第三章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)課件

1、第三章 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)韶關(guān)學(xué)院生科院 易道生內(nèi)容掌握抗原抗體反應(yīng)的原理與特點(diǎn)，了解抗原抗體結(jié)合力和比例。掌握免疫組化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的選擇與使用。掌握酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）反應(yīng)的原理方法。掌握免疫印痕（Western blot）的技術(shù)原理與方法。了界放射免疫檢測(cè)技術(shù)（RIA）的原理與方法。目標(biāo)：掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)就是利用抗原和抗體高度特異性結(jié)合的原理和方法，檢測(cè)分析各樣品中的目標(biāo)物質(zhì)，以監(jiān)控物品質(zhì)量、檢測(cè)機(jī)體免疫機(jī)能和診斷某些疾病的體外檢測(cè)方法。免疫檢測(cè)是微量檢測(cè)方法，靈敏、特異。隨著方法和技術(shù)的改進(jìn)，免疫檢測(cè)方

2、法已滲入工、農(nóng)、食品、醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域。從20世紀(jì)50年代美國(guó)學(xué)者Berson和Yallow發(fā)明了放射免疫測(cè)定技術(shù)檢測(cè)胰島素起，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)經(jīng)歷了從定性到定量；從常量分析到微量、超微量分析；從手工檢測(cè)到全自動(dòng)化；從單個(gè)標(biāo)本檢測(cè)到高通量檢測(cè)等一系列長(zhǎng)足的進(jìn)步。本章主要學(xué)習(xí)血清學(xué)檢測(cè)方法抗原抗體檢測(cè)方法。年代學(xué)者貢獻(xiàn)1894J. Bordet補(bǔ)體與溶菌活性1896H. Durham, M. von Gruber特異凝集反應(yīng)1896G. Widal, A. Sicad肥達(dá)試驗(yàn)1897R. Kraus沉淀試驗(yàn)1900J. Bordet, O. Gengou補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)1900K. Landsteine

3、r人類ABO血型及其抗體1906A. Wassermann梅毒補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)1935M. Heidelberger, F. Kendall純化抗體,定量沉淀反應(yīng)1941A. Coons免疫熒光標(biāo)記1946J. Oudin凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)1948O. Ouchterlony, S. Elek雙擴(kuò)散沉淀反應(yīng)1953P. Grabar, C. Williams免疫電泳分析,Ig多樣性1960R. Yallow, S. Berson放射免疫標(biāo)記1966S. Avrames, J. Uriel, et al酶標(biāo)免疫技術(shù)1975G. Kohler, C. Milstein雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展

4、史第一節(jié) 免疫學(xué)檢測(cè)的基本原理抗原抗體反應(yīng)指抗原與相應(yīng)抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)。曾叫血清學(xué)反應(yīng)。 抗體結(jié)構(gòu) CCFcFabNNNNCC一、抗原抗體的特異性結(jié)合抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，在體內(nèi)可介導(dǎo)溶細(xì)胞效應(yīng)、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套機(jī)體體液免疫功能。體外反應(yīng)有凝集作用、沉淀作用、調(diào)節(jié)作用、中和作用等。1、抗原抗體的互補(bǔ)性和親和性抗原抗體的結(jié)合是基于抗原決定簇（表位）與抗體超變區(qū)分子間的互補(bǔ)性和親和性?；パa(bǔ)性指抗原表位的空間結(jié)構(gòu)與抗體分子超變區(qū)內(nèi)的抗原結(jié)合位點(diǎn)間的空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)嵌合。親和性指抗體分子上的抗原結(jié)合位點(diǎn)與相應(yīng)抗原表位間互相適應(yīng)產(chǎn)生的吸引力。互補(bǔ)性是Ag和Ab結(jié)合的基礎(chǔ)，親和性是A

5、g和Ab間固有的作用力。2、抗原抗體結(jié)合力 抗原和抗體分子的結(jié)合可以是游離形式的，也可以結(jié)合在細(xì)胞表面。這種結(jié)合也是非共價(jià)鍵結(jié)合?？乖c抗體相互結(jié)合只局限于分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結(jié)合位點(diǎn)之間，且以親和力的作用方式結(jié)合在一起。由這些特定部位之間的短程分子力相互作用的結(jié)果。這些吸引力只有在極短的距離內(nèi)才有效。因此抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力。這種分子間的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專一性?？乖贵w間的作用力有：抗原抗體分子間的作用力，即親和力包括以下幾種：1、鹽鍵（離子鍵）2、范德華力3、疏水作用4、氫鍵3、親水膠轉(zhuǎn)化為疏水膠抗體和大部

6、分抗原在溶液中是親水膠，不會(huì)聚沉。一旦破壞電荷和水化層，如Ag + Ab，減少電荷，由親水膠轉(zhuǎn)化為疏水膠，形成可見的Ag Ab復(fù)合物沉淀。利用此沉淀反應(yīng)可檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1、特異性 抗原與抗體相互結(jié)合必須有空間構(gòu)型的互補(bǔ)性，因此，有很強(qiáng)的特異性。但，如果兩種抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗體間構(gòu)型有部分或全部相同，就可能出現(xiàn)交叉結(jié)合凝集或沉淀。既可能干擾實(shí)驗(yàn)，也可以用于擴(kuò)大應(yīng)用范圍。2、比例性抗原（多價(jià)）抗體（2價(jià)或以上）不等價(jià)性，使抗原抗體反應(yīng)時(shí)存在比例關(guān)系，生成物的量與反應(yīng)物的量（濃度）有關(guān)。比例性：抗原抗體結(jié)合生成復(fù)合物的量與反應(yīng)物濃度的關(guān)系。只有2者分子

7、比例合適，結(jié)合價(jià)相互飽和，才生成可見的復(fù)合物。在等價(jià)帶區(qū)的溶液中幾乎不存在游歷的抗原和抗體。滴度（效價(jià)）指抗原或抗體與一定量的對(duì)應(yīng)物產(chǎn)生明顯可見的反應(yīng)所需的最小量?？乖贵w反應(yīng)的等價(jià)帶（zone of equivalence）：曲線的高峰部分，抗原抗體分子比例合適的范圍。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，沉淀物形成快而多。最適比（optimal ratio）：其中有一管反應(yīng)最快，沉淀物形成最多，上清液中幾乎無游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適。帶現(xiàn)象（zone phenomenon）：等價(jià)帶前后分別為抗體或抗原過剩則無沉淀物形成。前帶（prezone）：抗體過量后帶（postzo

8、ne）：抗原過剩?？乖贵w比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響3、可逆性抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)可逆的反應(yīng)。Ag + Ab Ag-Ab高親和力抗原表位和抗體超變區(qū)的構(gòu)型非常適合，結(jié)合牢固，不易解離。解離取決于：抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親和力環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時(shí)，如果是顆?？乖瑒t出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；如果是可溶性抗原，則產(chǎn)生沉淀作用。4、階段性抗原抗體反應(yīng)被人為分為2階段。結(jié)合階段：當(dāng)抗原與同型抗體相遇時(shí)，在合適條件下，不論彼此量的多少，都立即發(fā)生特異性的結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這一過程通常只需要幾秒的時(shí)間便可完成，稱為反應(yīng)的一級(jí)階段。反應(yīng)階段：在一級(jí)階段之后，繼發(fā)出現(xiàn)抗原與抗體間進(jìn)一步交聯(lián)而形成網(wǎng)絡(luò)狀凝

9、集物，進(jìn)而出現(xiàn)可見的凝集和沉淀，稱為反應(yīng)的二級(jí)階段。這一階段是抗原抗體網(wǎng)格生長(zhǎng)的階段，速率要慢的多，且在很大程度上依賴于溫度、離子強(qiáng)度等外界條件，但更重要的是需要合適的抗原抗體分子比例。只有當(dāng)二者的結(jié)合價(jià)彼此飽和時(shí)，才能連接成一個(gè)大網(wǎng)格樣凝集物，出現(xiàn)凝集或沉淀。三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原抗體自身因素抗原：理化性狀 決定簇種類和數(shù)量抗體： 來源： 兔等， 馬、人 單克隆抗體 濃度 特異性和親和力2 環(huán)境因素電解質(zhì) Na+和C1，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢(shì)下降，促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。酸堿度 抗原抗體反應(yīng)一般在pH為68進(jìn)行。PH過高或過低都

10、將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)，例如pH達(dá)到或接近抗原的等電點(diǎn)時(shí)，即使無相應(yīng)抗體存在，也會(huì)引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽性反應(yīng)。溫度 溫度升高可加速分子運(yùn)動(dòng)，抗原與抗體碰撞機(jī)會(huì)增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56時(shí)，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；在40時(shí)，結(jié)合速度慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37。適當(dāng)振蕩/攪拌 可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結(jié)合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應(yīng)的原理Ab 過剩Ag 過剩比例適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)的可見性常見血清學(xué)檢測(cè) 1.凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng) 1

11、:2稀釋待測(cè)血清 1:4 1:8 1:16 細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定常用于檢測(cè)抗體的滴度或效價(jià)，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗(yàn)。間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗(yàn)、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風(fēng)濕因子檢測(cè)。凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內(nèi)anti-R

12、h由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細(xì)胞間的結(jié)合力不能克服細(xì)胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫姆試驗(yàn)正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內(nèi)的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫姆試驗(yàn)2.沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAb in gel單向免疫擴(kuò)散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散免疫比濁過量Ab Ab Ab Ab毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。鑒定多

13、種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度沉淀反應(yīng)免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。第二節(jié) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù) 抗原抗體（特異性）酶標(biāo)記抗體，通過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。免疫組織化學(xué)：用帶標(biāo)記物的抗體或抗原在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)或組織化學(xué)反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗或抗體進(jìn)行定性、定量、定位測(cè)定的技術(shù)。免疫組化分類免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標(biāo)記物的種類可分為：免疫熒光法免疫酶法免疫鐵蛋白法免疫金法放射免疫自顯影法 按標(biāo)記抗體的方式分：標(biāo)記抗體IHCT法非標(biāo)記抗體I

14、HCT法非標(biāo)記抗體IHCT法的二抗不被標(biāo)記，用以免疫動(dòng)物制備抗酶抗體，以酶-抗體再與二抗結(jié)合。按染色步驟分：直接法（一步法）間接法（2步法或多步法）一、檢測(cè)原理 通過免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，用特異性抗體(單克隆或多克隆)或抗原檢測(cè)組織、細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原或抗體物質(zhì)，形成抗原 - 抗體復(fù)合物；利用此復(fù)合物上帶有預(yù)先標(biāo)記的標(biāo)記物，通過與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，以達(dá)到診斷、鑒別診斷和研究的目的。可作為抗原的物質(zhì)有 酶、 受體、 抗體、 細(xì)胞外基質(zhì) 激素、 細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、病原體。二、免疫標(biāo)記物顯色原理免疫酶測(cè)定法免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定法

15、免疫膠體金技術(shù)免疫酶測(cè)定法夾心法ELISA間接ELISABASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) 將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷未知抗原的含量。a）b）免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測(cè)免疫熒光技術(shù)海馬細(xì)胞 微管蛋白 綠色(胞體、樹突) 軸突終末蛋白 紅色(突觸) 培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞 微管呈綠色 核呈藍(lán)色放射免疫測(cè)定用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)。常用的有131I、125

16、I?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記Ab/Ag，以檢測(cè)未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。免疫印跡法-Western blotting三、標(biāo)記抗體的特點(diǎn)與應(yīng)用原理1、一級(jí)抗體（第一抗體） 屬識(shí)別系統(tǒng)，特異性識(shí)別來自樣本的靶抗原。常用單抗或多抗，實(shí)驗(yàn)前-20 -40保存（1-2年有效），應(yīng)用液4約一周。一抗的使用濃度在不同

17、實(shí)驗(yàn)中是不一樣的，最佳用量需經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，一般選頂準(zhǔn)陽性的稀釋度。2、二級(jí)抗體（第二抗體） 連接放大和酶標(biāo)顯色指示系統(tǒng)的抗體。屬橋連抗體，一手連一抗，一手連標(biāo)志物（酶），根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。如要在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)確定一抗、二抗的濃度，最簡(jiǎn)單的是方陣（棋盤）滴定法。3、非標(biāo)志抗體IHCT和放大檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用原理1）酶-抗酶法（PAP） 利用酶聯(lián)抗體將酶與組織切片中抗原相結(jié)合，通過與適當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)（通常是H2O2）以及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine DAB)的顯色劑，產(chǎn)生一種不溶性棕色反應(yīng)產(chǎn)物。該法已被進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)展為更敏感的多級(jí)橋聯(lián)法，后者利于增加在抗原部位反應(yīng)產(chǎn)

18、物的沉積。 PAP法是酶-酶抗體(PAP)復(fù)合物（常用辣根過氧化物酶）組成的可溶性復(fù)合物為五環(huán)狀結(jié)構(gòu)，3個(gè)分子辣根過氧化物酶和二個(gè)抗體分子組成，極為穩(wěn)定，比免疫熒光法敏感100-1000倍，比酶橋法敏感20倍，其原理是特異性初級(jí)抗體（一抗）的Fab段與組織抗原結(jié)合，二抗（橋抗）在一抗與PAP復(fù)合物之間形成分子橋聯(lián)（此時(shí)一抗與PAP中的免疫球蛋必須是同一種屬，以使得衍生自其它種屬的二抗，對(duì)一抗分子PAP中的FC段及穩(wěn)定成份都具有特異性），洗滌后用H2O2 和DAB顯色，陽性為褐紅色，陰性無色。2）標(biāo)記的親和素-生物素法（LSAB） 生物素是一種低分子量的維生素，可以與抗體（二抗）共價(jià)結(jié)合。親合素

19、是一種從卵白素中提取的具有4 個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)的糖蛋白，借生物素與親和素的結(jié)合，將抗體與酶相連，這一特性能使之成為多級(jí)免疫酶學(xué)系統(tǒng)各成分之間的橋接物。1981年Hsu 等人建立了抗體-生物素-親和素-過氧化物酶(AvidiN BiotiN-peroxidase Complex ABC)系統(tǒng)。該方法是通過生物素相關(guān)的次級(jí)抗體將一抗連接到親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物上。 比PAP法敏感8-40倍，特異性強(qiáng)、非特異性背景著色低、方法簡(jiǎn)便、應(yīng)用廣。 ABC系統(tǒng)通過將鏈球菌抗生物素蛋白代替親和素蛋白而得到進(jìn)一步改進(jìn)，稱為鏈球菌抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)(StreptavidiN biotiN syst

20、em SAB)。鏈球菌抗生物素蛋白在生理PH環(huán)境中為電中性，而不產(chǎn)生非特異性結(jié)合，而抗生物素蛋白在生理PH環(huán)境中帶正電荷。應(yīng)用抗生物素蛋白-生物素法時(shí)，內(nèi)源性生物素能與抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物直接結(jié)合而產(chǎn)生非特異性或稱假陽性染色，避免的方法可先通過切片與游離抗生物素蛋白反應(yīng)以去除游離生物素。 葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal proteiN A SPA)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白成分， 單鏈多肽，分子量為42000，SPA最大的特點(diǎn)是能與不同種屬血清中免疫球蛋白分子穩(wěn)定FC段結(jié)合，此外還能與其它物質(zhì)如熒光素、過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金等結(jié)合，并不影響其生物活性，因此被

21、用來發(fā)展為一種簡(jiǎn)便而迅速的免疫過氧化物酶法，即用SPA代替PAP技術(shù)中的次級(jí)抗體，因SPA可與多種動(dòng)物的抗血清反應(yīng)，而不需因不同種動(dòng)物而制備相應(yīng)的第二抗體。SPA可以結(jié)合大多數(shù)IgG分子，可以充當(dāng)?shù)谝豢贵w和衍生自不同種屬的抗過氧化物酶抗體的橋接物即SPA-過氧化物酶聯(lián)法。同時(shí)由于SPA與FC段的高親和力可以減少非特異性背景染色。 3）多聚螯合物法將抗體和HRP共同連接在葡聚糖聚合物上，形成抗體多聚化合物酶。靈敏度高，每個(gè)聚合物有超過20個(gè)點(diǎn)與一抗結(jié)合。4、現(xiàn)色系統(tǒng)主要有DAB，AEC（ 3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC) ）均以HRP為供氫體。固紅，固藍(lán)，氯藍(lán)四唑（NBT），以堿性磷酸酶為現(xiàn)色

22、劑。四、基本操作過程全過程為：抗原制備與純化；抗體制備；標(biāo)記抗體制備；標(biāo)本采集與制備；免疫組化反應(yīng)與現(xiàn)色；結(jié)果觀察與分析。1、標(biāo)本采集與制備 石蠟切片 細(xì)胞爬片 冰凍切片 細(xì)胞涂片 組織印片 石蠟切片過程：取材固定沖洗脫水透明浸蠟包埋切片貼片烤片脫蠟復(fù)水染色脫水透明封藏等步驟。 組織標(biāo)本組織標(biāo)本 冰凍切片操作方法及技術(shù)要點(diǎn)：取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24242mm。取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。將冷凍好的組織塊，夾緊于切

23、片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在510um間。要注意的是：組織快大小合適選擇合適的冷凍度 未固定過的組織-10-15，脾、腎、肌肉等-15-20，含脂肪組織-25-30。及時(shí)清除殘余的包埋劑，防止撕裂組織。組織塊無須固定用于附貼切片的載玻片室溫存放，無須冷凍。切片不能馬上染色的可晾干低溫冷藏，或置組織培養(yǎng)液內(nèi)。0-4 保存。2、免疫化學(xué)染色酶法染色免疫熒光染色 標(biāo)本處理熒光試劑封片觀察一般為冰凍切片，石蠟切片效果差。免疫膠體金染色 免疫金銀染色免疫雙重/多重標(biāo)記染色 同一切片的同一組織

24、上同時(shí)顯示2種/以上的抗原成分，也稱免疫組化雙染法。要求2種抗原分布于細(xì)胞不同部位。針對(duì)抗原使用不同顏色的熒光素、酶或不同直徑的顆粒。五、免疫組化的影響因素與對(duì)策1、非特異性著色由內(nèi)源性酶和生物素干擾 滅活酶，用親和素飽和生物素。電荷吸附 BSA或二抗動(dòng)物血清封閉非特異位點(diǎn)。抗體原因 抗體不純或標(biāo)本含與靶抗原類似的表位。用單抗。洗滌不充分 加去污劑等洗。DAB不溶性顆粒未除掉而沉積在組織上。制片不當(dāng) 壞死、變性、炎癥組織、切片拱起、皺縮、邊沿缺損等。二抗動(dòng)物血清封閉或重切。2、組化染色的假陰性標(biāo)本保存不當(dāng) 老舊標(biāo)本、固定不當(dāng)或固定時(shí)間太長(zhǎng)、溫度過高等，改善條件，重做?？贵w等試劑質(zhì)量差 滴度、純

25、度、特異性或保存不當(dāng)，更換新試劑再做。操作失誤 嚴(yán)格按操作規(guī)程作。3、雜音 免疫組化中的非正常的背景著色。常見于抗體濃度過高、切片粘貼不牢，邊沿松動(dòng)等 第三節(jié) 免疫印跡技術(shù)1979年Renart and Towbin 將 Southern blotting 技術(shù)應(yīng)用與蛋白質(zhì)研究，并與酶免疫技術(shù)結(jié)合建立的蛋白檢測(cè)技術(shù)。靈敏度高，1-5 ng。簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)。目前，廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用研究和抗原性研究。一、原理：蛋白質(zhì)組分經(jīng)SDS分離后，平行轉(zhuǎn)移到固相支持體（NC膜或PVDF膜）上，通過免疫試劑來檢測(cè)靶蛋白。浸泡式電轉(zhuǎn)移的條件溫和，對(duì)蛋白樣本損失較小，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，需大量緩沖液；半干式電轉(zhuǎn)移時(shí)

26、間短，但有可能損傷樣品。今天采取浸泡式電轉(zhuǎn)移。靶蛋白的檢測(cè)通常采用兩步法或間接法，用一抗結(jié)合靶蛋白，再用過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗，然后HRP催化化學(xué)顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。當(dāng)前多采取化學(xué)顯色反應(yīng)。免疫學(xué)檢測(cè) 封閉 加一抗 洗膜 加二抗 洗膜 加底物 試驗(yàn)記錄 搖育過夜 搖育2h （3次，每次10min ）搖育1h二、操作過程1. SDS電泳2. 電轉(zhuǎn)移： 將冷卻管接上水龍頭，接上電源，根據(jù)凝膠面積調(diào)節(jié)電流（0.65mA/cm2），時(shí)間2小時(shí)。3. 電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，打開夾板，剪下NC膜左右上角做標(biāo)記（即標(biāo)記有蛋白結(jié)合面）。然后把NC膜分為兩份，其中一份放入氨基黑染色液中染色3060秒

27、，10乙酸漂洗，觀察膜上有無蛋白條帶。 如果有，可用另一份繼續(xù)以下的實(shí)驗(yàn)。4. 封閉： （將NC膜上無蛋白結(jié)合處封閉，防止探針的非特異性結(jié)合）在一培養(yǎng)皿內(nèi)倒入封閉液（5脫脂奶粉），將未染色的NC膜放入浸泡，室溫放置1小時(shí)。5. 探針結(jié)合：封閉結(jié)束后，用PBS漂洗一次。倒干PBS后，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG稀釋液，37C孵育1小時(shí)。 6. 孵育完成后，PBS漂洗三次（每次浸泡3分鐘），將未結(jié)合探針盡可能洗掉。倒干PBS后，加入底物工作液，避光顯色10分鐘，觀察顏色變化。三、影響因素與對(duì)策1、影響SDS的因素2、影響蛋白轉(zhuǎn)移的因素 轉(zhuǎn)移膜的活化與大小、緩沖液、是否平整、有無氣泡、電壓、溫度、轉(zhuǎn)移

28、時(shí)間等。3、封閉 封閉試劑濃度不能過高過低。4、顯色 設(shè)立陰陽性對(duì)照，DAB顯色后立即照相，否則易腿色。酶免疫技術(shù)按目的分類（一）酶免疫組織化學(xué)測(cè)定技術(shù)（二）酶免疫測(cè)定技術(shù) Ab *Ag Ab*Ag Ab* Ab Ag * AbAg * Ag* （1）Homogenous （均相測(cè)定） （2）Heterogenous（異相測(cè)定） Solid phase liquid phase 第四節(jié) 酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)一、ELISA的基本原理 ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。這一方法的基本原理如下。 （1）使抗原或

29、抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性； （2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性又保留酶的活性。二、基本操作流程測(cè)定抗原常用雙抗體夾心法，測(cè)定抗體用間接法?；具^程為：固相包被（吸附已知成分、洗滌、封閉、洗滌） 加待測(cè)樣品 促反應(yīng) 洗滌 加酶結(jié)合物促反應(yīng) 洗滌 加酶底物 促反應(yīng) 終止反應(yīng) 測(cè)定（比色、熒光）ELISA的類型： ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。用于這些目的的檢測(cè)方法主要有以下幾種類型。1 雙抗體(原)夾心法 2 間接法3 競(jìng)爭(zhēng)法 4 雙位點(diǎn)一步法 5 捕獲法測(cè)IgM抗體6 應(yīng)用親和素和生物素的ELISA ELISA的類

30、型 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 1、夾心法 過程：包被 加待測(cè)樣品 洗滌 加酶標(biāo)記物 洗滌 加底物 測(cè)定 1）雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原（二價(jià)及以上），例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。2）雙抗原夾心法測(cè)抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢

31、標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2、間接法測(cè)抗體 1）間接測(cè)抗體法傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。2）間接測(cè)抗原法3、雙位點(diǎn)一步法測(cè)定抗原由雙抗體夾心改進(jìn)而來，將雙抗體夾心中針對(duì)同一抗原決定簇的2種抗體改為針對(duì)抗原不同決定簇的2種單抗。敏感性和特異性大為提高。但抗原過量，Ag分別與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，抑制夾心復(fù)合物形成，出現(xiàn)所謂鉤狀效應(yīng)，甚至假陰性結(jié)果。過程：Ab1包被 加待測(cè)樣品和酶標(biāo)Ab2 洗

32、滌 底物也可用雙抗原夾心測(cè)抗體4、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 過程：將待測(cè)抗體（原）同時(shí)加入包被孔，洗滌除去酶標(biāo)記物，加底物測(cè)定。用于測(cè)定只有一個(gè)決定簇的小分子抗原或半抗原，當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗原5、 捕獲包被法測(cè)抗體或IgM抗體捕捉ELISA

33、IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM），再加抗原和酶標(biāo)2抗。此法常用于病毒性感染的早期診斷。6、橋聯(lián)法或稱抗酶抗體法或不標(biāo)記抗體酶法。常見的是HRP抗HRP法，AP抗AP法。首先用酶（如HRP）和抗原免疫同一種動(dòng)物分別制備針對(duì)抗原和酶的抗體（Ab1和Ab3）；以制備 Ab1和Ab3動(dòng)物的IgG免疫另一種動(dòng)物，制備Ab2； Ab2與Ab1和Ab3反應(yīng)產(chǎn)生Ab1 Ab2 Ab3復(fù)合物，其中Ab2起橋梁作用；待測(cè)標(biāo)本含有與Ab1相應(yīng)的抗原，反應(yīng)可生成Ag Ab1 Ab2 Ab3 酶 復(fù)合物，加底物即可

34、檢測(cè)。過程：已知抗體包被 加待測(cè)樣品，洗滌 加Ab1，洗滌 加Ab2，洗滌 加酶-酶抗體 底物此外，目前比較流行的生物素、親和素、SPA蛋白橋聯(lián)法用的比較多。 ABS-ELISA法 ：固相支持物；：樣品；：特異性IgG；：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；：DAB顯色液；：顯色；7、其它酶聯(lián)免疫測(cè)定法1）斑點(diǎn)免疫結(jié)合實(shí)驗(yàn)以硝酸纖維薄膜或尼龍膜做載體，操作與用聚苯乙烯相似。2）酶聯(lián)免疫測(cè)定的放大系統(tǒng)生物素-親和素系統(tǒng)（BAS） 利用一個(gè)親和素結(jié)合4個(gè)生物素的特點(diǎn)，放大反應(yīng)效果。酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定（ELFIA） 酶促反應(yīng)生產(chǎn)熒光物質(zhì)。靈敏度

35、提高16-39倍，達(dá)10-15Mol/L。AKP放大系統(tǒng) 多種酶偶連和氧化還原反應(yīng)反復(fù)循環(huán)進(jìn)行。3）均相EIA 測(cè)定小分子抗原或半抗原，特別是藥物檢測(cè)。測(cè)定模式是競(jìng)爭(zhēng)抑制法。 分為 酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)和克隆酶供體免疫測(cè)定2種。三、1、標(biāo)本收集和保存收集時(shí)間和體位影響 如做激素和藥物測(cè)定外源性干擾 溶血、凝固不全、時(shí)間過長(zhǎng)內(nèi)源性干擾 補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)物品、試劑、平衡溫度3、加血清樣本和及反應(yīng)試劑標(biāo)本稀釋、加樣順序和速度、加樣時(shí)間差4、酶促反應(yīng)混勻、溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH5、洗板加去污劑，手工或機(jī)械洗。6、顯色HRP的底物OPD或四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。37反應(yīng)30 min。7、

36、比色選擇正確的濾光片和波長(zhǎng)、OPD 492 nm，TMB 450 nm。有的儀器使用雙波長(zhǎng)掃描，注意波長(zhǎng)選擇。8、結(jié)果判斷定性用陰、陽性，定量則給出數(shù)據(jù)。11醉翁亭記 1反復(fù)朗讀并背誦課文，培養(yǎng)文言語感。2結(jié)合注釋疏通文義，了解文本內(nèi)容，掌握文本寫作思路。3把握文章的藝術(shù)特色，理解虛詞在文中的作用。4體會(huì)作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、導(dǎo)入新課范仲淹因參與改革被貶，于慶歷六年寫下岳陽樓記，寄托自己“先天下之憂而憂，后天下之樂而樂”的政治理想。實(shí)際上，這次改革，受到貶謫的除了范仲淹和滕子京之外，還有范仲淹改革的另一位支持者北宋大文學(xué)家、史學(xué)家歐陽修。他于慶歷五年被貶謫到滁州，也就是今天的

37、安徽省滁州市。也是在此期間，歐陽修在滁州留下了不遜于岳陽樓記的千古名篇醉翁亭記。接下來就讓我們一起來學(xué)習(xí)這篇課文吧！【教學(xué)提示】結(jié)合前文教學(xué)，有利于學(xué)生把握本文寫作背景，進(jìn)而加深學(xué)生對(duì)作品含義的理解。二、教學(xué)新課目標(biāo)導(dǎo)學(xué)一：認(rèn)識(shí)作者，了解作品背景作者簡(jiǎn)介：歐陽修(10071072)，字永叔，自號(hào)醉翁，晚年又號(hào)“六一居士”。吉州永豐(今屬江西)人，因吉州原屬廬陵郡，因此他又以“廬陵歐陽修”自居。謚號(hào)文忠，世稱歐陽文忠公。北宋政治家、文學(xué)家、史學(xué)家，與韓愈、柳宗元、王安石、蘇洵、蘇軾、蘇轍、曾鞏合稱“唐宋八大家”。后人又將其與韓愈、柳宗元和蘇軾合稱“千古文章四大家”。關(guān)于“醉翁”與“六一居士”：初

38、謫滁山，自號(hào)醉翁。既老而衰且病，將退休于潁水之上，則又更號(hào)六一居士?？陀袉栐唬骸傲缓沃^也？”居士曰：“吾家藏書一萬卷，集錄三代以來金石遺文一千卷，有琴一張，有棋一局，而常置酒一壺。”客曰：“是為五一爾，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之間，豈不為六一乎？”寫作背景：宋仁宗慶歷五年(1045年)，參知政事范仲淹等人遭讒離職，歐陽修上書替他們分辯，被貶到滁州做了兩年知州。到任以后，他內(nèi)心抑郁，但還能發(fā)揮“寬簡(jiǎn)而不擾”的作風(fēng)，取得了某些政績(jī)。醉翁亭記就是在這個(gè)時(shí)期寫就的。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)二：朗讀文章，通文順字1初讀文章，結(jié)合工具書梳理文章字詞。2朗讀文章，劃分文章節(jié)奏，標(biāo)出節(jié)奏劃分有疑難的語句。節(jié)奏

39、劃分示例環(huán)滁/皆山也。其/西南諸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，瑯琊也。山行/六七里，漸聞/水聲潺潺，而瀉出于/兩峰之間者，釀泉也。峰回/路轉(zhuǎn)，有亭/翼然臨于泉上者，醉翁亭也。作亭者/誰？山之僧/曰/智仙也。名之者/誰？太守/自謂也。太守與客來飲/于此，飲少/輒醉，而/年又最高，故/自號(hào)曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之間也。山水之樂，得之心/而寓之酒也。節(jié)奏劃分思考“山行/六七里”為什么不能劃分為“山/行六七里”？明確：“山行”意指“沿著山路走”，“山行”是個(gè)狀中短語，不能將其割裂?！巴?蔚然而深秀者”為什么不能劃分為“望之蔚然/而深秀者”？明確：“蔚然而深秀”是兩個(gè)并列的詞，

40、不宜割裂，“望之”是總起詞語，故應(yīng)從其后斷句。【教學(xué)提示】引導(dǎo)學(xué)生在反復(fù)朗讀的過程中劃分朗讀節(jié)奏，在劃分節(jié)奏的過程中感知文意。對(duì)于部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜的句子，教師可做適當(dāng)?shù)闹v解引導(dǎo)。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)三：結(jié)合注釋，翻譯訓(xùn)練1學(xué)生結(jié)合課下注釋和工具書自行疏通文義，并畫出不解之處?！窘虒W(xué)提示】節(jié)奏劃分與明確文意相輔相成，若能以節(jié)奏劃分引導(dǎo)學(xué)生明確文意最好；若學(xué)生理解有限，亦可在解讀文意后把握節(jié)奏劃分。2以四人小組為單位，組內(nèi)互助解疑，并嘗試用“直譯”與“意譯”兩種方法譯讀文章。3教師選擇疑難句或值得翻譯的句子，請(qǐng)學(xué)生用兩種翻譯方法進(jìn)行翻譯。翻譯示例：若夫日出而林霏開，云歸而巖穴暝，晦明變化者，山間之朝暮也。野芳發(fā)而

41、幽香，佳木秀而繁陰，風(fēng)霜高潔，水落而石出者，山間之四時(shí)也。直譯法：那太陽一出來，樹林里的霧氣散開，云霧聚攏，山谷就顯得昏暗了，朝則自暗而明，暮則自明而暗，或暗或明，變化不一，這是山間早晚的景色。野花開放，有一股清幽的香味，好的樹木枝葉繁茂，形成濃郁的綠蔭。天高氣爽，霜色潔白，泉水淺了，石底露出水面，這是山中四季的景色。意譯法：太陽升起，山林里霧氣開始消散，煙云聚攏，山谷又開始顯得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明變化的，就是山中的朝暮。春天野花綻開并散發(fā)出陣陣幽香，夏日佳樹繁茂并形成一片濃蔭，秋天風(fēng)高氣爽，霜色潔白，冬日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季?！窘虒W(xué)提示】翻譯有直譯與意

42、譯兩種方式，直譯鍛煉學(xué)生用語的準(zhǔn)確性，但可能會(huì)降低譯文的美感；意譯可加強(qiáng)譯文的美感，培養(yǎng)學(xué)生的翻譯興趣，但可能會(huì)降低譯文的準(zhǔn)確性。因此，需兩種翻譯方式都做必要引導(dǎo)。全文直譯內(nèi)容見我的積累本。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)四：解讀文段，把握文本內(nèi)容1賞析第一段，說說本文是如何引出“醉翁亭”的位置的，作者在此運(yùn)用了怎樣的藝術(shù)手法。明確：首先以“環(huán)滁皆山也”五字領(lǐng)起，將滁州的地理環(huán)境一筆勾出，點(diǎn)出醉翁亭坐落在群山之中，并縱觀滁州全貌，鳥瞰群山環(huán)抱之景。接著作者將“鏡頭”全景移向局部，先寫“西南諸峰，林壑尤美”，醉翁亭坐落在有最美的林壑的西南諸峰之中，視野集中到最佳處。再寫瑯琊山“蔚然而深秀”，點(diǎn)山“秀”，照應(yīng)上文的“美”。又寫釀泉，其名字透出了泉與酒的關(guān)系，好泉釀好酒，好酒叫人醉?！白砦掏ぁ钡拿直惆抵型赋觯缓笠觥白砦掏ぁ眮?。作者利用空間變幻的手法，移步換景，由遠(yuǎn)及近，為我們描繪了一幅幅山水特寫。2第二段主要寫了什么？它和第一段有什么聯(lián)系？明確：第二段利用時(shí)間推移，抓住朝暮及四季特點(diǎn)，描繪了對(duì)比鮮明的晦明變化圖及四季風(fēng)光圖，寫出了其中的“樂亦無窮”。第二段是第一段“山水之樂”的具體化。3第三段同樣是