病毒與細(xì)胞互作用課件

1、第四章 病毒與細(xì)胞間的相互作用第一節(jié) 病毒的培養(yǎng)第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用第1頁，共36頁。第一節(jié) 病毒的培養(yǎng) 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動(dòng)物（動(dòng)物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)）。第2頁，共36頁。動(dòng)物接種：接種后通常以動(dòng)物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo)。按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。雞胚接種：一種比較經(jīng)濟(jì)簡便的方法。一般采用孵化9-12天的雞胚，按病毒種類不同接種于雞胚的不同部位。第3頁，共36頁。可采用絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接種。第4頁，共3

2、6頁。人或動(dòng)物細(xì)胞在一定條件下可在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)瓶內(nèi)生長。 優(yōu)點(diǎn)：每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相等無個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好可嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化細(xì)胞培養(yǎng)第5頁，共36頁。原代細(xì)胞（primary cell） 動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使細(xì)胞分散而得到的細(xì)胞。二倍體細(xì)胞株（diploid cell strain） 將長成單層的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞系（established cell line）能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞，大多

3、數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成。（一）細(xì)胞的類型第6頁，共36頁。（二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法靜置培養(yǎng)（stationary culture） 實(shí)驗(yàn)室常用。細(xì)胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養(yǎng)，細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長分裂，最后長成單層。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（roller culture） 大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞在玻瓶內(nèi)生長時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞帖附于玻瓶四周，長成單層。第7頁，共36頁。懸浮培養(yǎng)（suspensive culture） 通過攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，并補(bǔ)充營養(yǎng)和校正pH，使之生長或維持存活。微載體培養(yǎng)（micro-carrier culture） 是在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

4、。 微載體是直徑10035m的微小顆粒，對(duì)細(xì)胞無毒性，細(xì)胞可貼附其上長成單層。第8頁，共36頁。第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用殺細(xì)胞感染非殺細(xì)胞感染 引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞代謝無影響。產(chǎn)生干擾素 第9頁，共36頁。生產(chǎn)性感染（productive），病毒感染后能產(chǎn)生和釋放子代病毒顆粒。宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化可能是細(xì)胞死亡或細(xì)胞轉(zhuǎn)化非生產(chǎn)性感染（nonproductive）或稱頓挫感染（abortive infection） 病毒感染后不形成完整的病毒顆粒持續(xù)性感染（persistent infection）是指持續(xù)長時(shí)間的感染，感染過程中不形成感染性的病毒顆粒 第10頁，共36頁。病毒與細(xì)胞的

5、相互作用感染的類型對(duì)細(xì)胞的影響是否產(chǎn)生傳染性病毒顆粒例證殺細(xì)胞細(xì)胞病變（CPE），細(xì)胞蛋白質(zhì)、RNA、DNA合成被抑制。細(xì)胞死亡是甲型皰疹病毒、腸病毒、呼腸孤病毒持續(xù)性、生產(chǎn)性無CPE，細(xì)胞代謝無甚妨礙，細(xì)胞繼續(xù)分裂，某些分化的細(xì)胞可失去某些功能是瘟病毒、砂粒病毒、狂犬病毒、大多數(shù)反錄病毒持續(xù)性、非生產(chǎn)性通常無影響否，但可通過共培養(yǎng)等誘導(dǎo)腦組織的犬瘟熱病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞可無限制傳代移植至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可產(chǎn)生腫瘤否，致腫瘤DNA病毒是，致腫瘤反錄病毒多瘤病毒、腺病毒鼠、禽白血病病毒第11頁，共36頁。 一、病毒引致的殺細(xì)胞變化 細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE) 由病毒

6、感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。CPE能在光學(xué)顯微鏡下觀察。常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。第12頁，共36頁。細(xì)胞腫大 細(xì)胞圓縮 形成合胞體病毒所致的細(xì)胞病變第13頁，共36頁。tissue culture cellsepithelialepithelioidfibroblastic第14頁，共36頁。epithelial cells uninfectedearly infectionlate infectionslides from CDC第15頁，共36頁。fibroblastic cellsuninfectedearly infectionlat

7、e infectionslides from CDC第16頁，共36頁。Formation of multinucleated cells. 第17頁，共36頁。能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。半數(shù)組織細(xì)胞感染量（tissue culture infectious dose 50, TCID50）第18頁，共36頁。涉及細(xì)胞膜的CPE 有囊膜的病毒出芽過程中能將其融合蛋白直接插入宿主細(xì)胞膜，結(jié)果導(dǎo)致膜融合以及合胞體（syncytia）形成。 慢病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某些皰疹病毒等感染 涉及細(xì)胞骨架的CPE 微絲（如actin）、中介絲（如vi

8、mentin）及微管（如tubulin）等細(xì)胞骨架與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、物質(zhì)運(yùn)輸及運(yùn)動(dòng)性等有關(guān)。第19頁，共36頁。病毒引致的細(xì)胞凋亡與壞死 壞死（necrosis）、 凋亡（apoptosis） 圖2432-2 感染犬瘟熱病毒凋亡的Vero細(xì)胞的電鏡照片第20頁，共36頁。病毒感染抗體依賴的增強(qiáng)作用（Antibody-dependent enhancement of viral infection, ADE） 在病毒感染過程中，宿主產(chǎn)生的抗體與病毒結(jié)合，非但未能阻斷病毒吸附宿主細(xì)胞，反而增強(qiáng)了病毒對(duì)細(xì)胞的感染，提高了病毒的滴度。 第21頁，共36頁。（一）空斑試驗(yàn)將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)

9、胞培養(yǎng)中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見，此即空斑(plaque)。第22頁，共36頁。第23頁，共36頁?？瞻呤怯梢粋€(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類似于細(xì)菌的菌落，稱為空斑形成單位（PFU）。病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU來表示。 第24頁，共36頁。空斑試驗(yàn)的用途：1. 測(cè)定病毒數(shù)量2. 純化病毒 單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可獲得病毒克隆。3. 鑒定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。第25頁，共36頁。（二）包涵體（inclusion body)定義：是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普

10、通光學(xué)顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。第26頁，共36頁。圖324-4 皰疹病毒的包涵體第27頁，共36頁。包涵體的性質(zhì)病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體第28頁，共36頁。定義：由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。 種類：、干擾素?？共《咀饔茫焊蓴_素不直接作用于病毒，而是作用于鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成。干擾素作用具有宿主特異性，而無病

11、毒特異性。二、干擾素（IFN）第29頁，共36頁。第30頁，共36頁。干擾素抗病毒機(jī)制 第31頁，共36頁。RNA干擾（RNA interference, RNAi）指細(xì)胞利用內(nèi)源或外源的小分子雙股RNA片段，特異性地降解同源基因的mRNA，從而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（post translational gene silence, PTGS）的現(xiàn)象。 第32頁，共36頁。復(fù)習(xí)思考題1. 細(xì)胞培養(yǎng)有何優(yōu)點(diǎn)？2. 原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞系的概念。3. CPE、PFU、空斑、包涵體和干擾素的概念。第33頁，共36頁。第五章 病毒的致病機(jī)理 第34頁，共36頁。病毒的持續(xù)性感染 類型持續(xù)性感染（persistent infections） 不論是否發(fā)病，感染性病毒始終存在。 潛伏感染（latent infections） 又名隱性感染。除非激活，一般并不能發(fā)