SOD的初步論文教學(xué)提綱

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。SOD的初步論文專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)綜合實(shí)驗(yàn)題目:胡蘿卜中SOD的提取及活力測(cè)定學(xué)院:化學(xué)化工學(xué)院專(zhuān)業(yè):生物工程班級(jí):1101學(xué)號(hào):201106030132學(xué)生姓名:程晶晶指導(dǎo)教師：張何完成日期：2014年1月2日專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)綜合實(shí)驗(yàn)任務(wù)書(shū)院部：化學(xué)化工專(zhuān)業(yè)：生物工程班級(jí)：1101姓名：程晶晶專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)綜合實(shí)驗(yàn)題目：胡蘿卜中SOD的提取及活力測(cè)定專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)綜合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)要求：本實(shí)驗(yàn)建立了鄰苯三酚自氧化對(duì)胡蘿卜中SOD測(cè)活方法的改進(jìn)條件，并對(duì)不同方法提取的胡蘿卜SOD樣液進(jìn)行測(cè)活。結(jié)果表明：胡蘿卜中含有豐富的SOD，但是

2、加工過(guò)程中溫度對(duì)SOD活力影響很大。為胡蘿卜的加工方法的選擇提供參考。對(duì)于果蔬中的超氧化物歧化酶有數(shù)種的提純技術(shù)和活力測(cè)定方法，在工藝研究或?qū)嶋H生產(chǎn)中，需要結(jié)合實(shí)際需求，制定合理的提純方案，選擇合適的測(cè)活方法。實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排：2013年12月16日至1014年1月2日第16周根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并準(zhǔn)備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)預(yù)備工作；根據(jù)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第17、18周根據(jù)方案進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。四.主要參考文獻(xiàn)1陶靜，趙華，于會(huì)永.玉米超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展J.糧食與飼料工業(yè)，2005（4）：26-27.2孫永君.大蒜中SOD的提取研究J化學(xué)與生物工程，2005（10）

3、：23-25.3鄒國(guó)林.一種SOD測(cè)定方法鄰苯三酚自氧化法的改進(jìn)J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展1986（4）：71指導(dǎo)教師：張何教研室主任：謝濤教學(xué)院長(zhǎng)：陳建芳2014年1月2日目錄TOCo1-3hzuHYPERLINKl_Toc3455189981前言PAGEREF_Toc345518998h11.1SOD的發(fā)現(xiàn)11.2SOD的產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟.11.3SOD的研究現(xiàn)狀.2HYPERLINKl_Toc3455189991.4果蔬中的SOD2HYPERLINKl_Toc3455190001.5鄰苯三酚自氧化法3HYPERLINKl_Toc3455190011.6課題概述4HYPERLINKl_Toc345

4、5190022試驗(yàn)部分4HYPERLINKl_Toc3455190032.1試驗(yàn)藥品4HYPERLINKl_Toc3455190042.2試驗(yàn)儀器5HYPERLINKl_Toc3455190052.3試驗(yàn)原理與方法5HYPERLINKl_Toc3455190062.3.1SOD的檢測(cè)方法5HYPERLINKl_Toc3455190072.3.2鄰苯三酚自氧法測(cè)定SOD的活力6HYPERLINKl_Toc3455190092.4試驗(yàn)步驟6HYPERLINKl_Toc3455190102.4.1胡蘿卜中SOD的提取6HYPERLINKl_Toc3455190112.4.2胡蘿卜中SOD的活力測(cè)定7

5、HYPERLINKl_Toc3455190133實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論7HYPERLINKl_Toc3455190143.1SOD的提取分析7HYPERLINKl_Toc3455190153.2SOD活力測(cè)定的分析8HYPERLINKl_Toc3455190163.2.1不同的提取方案對(duì)SOD提取的影響8HYPERLINKl_Toc3455190173.2.2胡蘿卜中SOD測(cè)定結(jié)果8HYPERLINKl_Toc3455190224結(jié)論9HYPERLINKl_Toc345519023參考文獻(xiàn)101前言1.1SOD的發(fā)現(xiàn)神秘的生命原動(dòng)力SOD1938年，英國(guó)Mann等人首次從小牛血液中分離出一種含銅的

6、藍(lán)綠色蛋白質(zhì)。1953年又有科學(xué)家從馬膽中分離出相似的蛋白質(zhì)，但當(dāng)時(shí)他們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)的生理活性。直到1968年，美國(guó)人Mccord在Fridovich指導(dǎo)下，從牛的紅細(xì)胞中提取出一種定名為超氧化物歧化酶的活性物質(zhì)SOD。SOD是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，它具有特殊的生理活性，能夠分出一個(gè)電子給自由基，使自由基變成無(wú)害物質(zhì)。所以它是生物體內(nèi)最重要的自由基清除劑,是人類(lèi)對(duì)抗自由基的第一道防線。事實(shí)證明，SOD的缺少和活性降低是人類(lèi)生老病死的根本原因，補(bǔ)充SOD可以達(dá)到預(yù)防和治療各種疾病，延緩衰老，防癌的目的。1.2SOD產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟全國(guó)SOD產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟（原名全國(guó)SOD應(yīng)用開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)化聯(lián)盟，后曾一度

7、更名為中國(guó)SOD生產(chǎn)應(yīng)用聯(lián)盟）始創(chuàng)于2009年10月，是由部分有志于發(fā)展壯大我國(guó)SOD應(yīng)用開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)化事業(yè)的單位發(fā)起，自愿結(jié)合組成的民間社團(tuán)。經(jīng)有關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)，目前正式掛靠中國(guó)藥學(xué)會(huì)生化與生物技術(shù)藥物專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、中國(guó)保健協(xié)會(huì)保健食品工作委員會(huì)和中國(guó)食品工業(yè)協(xié)會(huì)營(yíng)養(yǎng)指導(dǎo)工作委員會(huì)。長(zhǎng)期以來(lái)，由于SOD研究還不夠深入，各生產(chǎn)單位生產(chǎn)規(guī)模偏小，彼此互不溝通，各自為政，沒(méi)有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法，限于分散微薄的實(shí)力，既影響了SOD生產(chǎn)技術(shù)、產(chǎn)品質(zhì)量的提高，也阻礙了SOD產(chǎn)品宣傳力度和銷(xiāo)售市場(chǎng)的開(kāi)拓。為了徹底改變我國(guó)SOD應(yīng)用開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)化事業(yè)停滯不前的現(xiàn)狀，謀求各自企業(yè)的生存發(fā)展，聯(lián)合起來(lái)日益成為許多SOD

8、及其相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)的共同愿望。2009年9月，由中國(guó)藥學(xué)會(huì)生化與生物技術(shù)藥物專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主辦的第六屆全國(guó)SOD學(xué)術(shù)研討會(huì)在江蘇省蘇州市召開(kāi)。許多SOD及其相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)邀出席會(huì)議。在會(huì)上不少企業(yè)表達(dá)了聯(lián)合起來(lái)共謀發(fā)展的熱切期盼。僅僅時(shí)隔一月，2009年10月，由中國(guó)藥學(xué)會(huì)生化與生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主辦的SOD開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略研討會(huì)緊接著在首都北京市舉行。全國(guó)SOD應(yīng)用開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)化聯(lián)盟應(yīng)運(yùn)而生，正式創(chuàng)建。聯(lián)盟的宗旨是：組織集中各方力量，充分發(fā)揮各自?xún)?yōu)勢(shì)，環(huán)繞SOD及其相關(guān)產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)制造、市場(chǎng)營(yíng)銷(xiāo)等方面，為成員單位服務(wù)，在自愿的基礎(chǔ)上，為它們牽線搭橋，采取靈活多樣的方式，發(fā)展雙邊、多邊互利共贏的

9、協(xié)作，達(dá)到共同發(fā)展的目的，從而推動(dòng)我國(guó)SOD及其相關(guān)產(chǎn)品、產(chǎn)業(yè)做大做強(qiáng)，產(chǎn)品走遍全國(guó)，邁向世界，為促進(jìn)科學(xué)發(fā)展，構(gòu)建和諧社會(huì)，保障人類(lèi)健康作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。1.3SOD的研究現(xiàn)狀目前國(guó)內(nèi)外已對(duì)SOD的機(jī)理、純化、應(yīng)用作了大量的研究。但注意力大都集中在以動(dòng)物血液為來(lái)源制取SOD方面上。對(duì)植物SOD的提取雖也有不少研究，但僅停留在初步驗(yàn)證階段。國(guó)外SOD主要應(yīng)用于醫(yī)療、保健方面，有以動(dòng)物血液及內(nèi)臟為原料制取SOD的報(bào)導(dǎo)，但存在著成本高、含有致熱因子等缺陷，因此，適用范圍極為有限。尤其是近年來(lái)受“瘋牛病”的影響，許多國(guó)家和地區(qū)抵制以動(dòng)物血液及內(nèi)臟為原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在國(guó)際市場(chǎng)

10、上極為緊缺。因此開(kāi)發(fā)植物資源提取SOD，以安全性極高且來(lái)源豐富、價(jià)格低廉的植物原料制取超氧化物歧化酶，創(chuàng)意新穎，其產(chǎn)品必將以其安全性、優(yōu)異的品質(zhì)及低成本等特點(diǎn)在國(guó)內(nèi)、國(guó)際市場(chǎng)上成為走俏商品，因此可以預(yù)測(cè)市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。1.4果蔬中的SOD超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD)，別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)：SOD。SOD是一種源于HYPERLINK/view/126614.htmt_blank生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在HYPERLINK/view/1386.htmt_blank新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效

11、果。超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC,SOD）是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開(kāi)始算起，人們對(duì)SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過(guò)氧陰離子發(fā)生HYPERLINK/view/499527.htmt_blank歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。超氧物歧化酶（SuperoxideDismutase簡(jiǎn)稱(chēng)SOD）是一種新型酶制劑。它在生物界的分布極廣，幾乎從動(dòng)物到植物，甚至從人到單細(xì)胞生物，都有它的存在。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃

12、圾清道夫。超氧化物歧化酶（SOD）為HYPERLINK/view/2721710.htmt_blank自由基清除劑，它廣泛存在于HYPERLINK/view/280726.htmt_blank生物體的各種組織中，能清除自由基O2（超氧陰離子自由基），而O2具有細(xì)胞毒性，可使HYPERLINK/view/2819822.htmt_blank脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷細(xì)胞膜，引起炎癥，腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機(jī)體衰老。超氧化物歧化酶（SOD）正常值酶速率法（37）：血清：242620U/L；紅細(xì)胞：53757975g/gHbHYPERLINK/view/1310157.htmt_blank鄰苯三酚法

13、健康搜索：心?。?00.3406.3U/g；紅細(xì)胞健康搜索：15672241U/g。聯(lián)大茴香胺法：心?。?7452231U/g；紅細(xì)胞：29064654U/g超氧化物歧化酶（SOD）臨床意義超氧化物歧化酶（SOD）為自由基清除劑，它廣泛存在于HYPERLINK/view/280726.htmt_blank生物體的各種組織中，能清除自由基O2（超氧陰離子自由基），而O2具有細(xì)胞毒性，可使脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷細(xì)胞膜，引起炎癥，腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機(jī)體衰老。SOD類(lèi)型：超氧化物歧化酶按其所含金屬HYPERLINK/view/433138.htmt_blank輔基不同可分為三種，第一種是含銅（

14、Cu）鋅（Zn）金屬輔基的稱(chēng)（Cu.ZnSOD），最為常見(jiàn)的一種酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是是含錳（Mn）金屬輔基的稱(chēng)（MnSOD），呈紫色，存在于HYPERLINK/view/32163.htmt_blank真核細(xì)胞的線粒體和HYPERLINK/view/32154.htmt_blank原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含鐵（Fe）金屬輔基的稱(chēng)（FeSOD），呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。超氧物歧化酶(SuperoxideDismutase簡(jiǎn)稱(chēng)SOD)是一種新型酶制劑,它在生物界的分布極廣,幾乎從人到細(xì)胞,從動(dòng)物到植物,都有它的存在。原多從牛血中提取，1997年歐盟禁止使用動(dòng)物中提取的HYP

15、ERLINK/view/18104.htmt_blankSOD。SOD是超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)的英文縮寫(xiě),是一種含有金屬元素的活性蛋白酶,是目前生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中世界級(jí)的高、尖、精課題。超氧化物歧化酶（SOD）目前世界范圍內(nèi)的開(kāi)發(fā)，大都從動(dòng)物血里提取，不但代價(jià)昂貴，而且動(dòng)物性SOD的排他性、不易常溫保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潛在危險(xiǎn)，所以HYPERLINK/view/603399.htmt_blank國(guó)際衛(wèi)生組織呼吁：立刻停止動(dòng)物性SOD的使用。我國(guó)傳統(tǒng)工業(yè)多從動(dòng)物的血液和內(nèi)臟器官中提取SOD，但這類(lèi)原料來(lái)源有限，成分復(fù)雜，在儲(chǔ)存、運(yùn)輸方

16、面存在諸多不便，因此導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜化，使生產(chǎn)成本大幅度上升。相比而言，人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖吖泻胸S富的SOD，資源豐富、易于處理，生產(chǎn)工藝得到簡(jiǎn)化，故成本低廉，且使用安全性高。所以，尋找富含高活力SOD的果蔬并從中提純SOD，開(kāi)發(fā)抗癌產(chǎn)品具有深遠(yuǎn)意義。1.5鄰苯三酚自氧化法SOD的活力測(cè)定方法很多，常見(jiàn)的有化學(xué)法、免疫法和HYPERLINK/search?word=%E7%AD%89%E7%94%B5%E7%82%B9&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有色中間物和O2-，利用S

17、OD分解而間接推算酶活力。在化學(xué)方法中，最常用的有HYPERLINK/search?word=%E9%BB%84%E5%98%8C%E5%91%A4&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，HYPERLINK/search?word=%E5%8C%96%E5%AD%A6%E5%8F%91%E5%85%89&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank化學(xué)發(fā)光法，HYPERLINK/search?word=%E8%82%BE%E4%B8%8A%E8%85%BA%E7%B4%A0&fr=qb_search_exp&ie=utf8t

18、_blank腎上腺素法，NBT-還原法，HYPERLINK/search?word=%E5%85%89%E5%8C%96%E5%AD%A6&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank光化學(xué)擴(kuò)增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用。HYPERLINK/search?word=%E5%8C%96%E5%AD%A6%E5%8F%91%E5%85%89&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank化學(xué)發(fā)光法和HYPERLINK/search?word=%E5%85%89%E5%8C%96%E5%AD%A6&fr=qb_search_ex

19、p&ie=utf8t_blank光化學(xué)擴(kuò)增法不適用于測(cè)定Mn-SOD，但對(duì)于Cu/Zn-SOD反應(yīng)極靈敏。Cyte還原法用于Mn-SOD活力測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。但專(zhuān)一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實(shí)際應(yīng)用受到限制。在一般情況下，SODHYPERLINK/search?word=%E9%85%B6%E6%B4%BB%E6%80%A7&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank酶活性測(cè)定只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化方法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開(kāi)始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變

20、成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。這里測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過(guò)程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成HYPERLINK/search?word=%E7%BA%BF%E6%80%A7%E5%85%B3%E7%B3%BB&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過(guò)計(jì)算即可求出SOD的HYPERLINK/search?word=%E9%85%B6%E6%B4%BB%E6

21、%80%A7&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank酶活性。HYPERLINK/search?word=%E9%85%B6%E6%B4%BB%E5%8A%9B%E5%8D%95%E4%BD%8D&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank酶活力單位定義：在25恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰HYPERLINK/search?word=%E8%8B%AF%E9%85%9A&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank苯酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)HYPERLINK/search?word=%E9%85%B6%E6%B4%

22、BB%E5%8A%9B%E5%8D%95%E4%BD%8D&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank酶活力單位。1.6課題概述SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敵，是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手，是生命健康之本。超氧化物歧化酶（SOD）目前世界范圍內(nèi)的開(kāi)發(fā)，大都從動(dòng)物血里提取，不但代價(jià)昂貴，而且動(dòng)物性SOD的排他性、不易常溫保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潛在危險(xiǎn)，所以HYPERLINK/view/603399.htmt_blank國(guó)際衛(wèi)生組織呼吁：立刻停止動(dòng)物性SOD的使用。通過(guò)查閱資料了解到SOD屬于金屬蛋白酶，按照

23、結(jié)合金屬離子種類(lèi)不同，該酶有以下三種：含銅與鋅HYPERLINK/lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=6318585&ss_c=ssc.citiao.link超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)、含錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和含鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。三種SOD都催化超氧化物陰離子自由基，將之歧化為過(guò)氧化氫與氧氣。它廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物以及一些微生物中。許多資料表明，SOD對(duì)人體有著廣泛的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)建立了鄰苯三酚自氧化對(duì)胡蘿卜中SOD測(cè)活方法的改進(jìn)條件，并對(duì)不同方法提取的胡蘿卜SOD樣液進(jìn)行測(cè)活。為工藝研究或?qū)嶋H生產(chǎn)中，在結(jié)合實(shí)際需求前提

24、條件下，為制定合理的提純方案，提供了合適的測(cè)定方法。2試驗(yàn)部分2.1試驗(yàn)藥品藥品名稱(chēng)純度生產(chǎn)廠家Hcl分析純廣東汕頭市光華化學(xué)廠Tris分析純廣東汕頭市光華化學(xué)廠EDTA-2Na分析純廣東汕頭市光華化學(xué)廠鄰苯三酚分析純廣東汕頭市光華化學(xué)廠磷酸氫二鈉分析純廣東汕頭市光華化學(xué)廠磷酸二氫鈉分析純天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司胡蘿卜市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)2.2試驗(yàn)儀器名稱(chēng)廠商高速離心機(jī)賽特湘儀高速組織搗碎機(jī)新加坡AppliedBiosystems公司紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)天能科技（上海）有限公司DK-8D型電熱恒溫水槽鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司FA1104A電子天平上海精天電子儀器有限公司SL磁力輔助加樣槍美國(guó)RAININ

25、2.3試驗(yàn)原理與方法2.3.1SOD的檢測(cè)方法常用的幾種SOD檢測(cè)方法：1分光光度法分光光度法是最為典型的檢測(cè)SOD的方法，這種方法使用了細(xì)胞色素C(cytochromeC)或者氮藍(lán)四唑（NBT）（圖1）。用cytochromeC的還原法來(lái)檢測(cè)O2-是因?yàn)檫€原后的cytochromeC會(huì)生成紫色的染料（圖解2）。這是自SOD被發(fā)現(xiàn)以來(lái)最常用的方法。Cyt(Fe)+O2-Cyt(Fe)+O2因?yàn)閏ytochromeC很容易被NADPH還原酶或者其他的還原劑所還原，因此必須要考慮樣品的污染因素。而且，這種方法需要每隔1.5分鐘就要察看一下，因此不適合做大批量的實(shí)驗(yàn)。NBT法的原理是生成不溶于水的藍(lán)

26、色甲臢染料(lmax:560nm)去和O2-反應(yīng)。這種染料不溶于水，在做長(zhǎng)時(shí)程分析時(shí)會(huì)生成不均一的沉淀物，從而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。為了得到水溶性的甲臢染料，許多改良后的方法如添加BSA被人們所采用。但是，添加了不必要的蛋白質(zhì)會(huì)使數(shù)據(jù)分析變得十分復(fù)雜，而且NBT會(huì)被多種還原劑所還原。NBT的這種特性被用于酮胺的檢測(cè)，酮胺可以作為糖尿病的標(biāo)記物并且是Maillard反應(yīng)的中間體。NBT法的最大缺點(diǎn)是即使加入過(guò)量的SOD也不能獲得100%的抑制率，原因是NBT會(huì)與黃嘌呤氧化酶直接反應(yīng)。2化學(xué)發(fā)光法用于O2-檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光探針同樣也能用于SOD的檢測(cè)，這種探針?lè)譃?種，一種是光澤精，另一種是熒光素衍

27、生物（MCLA）。這種化學(xué)發(fā)光反應(yīng)對(duì)pH有高度的依賴(lài)性。例如，光澤精只有在pH9.0或者更高處會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的化學(xué)光。因此，在生理的pH條件下用這種方法檢測(cè)SOD是不可行的。另一方面，MCLA在生理?xiàng)l件下能夠發(fā)出較強(qiáng)的化學(xué)熒光，因此可以用于人腦的Cu,Zn-SOD活性的檢測(cè)。但是，MCLA不適合用作SOD檢測(cè)的探針，因?yàn)樗粏螁魏蚈2-反應(yīng)，還會(huì)和單質(zhì)氧反應(yīng)。而且MCLA與溶解氧反應(yīng)后會(huì)發(fā)出化學(xué)光，轉(zhuǎn)移的金屬離子還會(huì)加速氧化反應(yīng)。3.電子自旋共振（ESR）光譜法在室溫下，溶液中O2-的ESR信號(hào)不能直接被檢測(cè)出，但能夠通過(guò)自旋捕捉法間接獲得。最常見(jiàn)的誘捕劑是5,5-dimethyl-1-pyrro

28、lineN-oxide(DMPO)。由于O2-誘捕DMPO會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特殊的光譜圖，因此ESR法是O2-檢測(cè)的方法中特異性最好的一種。然而，DMPO與O2-間的二階速度常數(shù)比O2-自發(fā)反應(yīng)常數(shù)相對(duì)要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：終濃度為0.45M）。這樣，每次試驗(yàn)所要用的DMPO將花去大筆的經(jīng)費(fèi)。這種方法的另一個(gè)問(wèn)題是在實(shí)驗(yàn)中需要一套較為昂貴的ESR設(shè)備。4利用水溶性四唑鹽檢測(cè)SOD的新方法為了克服上述的諸多問(wèn)題，我們?cè)谧鯯OD檢測(cè)時(shí)需要考慮如下幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)設(shè)備要簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，pH靈敏度要低，對(duì)O2-有高度的特異性。如果用分光光度計(jì)作為一種簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的話，就需要一種與cytoc

29、hromeC和NBT相似的比色探針。檢測(cè)中最重要的一點(diǎn)是在沒(méi)有其他物質(zhì)干擾的情況下，測(cè)定出SOD100%的抑制率。為了得到一種新的檢測(cè)SOD的方法，我們對(duì)還原后能生成水溶性甲臢的四唑鹽作了一系列的實(shí)驗(yàn)。2.3.2鄰苯三酚自氧法測(cè)定SOD的活力SOD的活力測(cè)定方法很多，常見(jiàn)的有化學(xué)法、免疫法和HYPERLINK/search?word=%E7%AD%89%E7%94%B5%E7%82%B9&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有色中間物和O2-，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學(xué)

30、方法中，最常用的有HYPERLINK/search?word=%E9%BB%84%E5%98%8C%E5%91%A4&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，HYPERLINK/search?word=%E5%8C%96%E5%AD%A6%E5%8F%91%E5%85%89&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank化學(xué)發(fā)光法，HYPERLINK/search?word=%E8%82%BE%E4%B8%8A%E8%85%BA%E7%B4%A0&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank腎上腺素法，NBT-

31、還原法，HYPERLINK/search?word=%E5%85%89%E5%8C%96%E5%AD%A6&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank光化學(xué)擴(kuò)增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用。HYPERLINK/search?word=%E5%8C%96%E5%AD%A6%E5%8F%91%E5%85%89&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank化學(xué)發(fā)光法和HYPERLINK/search?word=%E5%85%89%E5%8C%96%E5%AD%A6&fr=qb_search_exp&ie=utf8t_blank

32、光化學(xué)擴(kuò)增法不適用于測(cè)定Mn-SOD，但對(duì)于Cu/Zn-SOD反應(yīng)極靈敏。Cyte還原法用于Mn-SOD活力測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。但專(zhuān)一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實(shí)際應(yīng)用受到限制。改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用。1.在一般情況下，SOD酶活性測(cè)定只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化方法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開(kāi)始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。這里測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過(guò)程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間

33、維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過(guò)計(jì)算即可求出SOD的酶活性。2.酶活力單位定義：在25恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。2.4試驗(yàn)步驟2.4.1胡蘿卜中SOD的提取方法A:100g胡蘿卜加少量水在組織搗碎機(jī)中高速破碎成勻漿，過(guò)濾；濾渣加適量水提取約3小時(shí)再過(guò)濾；重復(fù)前面操作一次。合并三次過(guò)濾液，即為SOD粗酶液，置4冰箱盡早測(cè)定。方法B：100g胡蘿卜按1g：2-3ml的比例加50mmol/L的磷酸緩沖液，在組

34、織搗碎機(jī)中高速破碎成勻漿，用離心機(jī)15000r/min離心15min,上清液即為SOD粗酶液，置4冰箱及時(shí)測(cè)定。2.4.2胡蘿卜中SOD的活力測(cè)定1、鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定取兩支試管按下表加入25預(yù)熱過(guò)的緩沖液,然后加入預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。試劑空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mm

35、ol/LHCl0.020.0150mmol/L鄰苯三酚-0.012、SOD樣液的活性測(cè)定樣品管取代自氧化管。樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)熱的待測(cè)酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定。試劑空白管（mL）樣品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/LHCl0.02-SOD樣液-0.0150mmol/L鄰苯三酚-0.013實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論3.1SOD的提取分析表1試劑用量試劑試管號(hào)空白對(duì)照01234560.1mol/LTris-Hcl2ml雙蒸水2mlSOD終濃度00.000.250.500.751.001.251.5020mmol/LPR02

36、0ul系統(tǒng)PR濃度00.10mmol/L系統(tǒng)PH8.20.01表2PR的自氧化速率PR自氧化時(shí)間（min）123456OD自氧化速率A(min)0.1330.2250.3140.0780.3920.4620.5253.2SOD活力測(cè)定的分析3.2.1不同的提取方案對(duì)SOD提取的影響表3SOD終濃度對(duì)PR自氧化抑制率之間的關(guān)系SOD終濃度0.000.250.500.751.001.251.50OD抑制率（%）0.392/0.34013.260.29724.230.25535.000.20547.700.16857.140.14565.87標(biāo)準(zhǔn)方程Y=0.0226X-0.0349R=0.9984胡

37、蘿卜中SOD測(cè)定結(jié)果表4胡蘿卜SOD測(cè)定結(jié)果樣品胡蘿卜A胡蘿卜BSOD酶液總量（ml）SOD酶液測(cè)定取樣量(ul)本底吸收值（OD）反應(yīng)液吸光度（OD）抑制率（%，平均值）反應(yīng)液SOD濃度（U/ml）胡蘿卜SOD測(cè)定值（U/g,Fw）300500.1830.46428.240.591402550300.0880.31941.150.903051注：表中“胡蘿卜A”指胡蘿卜經(jīng)“方法A”提取SOD,其他類(lèi)推。4結(jié)論（1）胡蘿卜含有豐富的SOD,不同的SOD提取方法對(duì)其活性影響很大，測(cè)定值相差幾十倍。實(shí)驗(yàn)表明,胡蘿卜在加工過(guò)程中溫度對(duì)SOD活力影響很大，常溫下較長(zhǎng)時(shí)間的處理破壞了SOD的活性（如方法

38、A）;而低溫則能很好的保護(hù)其SOD的活性（如方法C）。（2）在高等植物中，植物體內(nèi)源SOD類(lèi)型主要為Cu、ZnSOD和MnSOD；有資料報(bào)道MnSOD對(duì)溫度比較敏感，而CuSOD則對(duì)溫度比較穩(wěn)定。據(jù)此，我們初步分析胡蘿卜SOD類(lèi)型很可能主要為MnSOD。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)對(duì)胡蘿卜不同貯藏條件SOD活性的測(cè)定結(jié)果，我們建議在胡蘿卜加工利用時(shí)，為了保護(hù)SOD的活性，原料應(yīng)該在低溫條件下貯藏，加工過(guò)程也應(yīng)該盡量在低溫下進(jìn)行。參考文獻(xiàn)1王鋼.自由基與中醫(yī)中藥M.南京：南京大學(xué)出版社，1993.42-492.2江蘇省植物研究所.新華本草綱目（第三冊(cè)）M.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1990,121.3袁勤生.超氧

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