BJS 201904 食品中多種動物源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR法

1、 附件 4 食品中多種動物源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光 PCR法BJS 201904 1范圍本方法規(guī)定了肉及肉制品中豬、驢、山羊、綿羊、牦牛、鼠源性成分檢測的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。本方法適用于肉及肉制品中豬（Sus scrofa）、驢（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一種或多種成分同時(shí)定性檢測。注：本方法中鼠源性成分包括海貍鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizom

2、y spruinosus）源性成分。2原理提取樣品DNA，通過特異性引物探針進(jìn)行動物源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)物熒光信號及擴(kuò)增曲線判定，實(shí)現(xiàn)對樣品動物源性成分的定性分析。3試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。3.1檢測用引物和探針(a)豬 cytb基因檢測用引物探針序列為：5端引物：5-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-33端引物：5-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3探針：5-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA

3、-BHQ1-3(b)驢 nad5基因檢測用引物探針序列為：5端引物：5-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-33端引物：5-GTGATGAGGATACGTGCT-3探針：5-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3(c)山羊 cytb基因檢測用引物探針序列為：5端引物：5-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-33端引物：5-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3探針：5-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3(d)綿羊 cytb基因檢測用引物探針序列為：1 5端引物：5-CTCATGCTACTAG

4、TACTATTTACG-33端引物：5-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3探針：5-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3(e)牦牛 cytb基因檢測用引物探針序列為：5端引物：5-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-33端引物：5-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3探針：5-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3(f)鼠 cytb基因檢測用引物探針序列為：5端引物：5-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-33端引物：5-TC

5、ATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3探針：5-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-33.2 CTAB裂解液：2% (w/v) CTAB，1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用 10%鹽酸調(diào)節(jié) pH至 8.0，121高壓滅菌 20 min，備用。3.3蛋白酶 K：20mg/mL，-20保存?zhèn)溆谩?.4苯酚三氯甲烷異戊醇（體積比 25241）。3.5異丙醇，優(yōu)級純。3.6 70%乙醇。3.7實(shí)時(shí)熒光 PCR預(yù)混液。以 2預(yù)混液為例，成分為：PCR緩沖液（終濃度 1），

6、氯化鎂（終濃度 2.5 mmol/L），dNTP（終濃度 0.2mmol/L），TaqDNA聚合酶（終濃度 1 U）。3.8TE緩沖液（Tris-HCl、EDTA緩沖液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。4儀器和設(shè)備4.1組織研磨器。4.2核酸蛋白分析儀。4.3恒溫水浴鍋。4.4離心機(jī)（最大離心力12000g）。4.5微量移液器（0.1L2.5L，0.5L10L，10L100L，100L1000L）。4.6實(shí)時(shí)熒光 PCR儀。4.7渦旋振蕩器。4.8電子天平：感量 0.01 g。4.9高壓滅菌鍋。4.10 pH計(jì)。5分析步驟2 5.1

7、試樣選取與制備多點(diǎn)采取肌肉組織，選取適量具有代表性的樣品進(jìn)行均質(zhì)處理。所用器皿應(yīng)為一次性耗材，或經(jīng)過徹底清洗和高壓消毒并單獨(dú)使用。用過的器皿應(yīng)采取措施消除核酸的污染，否則不可重復(fù)使用。5.2DNA提取稱取解凍后的均質(zhì)樣品0.1g0.2g，置于2mL離心管中，加入600 L CTAB裂解液和20L蛋白酶K，振蕩混勻，65孵育1h2h，期間每隔10min振蕩混勻；加入500 L的苯酚：三氯甲烷：異戊醇（25241），充分振蕩混勻，12000g離心5min；小心吸取上清液至潔凈的1.5mL離心管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，12000g離心5min；棄去上清液，500L70%乙醇洗滌2次，120

8、00g離心5 min，棄上清液，晾干；加入50L100L TE緩沖液或無菌雙蒸水，溶解DNA，-20保存?zhèn)溆?。同法提取陽性對照、陰性對照及空白對照。也可用等效商品化的試劑盒提取DNA。5.3DNA濃度和純度的測定使用核酸蛋白分析儀檢測 DNA濃度及純度，DNA濃度在 1ng/L100ng/L之間，A260/A280值在 1.72.0之間時(shí)，適宜于本方法。5.4實(shí)時(shí)熒光 PCR擴(kuò)增各動物源性成分PCR擴(kuò)增均采用20L的反應(yīng)體系，包括PCR反應(yīng)預(yù)混液（2）10L，5端、3端引物（10mol/L）各0.2L，探針（10mol/L）0.1L，DNA模板（1ng/L100ng/L）1L，用無菌雙蒸水補(bǔ)足

9、20L。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?55min；35個(gè)循環(huán)（95 15s，58 1min，收集熒光）。也可用等效的商品化試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。5.5實(shí)驗(yàn)對照實(shí)驗(yàn)過程分別設(shè)陽性對照、陰性對照、空白對照。用相應(yīng)動物源性成分生鮮肉樣品作為陽性對照，用不含相應(yīng)動物源性成分的生鮮肉樣品作為陰性對照，用等體積的無菌雙蒸水代替模板DNA作為空白對照。6結(jié)果判斷與表述6.1質(zhì)量控制(a)空白對照：無FAM熒光信號檢出；(b)陰性對照：無FAM熒光信號檢出；(c)陽性對照：有FAM熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值30.0。否則判定為實(shí)驗(yàn)無效。6.2結(jié)果判定3 (a)如有FAM熒光信號檢出，Ct值30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判定為被檢樣品陽性；(b)如Ct值35或無Ct值，則判定為被檢樣品陰性；(c)如有FAM熒光信號檢出，且30.0Ct值35.0，則重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如再次擴(kuò)增后Ct值仍35.0，且有典型的擴(kuò)增曲線，則判定被檢樣品陽性；否則判定被檢樣品陰性。6.3結(jié)果表述結(jié)果為陽性者，表述為“檢出X