）。應(yīng)用微電極進(jìn)行電解，并記錄電流-電壓曲線（又稱伏安圖），這個過程稱為伏安法。.基本原理.遞質(zhì)釋放的動態(tài)過程.測量儀器與設(shè)備碳纖維電極： 聚丙稀微碳纖電極（細(xì)胞，腦片） 柱狀碳纖電極（在體）膜片鉗放大器（電壓鉗模式）數(shù)據(jù)采集接口卡計(jì)算機(jī)系統(tǒng).優(yōu) 點(diǎn)胞吐活動的檢測不受胞吞活動重疊的干擾直接檢測釋放的物質(zhì)量化測量單個囊泡的分泌實(shí)時監(jiān)測無創(chuàng)傷測量.局限性可檢測的物質(zhì)：氧化電壓小于1000m

48、V的遞質(zhì)分子（腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、組胺、抗壞血酸等）。 谷氨酸、乙酰膽堿、GABA、胰島素等不能被檢測。碳纖電極測量的只是直接與碳纖電極尖端相接觸或距離小于5m 范圍內(nèi)的那些小泡分泌。只能測量胞吐但不能測量胞吞。 .恒電位（安培法，amperometry） 時間分辨率高三角波循環(huán)電壓（伏特法，voltammetry） 能鑒別是哪種遞質(zhì)分子 但測量靈敏度比安培法低 因此，如果已知該細(xì)胞分泌的是哪一種遞質(zhì)，一般都使用安培法來記錄細(xì)胞分泌。.碳纖電極性能測試1. 電學(xué)特性測試 電極尖端緩慢浸入生理溶液中, HP=780 mV。由于電極極化作用, 碳纖電極的檢測電流( Iamp

49、) 波形會有一上沖。好的電極由于其漏電流很小, 在十幾秒到幾十秒后電流波形會降至10 pA 以內(nèi)。.2. 電極氧化性能測試.3. 腎上腺嗜鉻細(xì)胞分泌的檢測和判定. 伏安法的優(yōu)點(diǎn)是時間分辨率高，伏安法電極的反應(yīng)時間短，可用于檢測腦內(nèi)單胺遞質(zhì)快速的動態(tài)變化。伏安法的碳素纖維微電極（一般在10-20m）遠(yuǎn)比腦內(nèi)微透析中的微透析管（大于200m）口徑小，可減少腦組織的損傷及可檢測腦內(nèi)小核團(tuán)的神經(jīng)活性物質(zhì)。但微透析法中用HPLC檢測樣品，有很高的特異性，而且一次可同時檢測多種神經(jīng)活性物質(zhì)，可同時了解不同物質(zhì)的動態(tài)變化及它們之間的相互作用，這是伏安法難以做到的。.假遞質(zhì)標(biāo)記法：原理是對于特定的分泌細(xì)胞，尋

50、找一種該細(xì)胞的分泌小泡內(nèi)本來不存在，但分泌小泡能夠自動攝取的“易氧化分子”。將該易氧化物質(zhì)放到細(xì)胞外液中，待分泌小泡攝取足夠易氧化分子后便可做CFE實(shí)驗(yàn)。電極涂層法：原理是對于待測量的特定遞質(zhì)，尋找一種能夠選擇性“催化”該遞質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)或生物酶，并將該物質(zhì)“鍍”到CFE 電極尖端，當(dāng)遞質(zhì)分子到達(dá)CFE電極尖表面時，首先經(jīng)“鍍層”物質(zhì)催化而在小于1000mV條件下氧化，氧化電流成為涂層CFE的信號。尋找高效率并且穩(wěn)定性較高的涂層是本方法的關(guān)鍵。 .（4）微穿刺術(shù)微穿刺術(shù)是利用中空針管切取腦片中的特定核團(tuán)，用于檢測其化學(xué)成分，包括神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物等。動物處死后立即取出腦，迅速將所需的腦區(qū)作冷凍

51、切片。在顯微解剖鏡下，確定腦片中要切取的腦核團(tuán)的位置，然后用中空針管穿刺腦片切取樣品。然后，將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，如勻漿、超聲波破碎或提取等，最后進(jìn)行化學(xué)測定。能快速、簡便獲取腦核團(tuán)組織進(jìn)行化學(xué)測定。微穿刺術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)的研究。用于了解神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、酶和受體等在腦區(qū)中的分布，測定這些化學(xué)物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)條件和病理?xiàng)l件下的改變。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單快捷且非?？煽?，有很高的解剖結(jié)構(gòu)的分辨率，樣品經(jīng)過適當(dāng)處理后可用許多分析技術(shù)進(jìn)行測定。缺點(diǎn)：組織樣品是在死后獲得的；樣品中的神經(jīng)元失去了傳入和傳出的聯(lián)系；在處理過程中如勻漿等會引起缺氧。.（5）腦片離體研究神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程及其機(jī)制的重要手段。過程包括：

52、腦片制備：麻醉后取腦，將選擇好的腦區(qū)切成腦片。 孵育：5CO2、95O2飽和的緩沖液，37。 標(biāo)記腦片：孵育液中加入適量的含放射性同位素的神經(jīng)遞質(zhì)或其前體標(biāo)記腦片。腦片的神經(jīng)末梢對這些物質(zhì)應(yīng)具有高親和力攝取，使神經(jīng)末梢的遞質(zhì)貯庫被放射性物質(zhì)選擇地標(biāo)記。.灌流裝置釋放量的測定：基礎(chǔ)釋放量去極化刺激引起的釋放量：電場刺激高鉀濃度去極化 最后檢測流出液和組織的放射活性，或用HPLC檢測。.2、神經(jīng)遞質(zhì)功能的測定 突觸前神經(jīng)末梢的遞質(zhì)是以量子式釋放的，其量很微小，因此在進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)功能測定時，只能用最小而有效的劑量模擬神經(jīng)遞質(zhì)的生理效應(yīng)。 （1）微電泳：能將微量的神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)入神經(jīng)元附近，觀察其作用。（

53、2）抗體微量注射. 定義：借助微電極通以一定的電流將解離物質(zhì)電泳到神經(jīng)元附近，觀察神經(jīng)遞質(zhì)或其他藥物對該神經(jīng)元的作用。 基本原理：外加電流通過含解離物質(zhì)溶液的微電極時，會將微電極內(nèi)的解離物質(zhì)從管尖釋放出來。例如在微電極接正極，動物頭皮接負(fù)極時，帶陽離子的物質(zhì)從微電極中釋出。相反，微電極接負(fù)極，頭皮接正極（內(nèi)向電流）時，微電極釋出的是帶負(fù)離子的物質(zhì)。微電泳時解離物質(zhì)從微電極釋出量，與它通過的電荷量成正比。因此，通常用微電極的電流強(qiáng)度表示解離物質(zhì)的釋放量。 方法：1）拉制微電極：五管：每管尖端直徑1-3m, 五管總直徑510m.其中，一管為紀(jì)錄，一管為對照，三管為藥物。若需作細(xì)胞內(nèi)記錄，則有一管應(yīng)

54、較其他管略長，以便插入細(xì)胞內(nèi)。 （1）微電泳 Microelectrophoresis. 藥物管可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將神經(jīng)遞質(zhì)或藥物配成離子化溶液。為此常用稀釋的NaOH溶液或HCl溶液制備，并調(diào)整溶液的pH值，使要作微電泳的物質(zhì)呈陽離子或陰離子，以便微電泳時能將所需要的解離物質(zhì)導(dǎo)入所要觀察的神經(jīng)元。 2）微電極充滿溶液后，在立體定位儀幫助下，將微電極插至所需要觀察的腦核團(tuán)內(nèi)的神經(jīng)元附近。微電泳儀上的輸出接頭通過Ag-AgCl細(xì)絲插入微電極各管中，另一共用接頭連在動物頭皮上，是每一管電極與頭皮電極之間形成回路。然后，立即施加滯留電流防止自發(fā)性外溢。微電泳時選擇一定強(qiáng)度（nA）的電流通過微電極，微電

55、極中的解離物質(zhì)釋放量與通電電流強(qiáng)度成正比。.多管微電泳方法具有三大特點(diǎn)。第一，與離體實(shí)驗(yàn)相比，應(yīng)用這種方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠提供整體條件下目標(biāo)細(xì)胞功能狀態(tài)的信息。第二，藥物的作用范圍很小，可以精確定位到一個或幾個細(xì)胞的反應(yīng)，所以用來研究藥物對單個神經(jīng)細(xì)胞的直接作用。第三，可以通過改變微電泳電流的大小來調(diào)節(jié)所施加藥物的量。.Microionphoresis:This methods enables a researcher to apply very small amounts of drugs or neurotransmitter candinates to the surface of n

56、eurons.應(yīng)用：將神經(jīng)遞質(zhì)或藥物越過血腦屏障直接作用于神經(jīng)元，甚至突觸前膜和后膜，觀察這些遞質(zhì)和藥物對它們的作用?？梢灾苯訉λ涗浀纳窠?jīng)細(xì)胞施加多種受體的激動劑或拮抗劑，確定該神經(jīng)細(xì)胞膜上是否存在這種受體，激活或阻斷這種受體引起神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生興奮還是抑制。另外，還可將跨膜信號傳導(dǎo)通路中某些關(guān)鍵因子如G-蛋白、第二信使等的激動劑或抑制劑通過微電泳方法施加到記錄的神經(jīng)細(xì)胞處，從而研究受體激活后的信號傳導(dǎo)通路。. 基本原理: 抗體抗原中和反應(yīng)。特異性抗體注射在某一腦區(qū)，可中和神經(jīng)末梢釋出而進(jìn)入突觸間隙的神經(jīng)肽，防止其與受體結(jié)合。因此，用此方法可解釋消除該神經(jīng)肽的生理效應(yīng)的結(jié)果，從而推測內(nèi)源性神經(jīng)遞

57、質(zhì)的作用。 中樞內(nèi)直接注射法包括：腦室內(nèi)注射，通過腦內(nèi)埋植慢性套管和脊髓蛛網(wǎng)膜下腔慢性插管進(jìn)行恒速微量注射等方法，或通過玻璃微電極向被紀(jì)錄的神經(jīng)元附近微量注射。 （2）抗體微量注射.3、行為學(xué)方法經(jīng)典條件反射操作式條件反射 動物必須完成某種運(yùn)動或操作后才能得到強(qiáng)化。例如，將大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，當(dāng)它在走動中偶然踩杠桿時即喂食，以強(qiáng)化這一操作，如此重復(fù)多次，大鼠即學(xué)會自動踩杠桿而得食。踩杠桿這樣一個特定的動作就是條件反應(yīng)，簡稱反應(yīng)。操作式條件反射代表了反應(yīng)與強(qiáng)化之間的關(guān)系。 .（三）生物化學(xué)方法 神經(jīng)科學(xué)中，生物化學(xué)方法的主要任務(wù)是分離和分析神經(jīng)組織以及與神經(jīng)活動有關(guān)的種類繁多的化學(xué)組分，特別是諸多

58、的神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、激素、生長因子及其受體，這些物質(zhì)的含量極微，有些組分很容易失去活性。因此，和其他領(lǐng)域比較，更需要用溫和的、高回收、高分辨和高靈敏度的分離分析方法。.1、層析分離技術(shù)2、放射免疫測定法3、酶聯(lián)免疫吸附法4、免疫印跡法. 層析，也稱為色譜分析，是一種分離技術(shù)，其基本原理是利用不同的物質(zhì)在兩個相（即固定相和移動相）之間具有不同的分配系數(shù)，即不同物質(zhì)和固定相締合的緊密程度以及用液體（即移動相）淋洗時被洗脫的難易程度的不同，而達(dá)到將樣品中所含的各種物質(zhì)分離的目的。其優(yōu)點(diǎn)是分離條件溫和，有利于保持生物活性，并適合于大量制備。1、層析分離技術(shù). 層析法進(jìn)行時有兩個相，一個相稱為固定相(St

59、ationary phase )，通常為表面積很大的或多孔性固體；另一相稱為流動相(Mobile phase ) ，是液體或氣體。當(dāng)流動相流過固定相時，由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同，經(jīng)過多次差別分配而達(dá)到分離，或者說，易分配于固定相的物質(zhì)移動速度慢，易分配于流動相中的物質(zhì)移動速度快，因而得到逐步分離。.層析分離法基本原理.層析技術(shù)的分類 按兩相所處的狀態(tài)分類 以液體作為流動相的層析稱為液相層析，以氣體作為流動相的稱為氣相層析。 其固定相也可有兩種狀態(tài)，一種是以固體作為吸附劑的固定相，另一種是以涂布在固體載體表面的液體作為固定相。.層析氣相層析（gas-chromatography）液相層析（

60、liquid-chromatography）氣-固層析（gas-solid chromatography）氣-液層析（gas-liquid chromatography）液-固層析（liquid-solid chromatography）液-液層析（liquid-liquid chromatography）.2.按操作技術(shù)形式分類.柱層析（colum chromatography） 將固定相裝在層析柱中，使樣品朝著一個方向移動，通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。紙層析（paper chrmatography） 用紙作為液體的載體，樣品點(diǎn)在紙上隨后展開達(dá)到分離鑒定的方法。薄層層析（thin