組織學技術(shù)(特殊染色)PPT醫(yī)學課件

1、 組織學技術(shù)（特殊染色） 1特殊染色用于顯示標本中的一些結(jié)構(gòu)，使其在顯微鏡下與其它組織或細胞區(qū)別. 特殊染色單一特殊染色復(fù)合特殊染色一種染料對一種組織結(jié)構(gòu)或細胞進行染色多種染料對多種組織結(jié)構(gòu)或細胞進行染色2糖原染色方法： 糖原為細胞內(nèi)的多糖或粘多糖，肝細胞和肌細胞內(nèi)的糖原最多。糖原的多少，可以反映機體糖代謝的情況。例如：先天性糖代謝紊亂-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、淋巴肉瘤、間皮瘤、腎上腺瘤，肝細胞內(nèi)都可聚集過多的糖原。 3 過碘酸-雪夫反應(yīng)（periodic acid Schiff reaction， PAS)原理： 用過碘酸氧化多糖結(jié)構(gòu)的碳鍵， 使其形成2-醛基，與無色的品紅結(jié)合生成紫紅色品紅

2、復(fù)合物，沉淀于細胞內(nèi)糖原分布部位，從而可證明多糖或粘多糖的存在。 41、試劑配制（1）1%過碘酸水溶液： 過碘酸 1g 雙蒸水 100ml 將過碘酸溶于雙蒸水中（2）Schiff試劑： 雙蒸水 200ml 堿性品紅 1g 1mol/L 鹽酸 20ml 偏重亞硫酸鈉 2g （或亞硫酸氫鈉） 活性炭 300mg5 雙蒸水煮沸后離火，慢慢加入品紅，攪拌至完全溶解，冷卻至50時過濾，加入鹽酸，冷卻至25時加入偏重亞硫酸鈉搖蕩，密封置于暗處或4冰箱內(nèi)24h 。溶液呈草黃色時，加入活性炭搖蕩1min快速過濾。避光4保存?zhèn)溆谩?6(3)亞硫酸氫納溶液 10%偏重亞硫酸氫納 5ml 1mol/L鹽酸 5ml

3、蒸餾水 90ml 用前配制(4)1mol/L鹽酸 36%鹽酸 85.6ml 蒸餾水 914.4ml72、染色步驟（1) 切片入1%過碘酸液 氧化2-5 min。 充分水洗后，過蒸餾水。（2）入Schiff 液10-20 min（室溫 暗處）（3）入亞硫酸氫納液洗3次每次2min （去非特異性染色）流水沖洗10min， 過蒸餾水。（4)Mayer蘇木精復(fù)染2-3min。流水沖洗， 過蒸餾水，吸干。 從95%乙醇開始脫水、透明、封片。83、對照用1%淀粉糖化酶處理對照片20 min.或用唾液（無氣泡）消化對照片30 min 2次。4、結(jié)果細胞內(nèi)糖原呈紫紅色；對照片為陰性95、注意事項：（1）糖原易

4、溶于水，要用冷Carnoy液固定（2）配制Schiff試劑堿性品紅雜質(zhì)太多，或亞硫酸氫納潮解，都不能使堿性品紅脫色；盛Schiff試劑的瓶子不宜過大，以免SO2逸出；若Schiff試劑變成粉紅色即失效。Carnoy固定液:取純乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。一般固定1-2 h。固定后的組織塊可直接入95%的乙醇脫水。101112疏松結(jié)締組織各種成分顯示方法：疏松結(jié)締組織中含有：膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維；巨噬細胞、肥大細胞。 13一、 網(wǎng)狀纖維 分布：肝、腎、脾、淋巴結(jié)等器官內(nèi)。纖維直徑0.2-2.0m，分支多，交織成網(wǎng)。網(wǎng)狀纖維主要由型膠原蛋白組成，表面被覆糖蛋白，在

5、鍍銀切片呈黑色稱為嗜銀纖維。 14Gomoris鍍銀法顯示網(wǎng)狀纖維1、取材：淋巴結(jié)2、試劑配制（1）硝酸銀溶液： 硝酸銀 10.2g，溶于100ml蒸餾水。（2）氫氧化鈉溶液： 氫氧化鈉 3.1g，溶于100ml蒸餾水。 15（3）銀氨溶液的配置：取5ml 硝酸銀溶液，緩慢滴加氨水至溶液變得清亮；再加入5ml氫氧化鈉溶液，此時溶液變黑色再滴加氨水至溶液清亮后，補加4滴氨水，加蒸餾水稀釋至100ml，保存于棕色瓶中備用。16（4）高錳酸鉀溶液：高錳酸鉀0.5g， 蒸餾水95ml，3%硫酸5ml（5）氯化金溶液：氯化金 0.2g， 蒸餾水100ml（6）草酸溶液：草酸2ml，蒸餾水98ml（7）硫

6、酸鐵溶液：硫酸鐵2g， 蒸餾水100ml（8）甲醛溶液：甲醛20ml， 蒸餾水80ml17 3、染色程序（1）新鮮組織10%甲醛固定，石蠟切片， 常規(guī)脫蠟入水；（2）入高錳酸鉀溶液中5min，水洗1min；（3）入草酸溶液中漂白2min，水洗2min；（4）硫酸鐵中媒染2min，水洗1min； 18（5）銀氨溶液中處理1-5min（25 ）， 蒸餾水洗2次，各2min；（6）甲醛溶液中還原5min， 蒸餾水洗2次，各2min；（7）氯化金溶中調(diào)色1-3min，蒸餾水洗2次；（8）95%及無水乙醇脫水， 二甲苯透明，中性樹膠封片。 194、結(jié)果 淋巴結(jié)內(nèi)可見黑色網(wǎng)狀纖維， 粗細不等，交織成網(wǎng)。5

7、、注意事項 配制氨銀時氨液不可過多。2021二、彈性纖維 分布廣泛，彈性纖維較細，直徑0.2-1.0m，交織成網(wǎng)。富有彈性，與膠原纖維交織在一起。彈性纖維核心部分由均質(zhì)的彈性蛋白組成；外周覆蓋微原纖維。在皮膚學和檢測幼年機體組織中的彈性結(jié)構(gòu)。常用的顯示彈性纖維的染色有：地衣紅染色、 Gomoris醛品紅染色、Weigert染色等。22地衣紅染色顯示彈性纖維1、取材 皮下組織2、染液配制地衣紅染液： 地衣紅0.1g ，70%乙醇100ml，硝酸2ml。3、染色程序（1）石蠟切片脫蠟下行至70%乙醇。（2）地衣紅染液，室溫，12h或過夜，或37,15-30min.（3）70%乙醇分色，必要時可用0

8、.5%-1%鹽酸乙醇分色， 去除膠原纖維顏色。（4）常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。4、結(jié)果 彈性纖維為棕紅色，背景淡棕色。2324三、膠原纖維膠原纖維，粗細不等，直徑0.5-10m，波浪狀，有分支交織成網(wǎng)。膠原纖維由型膠原蛋白組成。膠原纖維對酸性染料的親和力強，如常用的酸性復(fù)紅及苯胺藍等，對膠原纖維有選染性，而其它組織不易著色，從而有利于其他組織的復(fù)染。顯示膠原纖維的主要方法：如van Gieson法、 Mallory法、 Masson法等。25Masson s三色染色法顯示膠原纖維1、取材：皮下組織或腸系膜鋪片2、固定：ZenkerBouin 10%中性福爾馬林緩沖液3、染液配制（1）

9、Weigert鐵蘇木精A液：蘇木精 10g, 95%乙醇100mlB液：29%三氯化鐵水溶液 4ml 25%鹽酸 1ml 蒸餾水 95ml用時甲乙兩液等份混合，只能用數(shù)天。26（2）Masson 酸性復(fù)紅染液：酸性復(fù)紅1g，冰醋酸 1ml，蒸餾水 99ml。（3）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液：磷鉬酸 2.5g，磷鎢酸2.5g，蒸餾水 100ml。（4）苯胺藍染液：苯胺藍 2.5g，冰醋酸 2ml，蒸餾水 100ml。（5）1%醋酸水溶液：冰醋酸 1ml ，蒸餾水 99ml。27 4、染色步驟（1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水。（2）Weigert 鐵蘇木精染色，10-20min。（3）流水沖洗，10min

10、，光鏡下查看。也可用1%鹽酸乙醇（70%）分色。流水沖洗，5min，蒸餾水浸洗。28（4）Masson 酸性復(fù)紅染液，15min，蒸餾水洗。（5）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液分色，10-15min，或至膠原纖維無紅色。（6）苯胺藍染液，10-20min，蒸餾水洗。（7） 1%醋酸水溶液分色，3-5min。鏡下查看分色程度。（8）95%乙醇脫水上行，二甲苯透明，樹膠封固。 295、結(jié)果：膠原纖維為藍色；肌纖維為紅色，細胞核為黑色。6、注意事項：標本為10%福爾馬林固定，切片染色前需用Bouin再固定，56 固定1h，或室溫過夜。3031伊紅-醛復(fù)紅染色法 同時顯示膠原纖維和彈性纖維 Gomori氏醛-復(fù)

11、紅染液是Gomori在試驗期間偶然發(fā)現(xiàn)的由堿性品紅、三聚乙醛、濃鹽酸配制而成。一、試劑配制Gomori醛-復(fù)紅染液：70%乙醇100ml，堿性品紅0.5g，三聚乙醛1ml，濃鹽酸1ml。注意：先將堿性品紅溶于乙醇中，然后加入三聚乙醛和濃鹽酸，靜置1-2d，待溶液變?yōu)樯钭仙?，過濾置于冰箱待用。 32三、制作過程1、取皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干。2、放在甲醛-乙醇固定液內(nèi)固定5min；3、水洗3min；4、置于醛-復(fù)紅染液中，室溫下染色5min；5、水洗5min；6、置伊紅染液中，染色30s；7、常規(guī)脫水、透明、封片。四、結(jié)果 膠原纖維為紅色，長帶狀，波浪狀走行； 彈性纖維為紫色，細絲

12、狀，直行，末端卷曲。二、取材 皮下組織3334甲苯胺藍染色顯示肥大細胞肥大細胞內(nèi)含粗大的嗜堿性、異染性的水溶性顆粒，顆粒內(nèi)含有組胺、肝素等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖類，能夠與甲苯胺藍、美籃、中性紅、硫堇等染料結(jié)合。 351、取材 皮下組織2、固定 Carnoy液 或 10%中性福爾馬林液 皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干后固定， 或石蠟切片，冰凍切片更好3、染液配制甲苯胺藍溶液：甲苯胺藍0.2g 60%乙醇100ml 混勻即可反復(fù)使用。364、染色過程（1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水；（2）入甲苯胺藍溶液染色，室溫10-30min；（3）蒸餾水洗；（4）丙酮或100%

13、乙醇脫水兩次，各2min；（5）二甲苯透明，樹膠封固。5、結(jié)果 肥大細胞顆粒呈紫色，核淺藍色。3738胰島內(nèi)分泌細胞Massons三色染色法胰島在胰尾部分布較多，胰島細胞由A、B、D、PP四種細胞組成，細胞間有豐富的毛細血管。用 Massons，Mallory 等特殊染色 方法可區(qū)別A、B、D細胞。1、取材 胰腺2、固定 ZenkerBouin10%甲醛 393、染液配制（1）麗春紅酸性品紅液： 麗春紅 0.7g，酸性品紅0.4g，冰醋酸 1ml， 蒸餾水99ml， 用1%的冰醋酸 溶解麗春紅和酸性品紅。（2）2%亮綠液：亮綠2g，冰醋酸 2ml 蒸餾水98ml， 用2%冰醋酸溶解亮綠。404

14、、染色程序（1）切片脫蠟至水；（2）入0.5%碘乙醇5-10min， 自來水洗，蒸餾水洗；（3）入0.5%硫代硫酸鈉3-5min；（4）Weigert 鐵蘇木精10-20min，自來水洗；（5）1%鹽酸乙醇分化，自來水洗藍化； 41（6）入麗春紅酸性品紅液3-5min，蒸餾水速洗；（7）入1%磷酸鉬水溶液5min；（8）傾去磷酸鉬，直接用2%亮綠液染3-5min；（9）0.5%冰醋酸沖洗切片，將亮綠全部洗掉；（10）95%乙醇，無水酒精脫水， 二甲苯透明，樹膠封固。 425、結(jié)果 A 細胞染成紅色，位于胰島周邊； B細胞染成紫紅色，位于胰島中央； D細胞染成綠色，位于A 細胞與B細胞之間。6、

15、注意 用10%甲醛固定， 再用重鉻酸鉀液處理， 也獲得較好效果。4344甲綠-派若寧染色顯示DNA和RNA染色原理：甲綠和派若寧是堿性染料， 染色中甲綠-派若寧染色與 DNA和RNA的聚合程度有關(guān)。甲綠與聚合程度高的DNA親和力較強；派若寧與聚合程度低的RNA有親和力。一、固定 ZenkerCarnoy (4) 45二、染液配制1、2%甲綠水溶液： 甲綠2g，蒸餾水100ml甲綠提純法：將甲綠溶解后，放入分液漏斗中，加等量的純氯仿洗，充分搖蕩數(shù)分鐘，靜置，待液體分層，放掉下層紫色氯仿液。按此法反復(fù)洗，直至洗不下紫色為止，需洗5次左右。4保存。2、2%派若寧水溶液： 派若寧 2g，蒸餾水100m

16、l此液提純，應(yīng)按甲綠方法進行。 463、醋酸緩沖液（pH值4.8）： 0.2mol/L 醋酸 41ml， 0.2mol/L醋酸鈉 59ml。4、甲綠-派若寧染液： 2%甲綠提純液 7.5 ml， 2%派若寧提純液 12.5ml， 醋酸緩沖液 30ml。此液用前配制。 47三、染色程序1、切片脫蠟入水；2、切片入甲綠-派若寧染液5-10min；3、濾紙快速吸干，純丙酮速洗分色；4、丙酮二甲苯混合液（1:1）速洗2次5、二甲苯透明，樹膠封固。四、染色結(jié)果 DNA呈藍綠色，RNA 呈紅色。48 蘇木精本身不是染料，不能單獨使用，因為對組織的親和力很小。蘇木精必須氧化成蘇木紅才能染色，常用的氧化劑如：