(完整版)熒光定量PCR技術(shù)與常見問題分析課件

1、熒光定量PCR技術(shù)與常見問題分析汪瑾生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心2012.09.26定量PCR是如何工作的熒光定量PCR是什么一種實(shí)時(shí)監(jiān)控目的基因PCR 擴(kuò)增的技術(shù)定量PCR是如何工作的?傳統(tǒng)PCR具有以下基本要素dsDNA模版, primers引物, dNTPs核苷酸, PCR buffer緩沖液, Taq polymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TAC

2、GGAGCTGA與傳統(tǒng)PCR一樣,反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進(jìn)行: 雙鏈DNA模板變性 引物與模板退火 引物延伸 新的擴(kuò)增片段定量PCR是如何工作的?理論上每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)目的基因的數(shù)量都會(huì)增加一倍在PCR混合液中含有熒光物質(zhì)。定量PCR是如何工作的?無論哪個(gè)型號(hào)，所有的熒光定量 PCR儀都有三個(gè)共同的組成部分定量PCR是如何工作的?PCRPCRLots of PCRPCR product隨著擴(kuò)增的進(jìn)行, 熒光信號(hào)會(huì)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加定量PCR是如何工作的?Real-time PCR儀會(huì)記錄每個(gè)循環(huán)經(jīng)過每個(gè)濾光片的熒光信號(hào)變化定量PCR是如何工作的?Cycle 1Filter ASample

3、1Level:為什么要用定量PCR？ 重復(fù)性好 靈敏度高 動(dòng)力學(xué)范圍寬一個(gè)好的定量PCR數(shù)據(jù)1: 重復(fù)性好2: 靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因3: 動(dòng)態(tài)范圍寬兼具重復(fù)性和準(zhǔn)確性的起始模版濃度范圍(越大越好)為什么要用定量PCR？ 快：節(jié)省時(shí)間和勞力（不用電泳檢測）。為什么要用定量PCR？ 安全：不用EB或放射性物質(zhì)定量PCR的化學(xué)原理支持的化學(xué)試劑SYBR Green ITaqManTaqMan 中會(huì)使用到兩段短片段序列，稱為雙向特異引物TaqMan 化學(xué)原理 第三段短片段序列，又稱為探針, 位于序列中間TaqMan 化學(xué)原理 報(bào)告染料Reporter dye淬滅染料Quencher dy

4、e探針標(biāo)記兩種 染料分子TaqMan 化學(xué)原理 Reporter沒有熒光信號(hào)（發(fā)射）能量光 (激發(fā))完整的探針TaqMan 化學(xué)原理 光能然而，如果探針斷裂了TaqMan 化學(xué)原理 Denaturation變性 (95C)TaqMan 化學(xué)原理 Annealing退火 (60C)TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶登場TaqMan 化學(xué)原理 找到引物序列TaqMan 化學(xué)原理 開始延伸 (60C)TaqMan 化學(xué)原理 Extension延伸 (60C)TaqMan 化學(xué)原理 Extension延伸 (60C)TaqMan 化學(xué)原理 ?Extension延伸 (60C)TaqMan 化學(xué)原理 Ta

5、q酶很特別具有核酸外切酶活性，可以吃掉結(jié)合到模板上的DNA片段TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)

6、原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 Taq酶降解探針TaqMan 化學(xué)原理 TaqMan 化學(xué)原理 TaqMan 化學(xué)原理 TaqMan 化學(xué)原理 TaqMan 化學(xué)原理 嗝!TaqMan 化學(xué)原理 SYBR Green I 化學(xué)原理SYBR Green I 染料SYBR Green I 染料SYBR Green I 染料SYBR Green I 染料的缺點(diǎn)非特異結(jié)合任意 雙鏈DNA 定量結(jié)果不準(zhǔn)確非特異性PCR產(chǎn)物信號(hào)使用 熔解曲線Melt curve (Dissociation Curve) 檢查反應(yīng)特異性Temperature FluorescenceMelt curve: 導(dǎo)

7、數(shù)圖譜一個(gè)干凈的峰 = 沒有無關(guān)的產(chǎn)物Temperature FluorescenceMelt curve的雜峰可能是引物二聚體多余的峰是如何產(chǎn)生的? 非特異擴(kuò)增 1、轉(zhuǎn)錄組中錯(cuò)誤的目的基因。 2、引物結(jié)合在正確的序列,但是既檢測基因組DNA又檢測cDNA(由于短的內(nèi)含子,基因組DNA有較高的Tm值)。解決方法：設(shè)計(jì)引物時(shí)至少有一條跨過外顯子的結(jié)合點(diǎn) 引物二聚體到底用哪一種化學(xué)方法呢？TaqMan, 還是 SYBR Green? . . .TaqMan, 還是 . . . SYBR Green I?優(yōu)點(diǎn)更高的特異性 不會(huì)有引物二聚體干擾支持多重?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法易于優(yōu)化缺點(diǎn) 價(jià)格稍貴優(yōu)點(diǎn)價(jià)格

8、便宜大部分基因以及少量樣品均適用缺點(diǎn)特異性稍差必須要做 Melt curves 不支持多重?zé)晒庠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法通常需要優(yōu)化定量PCR的數(shù)學(xué)原理怎樣獲得結(jié)果首先讓我們定義擴(kuò)增曲線的各種參數(shù)。PCR的動(dòng)力學(xué)曲線和四個(gè)階段指數(shù)擴(kuò)增期重復(fù)性準(zhǔn)確性動(dòng)態(tài)范圍3個(gè)階段中最佳時(shí)期只有一個(gè)擴(kuò)增期提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期基 線基線（空白）信號(hào)的產(chǎn)生是由于背景引起的閾 值默認(rèn)閾值=基線（背景）信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差x10怎么獲得結(jié)果第一步：確定Ct值怎么獲得結(jié)果第二步：比較Ct值定量PCR的應(yīng)用絕對(duì)定量相對(duì)定量陰陽性鑒定基因分型定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和流程-絕對(duì)定量和相對(duì)定量定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素 目的基因 樣品 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品

9、監(jiān)控系統(tǒng)故障 陽性對(duì)照 監(jiān)控污染 陰性對(duì)照 校準(zhǔn)生物學(xué)誤差 內(nèi)參(管家基因) 校準(zhǔn)物理誤差 參比熒光 降低隨機(jī)誤差 重復(fù)實(shí)驗(yàn)相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)示例實(shí)驗(yàn)未處理樣本處理后樣本目的基因：Plat1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶颖咎幚砗?，Plat1基因的表達(dá)量有什么變化？實(shí)驗(yàn)流程對(duì)照樣本兩種相對(duì)定量的方法比較Ct（Ct）法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法樣本間目的基因的倍數(shù)關(guān)系兩種方法的區(qū)別 比較Ct (Ct) 法 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法* 已知各個(gè)基因的擴(kuò)增效率 * 每個(gè)基因都要做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線 * 不需要每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線 * 準(zhǔn)確的擴(kuò)增效率計(jì)算 * 簡單, 經(jīng)濟(jì), 通量較高 * 工作量大, 成本高, 通量較低 如何選擇相對(duì)定量的方法如何選擇相對(duì)定量

10、的方法如何選擇相對(duì)定量的方法在EXCEL中制作圖表如何選擇相對(duì)定量的方法在EXCEL中制作圖表斜率0.1比較Ct (Ct) 法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法Ct法必要條件：目的基因和內(nèi)參基因必須有相一致的擴(kuò)增效率，并盡可能接近100%。Ct法如何確認(rèn)擴(kuò)增效率接近100%？每條引物一條標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct法標(biāo)準(zhǔn)曲線可以幫助判定擴(kuò)增效率例如：斜率-3.3說明擴(kuò)增效率接近100%；更小的負(fù)值（如-3.5）說明擴(kuò)增效率小于100%公式：E=10 (-1/斜率) -1Ct法結(jié)果計(jì)算步驟一：內(nèi)參基因均一化樣本差異 Ct目的基因 - Ct目的基因 = Ct步驟二：處理樣本和對(duì)照樣本作比較 Ct處理樣本 - Ct對(duì)照樣本 = Ct步

11、驟三：使用公式計(jì)算 倍數(shù)變化 = 2 -Ct公式含義2 -Ct2 = 循環(huán)間擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物倍增）Ct =處理樣本和對(duì)照樣本之間校正過大循環(huán)數(shù)的變化所以，這個(gè)公式告訴我們對(duì)照樣本和處理樣本之間目的基因的倍數(shù)變化。Ct法計(jì)算示例Ct法計(jì)算示例為了去除樣本間加樣量不同帶來的誤差，需要對(duì)數(shù)據(jù)均一化處理。Ct法計(jì)算示例首先，選擇對(duì)照樣本；接著，均一化對(duì)照樣本；然后，所有樣本和對(duì)照樣本進(jìn)行比較。Ct法計(jì)算示例最后，計(jì)算出倍數(shù)關(guān)系2 Ct。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法每對(duì)引物做一條相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算示例表示倍數(shù)差異絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn) 目的：生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系； 要求： 濃

12、度已知 標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的PCR效率一致，且接近100% 儀器質(zhì)量一致 試劑質(zhì)量一致：模板純度、引物和探針的Tm值、酶活性、緩 沖液成分 反應(yīng)條件一致：循環(huán)參數(shù)相同、同一次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn) Dont: 制備3個(gè)點(diǎn)的2倍標(biāo)準(zhǔn)曲線要求：Do: 制備至少5個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(4 logs) 去除離散的重復(fù)孔，或者有必要時(shí)去除整個(gè)梯度數(shù)據(jù)如何制備標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn) 選擇目標(biāo)提取/PCR 純化測定濃度調(diào)整濃度梯度稀釋 Ct值在17-30之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間 10倍連續(xù)梯度稀釋方法： 1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii 1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii 1v

13、標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv 1v 標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v 注：不可由標(biāo)準(zhǔn)品i分別加不同體積的稀釋緩沖液直接得到標(biāo)準(zhǔn)品ii、iii、iv、v標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率：每個(gè)循環(huán)中靶分子被作為模板利用的百分比。PCR效率的測定常見問題分析1.擴(kuò)增效率為什么達(dá)不到100%主要原因： 樣品不純 擴(kuò)增產(chǎn)物太長 沒有選擇合適的引物退火溫度 引物的設(shè)計(jì)有錯(cuò)配 模板的序列特殊（比如GC含量高） 抑制物的存在2.擴(kuò)增效率為什么會(huì)大于100%主要原因： 背景污染 非特異性擴(kuò)增3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好對(duì)每個(gè)樣品我們都要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)（通常至少為3個(gè)重復(fù)）目標(biāo)是所有復(fù)孔CT

14、值都相近(通常SD值小于0.167)3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好重復(fù)性好3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好重復(fù)性差3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好主要原因 加樣誤差（操作?加樣器?） 沒有將試劑和樣品充分混勻 低拷貝的樣品泊松分布 沒有使用ROX校準(zhǔn)(或者其他校準(zhǔn)孔間誤差的方法)3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好ROX校準(zhǔn) Master Mix中ROX濃度固定 ROX不參與PCR擴(kuò)增，信號(hào)強(qiáng)度只與Mix用量有關(guān) ROX的功能：校準(zhǔn)物理誤差 耗材質(zhì)量：管蓋厚度、透光性能 儀器穩(wěn)定性：孔間批間波動(dòng) 反應(yīng)體系監(jiān)控：蒸發(fā)鹵素?zé)艄庠垂鈱W(xué)系統(tǒng)蓋膜或管蓋管壁光滑性反應(yīng)體積3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好ROX校準(zhǔn)大大改善各拷貝復(fù)樣的重復(fù)性(參比熒光)(報(bào)告熒光)10 ng Sample AWell 1Well 2Rn = Normalization = 報(bào)告熒光 / 參比熒光(這個(gè)normalization是自動(dòng)的)4.其他問題標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好引物特異性不好陰性對(duì)照有擴(kuò)增退火溫度的選擇兩步法還是三步法 日常實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室分區(qū)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋最好使用獨(dú)立的一套移液器使用帶濾芯的吸頭光學(xué)平蓋八聯(lián)管（或96孔