真菌感染試驗(yàn)診斷(同名24)課件

1、第三章真菌感染實(shí)驗(yàn)診斷第一節(jié) 真菌的基本特性 真菌是一大類具有典型細(xì)胞核，不含葉綠素，不分根、莖葉的真核細(xì)胞型微生物。一、真菌的形態(tài)特性 （一）單細(xì)胞真菌呈圓形，如酵母菌。 （二）多細(xì)胞真菌由菌絲和孢子組成， 稱絲狀菌或霉菌。 菌絲和孢子的形態(tài)因菌而異，是鑒定真菌的重要依據(jù)。孢子又分為多種，如葉狀孢子、分生孢子和孢子囊孢子等。 二、真菌菌落特性真菌培養(yǎng)要求不高，常用沙氏(Sabouraud)培養(yǎng)基(含1蛋白胨、 4葡萄糖或麥芽糖、2瓊脂)培養(yǎng)，適宜溫度2228，但深部真菌為37。形成三種菌落，菌落形態(tài)是鑒別真菌的重要依據(jù)。 1酵母型菌落 是單細(xì)胞真菌的菌 落，形態(tài)與細(xì)菌菌落相似，較大， 表面光

2、滑濕潤柔軟、邊緣整齊， 如新生隱球菌。2. 類酵母型菌落 如白假絲酵母菌， 形成假菌絲，伸人培養(yǎng)基中。3霉菌型菌落 是多細(xì)胞真菌的菌 落。菌落呈棉絮狀、絨毛狀，并 產(chǎn)生不同的色素，如皮膚癬菌。第二節(jié) 標(biāo)本采集及檢驗(yàn)程序 一、臨床標(biāo)本的采集 (一)臨床標(biāo)本類別 1皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：毛發(fā)、 指(趾)甲、皮屑等。 2各種分泌物和排泄物：生殖道 分泌物、耳垢、痰、糞便、尿 液等。 3血液和體液：體液包括胸水、 腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。 4膿汁及滲出物。 (二)采集標(biāo)本注意事項(xiàng)1.采集的標(biāo)本要適宜 不同真菌感染 應(yīng)采取不同的臨床標(biāo)本。懷疑為淺 部真菌感染如體癬，應(yīng)刮取病變邊 緣的痂、皮屑，發(fā)癬應(yīng)取病

3、發(fā)。深 部真菌感染應(yīng)取血液、腦脊液、膿 汁等。2在用藥前采集標(biāo)本 一般真菌 標(biāo)本須在用藥前采集，對已用 藥者則需停藥一段時間后再采 集標(biāo)本。3采集的標(biāo)本量要足 血液和腦 脊液標(biāo)本5ml，胸腔液20ml， 皮屑標(biāo)本兩塊，活體組織兩份 (一份送病理科檢查，一份作 鏡檢和培養(yǎng))。4嚴(yán)格無菌操作 并進(jìn)行消毒處理， 尤其是采集血液和腦脊液標(biāo)本， 要避免污染雜菌。5采集標(biāo)本立即送檢 深部真菌標(biāo) 本最長不得超過2h。第三節(jié) 真菌檢驗(yàn) 一、標(biāo)本直接檢查 (一)顯微鏡檢查 直接鏡檢對真菌病的診斷較細(xì)菌更為重要。 許多真菌標(biāo)本不需染色即可直接鏡檢，如癬病 標(biāo)本多用KOH濕片檢查法，即取病發(fā)或病損部位 皮屑、甲屑置

4、于載玻片上，加1滴10-20 KOH 液，然后加蓋玻片并微微加熱，使標(biāo)本組織溶解 透明，在顯微鏡下可觀察到真菌的孢子和菌絲。 直接鏡檢的意義直接鏡檢陽性表示：有診斷意義，如淺部真菌病等；看到的就是真菌的形態(tài)，可確定某 些致病性真菌的屬或種, 如假絲酵 母菌的厚膜孢子等； 判斷某些真菌種的致病性等,如 皮膚癬菌、曲霉等。直接鏡檢也有局限性：陰性結(jié)果不能排除真菌感染；有假陽性結(jié)果。 因此，對直接鏡檢可疑結(jié)果應(yīng) 作復(fù)查或用其他檢驗(yàn)方法鑒定。 (二)抗原檢測常用的方法有膠乳凝集試驗(yàn)、ELISA、半定量放射免疫法。均應(yīng)設(shè)對照，防止發(fā)生假陽性和假陰性。 用膠乳凝集試驗(yàn)檢測標(biāo)本中的白假絲酵母菌甘露聚糖抗原。

5、 用膠乳凝集試驗(yàn)和ELISA檢測血清和腦脊液中的隱球菌多糖莢膜抗原，在治療前檢測非常敏感特異。 用半定量放射免疫法檢測血清、 尿液和腦脊液中莢膜組織胞漿菌循 環(huán)多糖抗原，可快速診斷。二、真菌的分離培養(yǎng)真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的惟一方法。培養(yǎng)真菌的溫度為28，但深部真菌為37。菌落是鑒別真菌的方法。注意以下幾點(diǎn)：菌落性質(zhì)：酵母菌還是霉菌；菌落大小，病原性真菌菌落小， 而條件致病性真菌菌落大；菌落顏色 病原性真菌顏色淡， 污染真菌顏色深；致病性真菌菌落下沉，有時使 培養(yǎng)基開裂；污染性真菌菌落 不下沉,很少引起開裂。三、真菌的生化反應(yīng)用于主要深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。1.糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)

6、37孵育， 觀察糖發(fā)酵情況。 2.同化碳源試驗(yàn) 含菌生理鹽水 與已融化的固體同化碳源培養(yǎng) 基(45)混合，然后在培養(yǎng)基 上分別加糖，置25孵育觀察 結(jié)果。若24h后無變化可重復(fù) 加糖。如能同化周圍有生長圈， 否則無生長。 3.同化氮源試驗(yàn) 同化碳源試 驗(yàn)相同，但需用無氮源的培 養(yǎng)基，不要加糖類，而加入 硝酸鉀。 四、動物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)的目的是分離病原性真菌、 確定真菌菌種的致病性、研究藥物 對真菌的作用等。如假絲酵母菌接 種家兔或小白鼠，腎臟明顯腫脹， 腎皮質(zhì)部位有白色膿瘍。五、核酸檢測 醫(yī)學(xué)真菌的鑒定手段引入了分子生物學(xué)的鑒定方法，從核酸堿基G+C mol分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、

7、Southern印跡分析到脈沖場凝膠電泳(PFGE)、PCR指紋、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段測序等。 （一)G+Cmol分類鑒定法常用熱變性溫度法。原理是DNA加熱變性使堿基氫鍵被打開，雙鏈螺旋變成單鏈，導(dǎo)致核苷酸堿基在260nm紫外吸收明顯增加，完全變成單鏈后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中點(diǎn)值溫度為熱變性溫度（Tm）。若真菌DNA中G+C堿基對含量多，Tm值就高?？芍苯臃从矴 +C堿基對的絕對含量。計(jì)算公式為：G+Cmol=(Tm-53.9)2.44(二)真菌核型的脈沖電泳分析脈沖凝膠電泳技術(shù)(PFGE)解決了真菌大分子DNA的分離技術(shù)難題。原理：PFGE有兩個

8、方向的電場在設(shè)定的脈沖時間里交替變換，使大分子DNA在移動中不斷改變自己的形狀及遷移方向，從而繞過細(xì)小的凝膠孔隙而得以分離。較大的DNA分子泳動慢些，較小的快些，有許多因素影響電泳帶型，分離真菌等大分子量的DNA宜用較低電壓和較長脈沖時間。用PFGE分析真菌核型，可直接比較其遺傳背景,從電泳核型差異中進(jìn)行分類鑒定,又能取得基因結(jié)構(gòu)的基本數(shù)據(jù)，構(gòu)建出大尺度物理圖譜。 (三)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)分析RAPD分析是一種利用隨機(jī)合成的單個寡核苷酸引物，通過PCR擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，分析DNA片段大小和數(shù)量的多態(tài)性，從而比較靶基因差異的一種技術(shù)。由于病原性真菌基因組龐大，RAPD分析適用于真菌的鑒定與分類。 六、真菌毒素的檢測真菌產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，可引起急慢性真菌中毒癥，引起消化道中毒癥狀，而且可進(jìn)入人體內(nèi)引起病變，如引起肝臟損傷的黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素；引起腎臟損害的桔青霉素；引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的黃綠青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性，如