HIV艾滋病抗體實(shí)室檢測(cè)方法HIV上崗證培訓(xùn) 課件

1、艾滋病抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要內(nèi)容HIV檢測(cè)一般情況：窗口期、檢測(cè)樣本及流程關(guān)于樣本實(shí)驗(yàn)室操作：采集、處理、檢測(cè)、轉(zhuǎn)運(yùn)常用篩查方法艾滋病檢測(cè)意義艾滋?。河绊懭祟?lèi)健康的全球性災(zāi)難我國(guó)艾滋病的流行形勢(shì)也日趨嚴(yán)峻據(jù)估算，我國(guó)大約只有10%艾滋病病毒感染者被發(fā)現(xiàn)，其余90%處于未知狀態(tài)，這對(duì)相關(guān)的預(yù)防、治療和關(guān)懷工作帶來(lái)極大挑戰(zhàn)要找到尚未發(fā)現(xiàn)的感染者，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作必不可少感染HIV后的血清學(xué)變化HIV RNA濃度抗體感染1周 2周 6周 12周 -年窗口期窗口期：機(jī)體感染HIV到能檢出抗體之間的時(shí)期 第三代HIV抗體檢測(cè)試劑盒能使大部分感染者在4-8周后檢測(cè)出HIV抗體如果到12周（即3個(gè)月）仍檢測(cè)不

2、出抗體，基本可以排除HIV感染，對(duì)抗體檢測(cè)呈不確定反應(yīng)或高危行為后高度懷疑有感染危險(xiǎn)者，可再隨訪(fǎng)3個(gè)月后復(fù)檢。必要時(shí)可做HIV-1 p24抗原或HIV核酸檢測(cè)作為輔助診斷檢測(cè)樣品： 血液、組織液、排泄物、組織、器官、精液以及有關(guān)血液制品、生物組織或其它物品等 進(jìn)行艾滋病病毒HIV或其相應(yīng)標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，包括HIV分離、抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)等目前用于HIV診斷的常規(guī)方法為血液中HIV抗體檢測(cè)，我國(guó)目前檢測(cè)血液中HIV抗體的常規(guī)檢測(cè)程序分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）和確認(rèn)試驗(yàn) HIV抗體篩查實(shí)驗(yàn)流程圖樣本陽(yáng)性反應(yīng)一陰一陽(yáng)陰性反應(yīng)篩查檢測(cè)均陽(yáng)性反應(yīng)重復(fù)檢測(cè)均陰性反應(yīng)送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)陰

3、性報(bào)告篩查試劑原有試劑加另外一種篩查試劑設(shè)備要求主要儀器設(shè)備包括 生物安全柜、離心機(jī)、酶標(biāo)讀數(shù)儀、洗板機(jī)、移液器、溫箱/水浴箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器所用的儀器應(yīng)該校準(zhǔn)，每次使用后應(yīng)做記錄為保證人員安全，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的耗材最好使用塑料制品標(biāo)本要求1種類(lèi)：血清或血漿(肝素、枸櫞酸鈉或EDTA抗凝)。2量： 靜脈血2ml，常規(guī)分離血清或血漿。 3. 3000轉(zhuǎn)分離心10分鐘。4保存：分離后7d之內(nèi)測(cè)定的血清或血漿標(biāo)本可放置于 28C保存，超過(guò)7d在-20C保存。試劑要求我國(guó)規(guī)定HIV抗體篩查試劑必須是：HIV-1/2混合型經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)批批檢合格在有效期內(nèi)推薦使用臨床質(zhì)量評(píng)估敏感性和特

4、異性高的試劑 （）常用篩查方法目前，國(guó)內(nèi)常用的HIV抗體篩查試驗(yàn)方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顆粒凝集試驗(yàn)（PA）快速試驗(yàn)雙抗原夾心法原理固相包被抗原待測(cè)抗體（IgG、IgM）酶標(biāo)記抗原底物試劑盒組成（雙抗原夾心法ELISA）1.HIV酶標(biāo)板2.HIV-1型陽(yáng)性對(duì)照 3.HIV-2型陽(yáng)性對(duì)照 4.HIV陰性對(duì)照 5.HIV酶標(biāo)試劑 6.濃縮洗滌液 7.顯色劑A液 8.顯色劑B液 9.終止液操作程序 - 1 閱讀標(biāo)準(zhǔn)操作程序，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作將試劑盒及樣品放置在室溫半小時(shí)以上1）準(zhǔn)備酶標(biāo)板，小心撕去酶標(biāo)板條上的封條2）配液：將50ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離

5、子水20倍稀釋至1000ml備用。3）編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔、陽(yáng)性對(duì)照1型,2型各1孔、空白1孔。4）加樣：分別在相應(yīng)孔中加入加入100 l待檢樣品及陰、陽(yáng)性對(duì)照、外部質(zhì)控對(duì)照。操作程序 - 25）溫育：用封板膜封板后置371溫育601分鐘。 6）洗滌：小心將封板膜揭掉，使用洗板機(jī)吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌5遍，拍干。7）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100l，空白孔除外。8）溫育：用封板膜封板后置371溫育301分鐘。9)洗滌：小心將封板膜揭掉，使用洗板機(jī)吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液充分洗滌5遍，最后一次盡量拍干。操作程序 - 310）顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50l，輕輕

6、振蕩混勻，用封板膜封板后置371避光顯色301分鐘。12）測(cè)定：每孔加終止液50l，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，可不設(shè)空白），在15分鐘內(nèi)測(cè)定各孔OD值。13）用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，打印結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷（1） 檢查陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的OD值是否符合要求，判斷本次實(shí)驗(yàn)是否成立，并計(jì)算cut off值結(jié)果判定:1.陰性對(duì)照的正常范圍： 正常情況下，陰性對(duì)照孔OD值0.10。2.陽(yáng)性對(duì)照的正常范圍： 正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔OD值0.80。3.臨界值（CUTOFF）計(jì)算： 臨界值=陰性對(duì)照孔OD均值Nc + 0.12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷（2）4.陽(yáng)性判定：樣品OD值臨界值（C

7、UTOFF）者為HIV 抗體陽(yáng)性 （注意：初試陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)重新取樣進(jìn)行雙孔復(fù)檢，復(fù)試陽(yáng)性者應(yīng)按“全國(guó)HIV檢測(cè)管理規(guī)范”送HIV確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)）。5.陰性判定：樣品OD值臨界值（CUTOFF）者為HIV抗體陰性。質(zhì)控要求 一.室內(nèi)質(zhì)控：1. 在每次HIV實(shí)驗(yàn)中必須包含內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控血清（試劑盒配套質(zhì)控）: HIVI抗體、HIV2抗體陽(yáng)性質(zhì)控、HIV陰性質(zhì)控及外部對(duì)照質(zhì)控血清（自制或購(gòu)買(mǎi)）。2.所有質(zhì)控品與標(biāo)本同時(shí)加入HIV試劑的微孔板內(nèi)，最終質(zhì)控結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果可報(bào)告；否則應(yīng)重新檢測(cè)標(biāo)本。 檢測(cè)過(guò)程中的問(wèn)題及對(duì)策ELISA實(shí)驗(yàn)所有的孔均無(wú)色漏加陽(yáng)性對(duì)照酶標(biāo)記物失效底物失效：應(yīng)避光保存酶聯(lián)板抗原失效ELISA實(shí)驗(yàn)所有的孔均顯色洗板不徹底，孔內(nèi)殘留未結(jié)合的酶標(biāo)記物。容器不清潔，有殘留物質(zhì)：酶受污染。底物失效，在加入之前就已經(jīng)顯色。HIV抗體篩查檢測(cè)及報(bào)告程序1.篩查（-） 出具“HIV抗體陰性”報(bào)告2.篩查