蛋白質工程的崛起

1、1.4蛋白質工程的崛起一、蛋白質工程崛起的緣由滿足人類生產和生活的需要例如：改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數倍蛋白質工程的概念 蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造或制造一種新的蛋白質，以滿足人類對生產和生活的需求。蛋白質工程的概念基礎:蛋白質工程的實質：途徑:目標:蛋白質的結構和功能基因修飾或基因合成 改

2、造或制造新的蛋白質，滿足人類的生產或生活的需要是對編碼蛋白質的基因進行改造又稱為第二代基因工程 注： 對基因進行改造的蛋白質可使基因控制的性狀遺傳下去，而直接改造蛋白質卻不能遺傳。蛋白質工程的流程基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質三維結構預期功能生物功能mRNA轉錄翻譯折疊DNA合成分子設計蛋白質工程原理天然蛋白質的合成途徑：基因表達（轉錄和翻譯）形成氨基酸序列的多肽鏈形成具有高級結構的蛋白質行使生物功能預期的蛋白質功能出發(fā)設計預期的蛋白質結構推測應有的氨基酸序列找到相應的脫氧核苷酸序列酸蛋白質工程的途徑：蛋白質工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（

3、3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質的二維結構和三維晶體結構;（4）設計各種處理條件，了解蛋白質的結構變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。一級結構：組成蛋白質多肽鏈的線性氨基酸序列。二級結構：依靠不同氨基酸之間的C=O和N-H基團間的氫鍵形成的穩(wěn)定結構，主要為螺旋和折疊。三級結構：通過多個二級結構元素在三維空間的排列所形成的一個蛋白質分子的三維結構。四級結構：用于描述由不同多肽鏈（亞基）間相互作用形成具有功能的蛋白質復合物分子。蛋白質的結構蛋白質的二級結構 蛋白質的結構

4、胰島素的三級結構蛋白質的結構血紅蛋白質的四級結構 返回三、蛋白質工程的進展和前景成功的例子不多，主要是因為蛋白質發(fā)揮其功能需要依賴于正確的空間結構，而科學家目前對大多數蛋白質的空間結構了解很少 .現狀：進展和前景：對某些藥物進行改造，使之成為速效藥品制作電子元件蛋白質工程在實施中的對大難題：對大多數蛋白質的高級結構的了解還很不清楚首先應該根據密碼子推出mRNA序列，再根據堿基互補配對原則推出脫氧核苷酸序列。確定目的基因的堿基序列后，就可以根據人類的需要，從基因庫中獲取并改造它，或通過人工合成的方法得到它。 1、已知某多肽鏈的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸怎樣得出決定這一段

5、肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應的堿基序列寫出來。 2、確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能獲得目的基因（DNA）？ 討 論基因工程是遵循中心法則，從DNAmRNA蛋白質折疊產生功能，基本上是生產出自然界已有的蛋白質。2、蛋白質工程操作程序的基本思路與基因工程有什么不同？ 蛋白質工程是按照以下思路進行的：確定蛋白質的功能蛋白質應有的高級結構蛋白質應具備的折疊狀態(tài)應有的氨基酸序列應有的堿基排列，可以創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質 。思考與探究1 關于生物體內存在的天然蛋白質，下列說法不正確的是（ ）A是生物在長期進化過程中形成的B它們的結構和功能符合特定物種生存的需要C構成天然蛋白質的氨基酸目前發(fā)現的有2

6、0種D一定完全符合人類生產和生活的需要練習 D2、以下關于蛋白質工程的說法正確的是（）A、蛋白質工程以基因工程為基礎B、蛋白質工程就是酶工程的延伸C、蛋白質工程就是用蛋白酶對蛋白質進行改造D、蛋白質工程只能生產天然的蛋白質 2、蛋白質工程的基本流程正確的是（）蛋白質分子結構設計DNA合成預期蛋白質功能根據氨基酸序列推出脫氧核苷酸序列A B C D4、蛋白質工程是在基因工程基礎上，延伸出來的第二代基因工程，其結果產生的蛋白質是（）A氨基酸種類增多 B氨基酸種類減少C仍為天然存在蛋白質 D可合成天然不存在蛋白質5、關于蛋白質工程的進展和應用，下列說法不正確的是（ ）A科學家通過對胰島素的改造，已使

7、其成為速效藥品B生物和材料科學家正積極探索將蛋白質工程應用于微電子方面C蛋白質工程技術已經非常成熟，目前正被大力推廣應用D蛋白質工程是一項難度很大的工程，目前成功的例子不多C鳥槍法(Shotgun) 將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的片段，分別連接到載體上，轉化受體細胞，形成一套重組克隆，篩選出含有目的基因期望重組子。鳥槍法局限性： 如同盲人打鳥而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%真核生物中目的基因中含有內含子，真核生物中目的基因不能在原核細菌中表達。 （1）目的基因組DNA片段的制備。 如：機械切割，用超聲波處理，采用合適強度和時間。切割的DNA片段控制一定大小范

8、圍內，上限是載體最大裝載量，下限應大于目的基因長度。提取目的基因cDNA法：cDNA文庫（cDNA Bank） cDNA是與mRNA互補的DNA (Complementary DNA)，將供體生物細胞的mRNA分離出來，利用逆轉錄酶在體外合成cDNA，克隆在受體細胞內，篩選獲得含有目的基因編碼序列的重組克隆。優(yōu)點：（1）能選擇性克隆蛋白編碼基因，由mRNA反轉錄合成cDNA對特的基因而言只有一種可能性。（2）cDNA法克隆基因相當“純凈”，不含5端調控區(qū)，剔除內含子結構，有利于原核細胞的表達。（3）比相應的基因組拷貝要小數十倍，2-3 Kb或更小，便于穩(wěn)定地克隆在表達型質粒上。 發(fā)明PCR，公

9、司獎勵10,000美元獎金專利賣給Hoffmann-La Roche公司賣了3億美元Mullis得了1993年諾貝爾化學獎利用PCR技術擴增目的基因PCR擴增上億個拷貝（幾個小時），而癌癥細胞以高復制能力而著稱，完成同樣的多制工作一個癌癥細胞需要整整一個月?；瘜W合成法：前提a.如果目的基因的全序列是已知的，用化學合成法直接合成。b.DNA自動合成儀可合成不超過50個堿基寡聚核苷酸單鏈。c.用于核酸雜交的探針，分子克隆的人工接頭，PCR擴增的引物。d.由單鏈寡聚核苷酸通過退火直接裝備雙鏈DNA片段或基因。基因文庫，理論上它含有某一生物染色體的所有DNA片段，包括基因編碼區(qū)和間隔區(qū)DNA。由鳥槍法

10、和cDNA法構建。鳥槍法構建的為基因組文庫 (Genomic Bank)。cDNA文庫,含有生物體的全套蛋白質編碼序列,不含DNA調控序列從cDNA文庫篩選蛋白質編碼基因，比從基因文庫篩選要簡捷。目的基因與運載體的結合表達載體的構建目的基因啟動子和終止子標記基因核糖體結合位點的強弱克隆基因的拷貝數所表達的蛋白質的最終細胞定位翻譯的效率所表達的蛋白質的穩(wěn)定性目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，遺傳到下一代，同時使目的基因表達發(fā)揮作用。什么是強啟動子？與RNA聚合酶結合能力強,因此，其介導的基因轉錄水平高、頻繁持續(xù)強啟動子表達的弱點能量枯竭導致宿主細胞生長受阻質粒容易丟失將目的基因導入受體細胞目

11、的基因導入微生物細胞：細菌轉化五個步驟1）感受態(tài)的形成 感受態(tài)細胞能分泌一種小分子量的激活蛋白，感受因子，誘導特征性蛋白（細胞溶素）合成，使細胞壁部分溶解,暴露膜上DNA結合的蛋白。2）轉化因子結合 受體菌膜上的結合蛋白與轉化因子的雙鏈DNA結構特異結合。單鏈DNA,RNA,DNA-RNA雜合雙鏈都不能結合在膜上。3）轉化因子吸收 雙鏈DNA結構與蛋白特異結合后，激活核酸酶，一條鏈被降解，另一條被吸受到受體菌中。4）整合復合物前體形成 整合復合物前體：進入受體細胞單鏈DNA與蛋白特異結合。保護單鏈DNA不被酶降解。5）轉化因子單鏈DNA整合 單鏈DNA通過同源重組，置換受體染色體同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈DNA結構。將目的基因導入植物細胞土壤農桿菌法基因槍法花粉管通道法1987年，周光宇中國的轉基因棉花