抗原抗體反應課件

1、臨床免疫學檢測技術及應用 2008-3-31Immunologic technique/appliance Classical antigen and antibody reaction (抗原抗體反應)Immunoassay (IA) (免疫測定) Immunolabeling technique (標記免疫技術) 一、Classical antigen and antibody reactionAntigen and Antibody reaction Ag + Ab Ag-Ab + Ag/Ab In vivo (不同免疫應答的效應作用) In vitro （抗原抗體結合反應，多樣性）抗原

2、/抗體反應的特點： 特異性（specific） 最適比（optimal ratio） 可逆性（reversible） 親和性（afinity）和親和力（avidity）抗原/抗體反應分兩階段（一）抗原/抗體發(fā)生特異性結合 1、親水膠體轉變?yōu)槭杷z體（水化層） 2、抗原抗體的結合力（靜電引力、范登華引力、氫鍵 結合力、疏水結合力等）（二）抗原/抗體結合的可見反應 1、凝集 2、沉淀 3、溶細胞 4、等等 In vitro（classical）Precipitation Reaction （沉淀反應）Agglutination Reaction （凝集反應）Antigen and Antibody

3、 Reaction Involved by Complement （補體介導的抗原抗體反應）Et alPrecipitation ReactionImmunodifusion（免疫擴散）Immunoturbidimetry（免疫濁度）Immunoeletrophoresis（免疫電泳）Et al(環(huán)狀） （絮狀）沉淀反應的類型歸納 環(huán)狀沉淀反應 液相（液體）絮狀沉淀反應 免疫濁度測定沉淀反應 免疫擴散 固相（凝膠） 免疫電泳 免疫濁度(turbidimetry)測定:含義：是將光學測量儀與自動分析檢測系統(tǒng)結合，應用于沉淀反應試驗。原理：抗原抗體在檢測反應液中會形成抗原抗體復合物，使得反應液出現(xiàn)

4、濁度。當反應液中保持抗體過剩，形成的復合物隨樣本中抗原的量增加而增多，反應液的濁度亦隨之增高。與系列標準品對照(標準曲線)，可計算樣本中被測抗原的濃度。 透射免疫比濁（turbidimetry）免疫比濁測定儀 散射免疫比濁（nephelometry） 包括 終點 速率Agglutination Reaction 例: 人類ABO血型檢測(玻片) 肥達(Widal)反應 direct 類風濕因子測定(乳膠) indirect 包括-正向 反向 抗紅細胞不完全抗體(Coobs) 補體介導的抗原抗體反應(complement)例：CH50（complement hemolysis 50%)(測補體）

5、脂質體免疫法檢測補體（測補體）微量細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity；CDC）（交叉配型）特定蛋白檢測儀及配套試劑（補體單成分）二、Immunolabeling TechniqueImmunolabeling Technique原理：于抗原或抗體上標記可以微量檢測的標記物（熒光素、酶或同位素等），待特異性抗原抗體反應后，所測的不必是抗原-抗體復合物本身，而測定復合物中的標記物，并可通過標記物的放大作用，進一步提高其檢測的敏感度。Immunolabeling TechniqueEnzyme linked immunosorbent assay （ELI

6、SA）Fluorescence immunoassay（FIA）Radioimmunoassay（RIA）Luminescence immune-techniqueSolid phase membrane-based immunoassayBiotin-avidin system（BAS）酶免疫技術/ELISA酶免疫技術 是以酶標記抗原或抗體作為主要試劑的免疫測定方法。ELISA 是以酶作為標記指示物、以抗原抗體反應為基礎的固相吸附測定。酶免疫技術分類（一）酶免疫組織化學測定技術（二）酶免疫測定技術 Ab *Ag Ab*Ag Ab* Ab Ag * AbAg * Ag* （1）Homogeno

7、us （均相測定） （2）Hetergenous（異相測定） Solid phase （固相）ELISA：ELISA 是以酶作為標記指示物、以抗原抗體反應為基礎的固相吸附測定。 抗原/抗體的固相化 （coating，包被） （immunosorbent） (蛋白分子表面效應)操作：（例）Ag/Ab in pH 9.6 carbonate buffer Incubated at 4 for overnight 表面效應：蛋白質分子在吸附（包被）過程，為了克服與固相載體之間的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基團，使疏水性基團充分暴露，然后，局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫，再通過范德瓦爾引力將其固相于

8、載體表面。整個過程謂coating。影響：抗原抗體的構象和功能；抗原-抗體結合反應的動力學過程。 區(qū)別： （1）非共價吸附抗體或蛋白通過疏水性相互作用而附著 （2）共價吸附借助固相上的活性基團，通過化學交聯(lián)劑與抗原/抗體分子上相應活性基團反應形成共價鍵，固著 固相載體材料要求：1、結合容量2、結合能力3、結合性質4、性價比種類：1、聚苯乙烯2、聚氯乙烯3、硝酸纖維素膜4、尼龍膜5、磁性微?？组g差異（10%） 對策一、用一定濃度的人IgG（10ng/ml）適當稀釋度的酶標抗人IgG控制反應各條件計算各孔讀值的平均值并要求每孔的讀值與其平均值間的差異小于10%。二、選擇已知陽性與陰性標本，作系列稀

9、釋在不同固相載體上按預定的ELISA法進行操作測定評判的標準：陽性結果與陰性結果差別最大的好Blocking（封閉）Ag/Ab被固相化后，固相載體表面會留有少量未被吸附的位點（空），反應過程中加入的待檢標本或酶標抗體等可能與之吸附（非特異），導致其檢測的本底偏高。為避免之，包被后再用BSA或小牛血清包被一次 Blocking。用于酶免疫測定的抗原與抗體1、用途：包被與標記2、種類：抗原 天然、重組、合成 抗體 多克隆、單克隆3、要求：抗原純度高、抗體效價高、結合 力高（對照孔）4、適宜工作濃度抗原性肽段的固相合成以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，以N-Fmoc基團保護的氨基酸為原料，以H

10、BTU/HoBt作為偶聯(lián)試劑，從C-N端順序依次偶聯(lián)所需的氨基酸，直至合成所需的各肽段。然后將肽從樹脂上裂解下來，洗滌，凍干得到短肽。 間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇 各類血清 包被抗原稀釋度 1:100 1:200 1:400 1:800 1:160 強陽性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42 弱陽性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19 陰性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05 稀釋液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04 選擇標準：強陽性參考血清A值為0.8左右,陰性參考血清A值0.1酶免疫測定的酶結合物制備*酶結合物（conj

11、ugate）或稱酶標抗體或抗原。一般是通過化學交聯(lián)(耦聯(lián))或免疫學反應而獲得。適宜標記用酶的要求: 酶活性 具共價交聯(lián)能力 催化底物產(chǎn)有色信號并易于檢測 自身穩(wěn)定,不易受干擾免疫測定技術常用的酶及其底物(substrate) 酶 底物 顯色反應 測定波長辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 橘紅色 492 四甲基聯(lián)苯胺 黃色 460 氨基水楊酸 棕色 449 鄰聯(lián)苯甲胺 蘭色 425 2,2-連胺基-2（3-乙基- 并噻唑啉磺酸-6）銨鹽 藍綠色 642堿性磷酸酶 4-硝基酚磷酸鹽（PNP） 黃色 400 萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 紅色 500葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 黃色 405,4

12、20 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 深藍色 405,420D-半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷（4MuG） 熒光 360,450 硝基酚半乳糖苷（ONPG） 黃色 420Conjugate的制備1、戊二醛交聯(lián)法（一步/二步） 酶-NH2 O=C-H 酶-N=CH | | + （CH2)3 CH3 | | 抗體-NH2 O=C-H 抗體-N=CH 2、過碘酸鈉法 利用過碘酸鈉將酶蛋白分子中與酶活性無關的多糖分子的羥基氧化成活潑的醛基 + 抗體蛋白游離氨基形成 Schiffs堿而交聯(lián) Homogenous （均相測定） Ab *Ag Ab*Ag Ab* Ab Ag * AbAg * Ag* Ab*Ag

13、Ab* AbAg * Ag* 不需分離，但Ab*/Ag*酶需失活例：enzyme-multiplied immunoassay tecnique (EMIT,酶擴大免疫測定技術) clonedenzymedonorimmmunoassay (CEDIA) (克隆酶供體免疫測定) EMIT測定：檢測對象：半抗原試劑： 抗體 酶標記半抗原 底物反應模式：競爭法CEDIA測定：enzymeacceptor，EA（酶受體）enzymedonor，ED（酶供體）EA、ED游離無酶活性檢測對象：藥物、小分子物試劑：抗體、EA ED標記抗原 底物反應模式：競爭法固相膜免疫吸附測定固相載體：硝酸纖維素微孔膜標

14、記物選擇：有色微粒子（膠體金）反應形式：穿流（滲濾） 橫流（層析） Western Blot 重組免疫結合試驗（RIBA） 應用：藥物、激素、抗生素等 Fluorescence immunoassay（FIA）以熒光素為標記物并標記抗體/抗原，當抗原-抗體特異性結合，在熒光顯微鏡下可示蹤，實際工作中普遍使用。由于主要用熒光素標記抗體去檢測相應抗原（定位、定量），所以統(tǒng)稱熒光抗體技術（fluorescent antibody technique）分類：熒光免疫顯微技術（流式） 熒光免疫測定 （非均相/均相） 熒光（fluorescence）： 某些物質在光的照射下，吸收光能進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)

15、態(tài)返回原基態(tài)時，以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，稱為光致發(fā)光。 若用一短波長光照射某物質，該物質能發(fā)射較長波長的光，此種光被稱謂熒光。熒光素（ fluorchrome ）： 是指一些具有光致熒光特性的染料物質。熒光的淬滅現(xiàn)象： 某些理化因素可使得熒光色素的輻射能力減弱或消失的現(xiàn)象。常用的熒光素1、異硫氰基熒光黃（FITC） 純品為黃色結晶粉末，最大吸收光譜490495mm，最大發(fā)射光譜520530mm，呈明亮黃綠色熒光。2、四乙基羅丹明（RB200） 純品為橘紅色粉末，最大吸收光譜570mm，最大發(fā)射光譜595600mm，呈明亮橙色熒光。3、四甲基異硫氰基羅丹明（TRITC） 羅丹明的衍生物

16、，純品為紫紅色粉末，最大吸收光譜550mm，最大發(fā)射光譜620mm，呈橙紅熒光。常用的熒光抗體標記方法即熒光素與抗體的結合熒光素有活潑的化學基（偶氮基N=N） （異氰基N=C=O） （異硫氰基N=C=S）抗體蛋白有氨基酸的自由氨基方法：透析 攪拌結合物 （熒光素N-C-N-蛋白質） l l l H S H熒光免疫測定 （非均相/均相） 時間分辨熒光免疫測定（TR-FIA）（非）0 400 800 1000短壽熒光長壽熒光延緩時間計數(shù)時間熒光強度時間us時間分辨熒光免疫測定原理示意圖時間分辨熒光免疫測定（TR-FIA）原理1、用熒光壽命較長的稀土金屬（Eu、Tb等）作標記物，標記抗原或抗體。2、

17、利用時間分辨熒光分析儀3、延緩測量時間，以排除標本中的自發(fā)熒光。因為后者的熒光壽命很短。4、稀土金屬的激發(fā)光波長與發(fā)射波長間距大（Stokes移位290nm/一般熒光Stokes移位28nm）5、靈敏度高（0.21ng/ml）熒光免疫測定 （非均相/均相） 熒光偏振免疫測定(FPIA)(均)當待測抗原濃度高時，經(jīng)競爭反應大部分抗體被其結合，而熒光素標記的抗原多呈游離的小分子狀態(tài)。由于其分子小，測量到的熒光偏振光較低。反之，待測抗原濃度低時，大部分熒光素標記抗原與抗體結合，形成大分子的標記抗原抗體復合物，此時檢測到的熒光偏振程度也較高。熒光偏振免疫分析示意圖熒光偏振免疫測定(FPIA)原理 1、

18、熒光物質在溶液中被單一平面的偏振光（波長485nm）照射后，可吸收光能進入激發(fā)態(tài)；當其恢復至基態(tài)時釋放能量的同時發(fā)射偏振熒光（波長525nm）。 2、偏振熒光的強度與熒光物質受激發(fā)時分子轉動的速度呈反比。（大分子/慢-強，小分子/快-弱）。 3、FPIA主要用于測定藥物（小）濃度。 4、當藥物與熒光標記藥物競爭一定量抗體，結果標本中藥物高，熒光標記藥物-抗體形成低，據(jù)標準曲線計算藥物含量。（呈反比）其他標記1、放射性核素標記物2、發(fā)光標記物 chemiluminescence immunoassay,CLIA luminescence enzyme immunoassay,IEIA biolu

19、minescence immunoassay,BLIA3、金標記物4、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）Immnogold labeling technique金標記免疫技術是以膠體金標記物標記抗原或抗體，對樣本中相應抗體或抗原進行檢測。膠體金 一般指金的水溶液，又稱金溶膠。 金顆粒直徑在1100nm之間。 其對電解質敏感，水化層破壞顆粒凝聚 據(jù)顆粒大小，其呈色性不同。 膠 體 金（Colloidal Gold） 1560 nm膠體金的制備還原法(最常用的化學方法)原理：在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑， 使金離子還原為金原子。在適當條件下， 還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒， 形成金溶膠。常用

20、的還原劑：檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白 磷、硼氫化鈉等 檸檬酸鈉還原制備的金顆粒直徑較大，15150nm 燒制膠體金步驟:取預先處理過的三角燒瓶 加入沸石與適量雙蒸水220V、煮沸棄去瓶內(nèi)液體，加入雙蒸水，再次煮沸沸騰狀態(tài)下加入適量檸檬酸三鈉1520秒后加入適量氯金酸2min內(nèi)液體由黑色變?yōu)榘底霞t色75V、微沸冷卻后，520nm下測OD值OD值在1.01.1之間最佳注意事項:1.玻璃器皿的清潔 玻璃器皿清洗清潔液浸泡24h 流水沖雙蒸水 反復洗滌晾干2. 試劑配制 應盡量使用分析純試劑 各種水溶液必須用雙蒸水或三蒸水配制3. 影響膠體金顆粒大小的因素 加入還原劑的速度與加入的量 攪拌是否均勻

21、制備膠體金所用的燒瓶大小 膠體金結合物（Conjugate） 免疫膠體金制備1)在膠體金溶液中加入適合比例的抗體（或抗原）2)加適量碳酸鉀，觀察溶液顏色變化（當膠體金與待 標記的蛋白比例合適時，溶液顏色無變化）。3)用高速離心機離心并棄去上清液，加入清洗液再次 高速離心，棄去上清液，（注：吸取上清液時不要 吸走沉淀物質）。4)余下的沉淀物質就是綴合后的膠體金，加恢復液用 10ml玻璃針筒、濾器超濾到一定體積（即恢復濃 度）。膠體金標記免疫測定模式1、斑點金免疫滲濾試驗 （dot immunogold filtration assay，DIGTA）2、斑點免疫層析試驗（dot immunochromatograp