藥物分析學(xué)課件：第四章 藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證

1、2022/8/4藥 物 分 析（Pharmaceutical Analysis）2022/8/4利用分析測(cè)定手段，發(fā)展藥物的分析方法，研究藥物的質(zhì)量規(guī)律，對(duì)藥物進(jìn)行全面的檢驗(yàn)與控制的科學(xué)。取樣-鑒別-檢查-含量測(cè)定-報(bào)告攻略-中國(guó)藥典藥 物 分 析（Pharmaceutical Analysis）第四章藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證32022/8/4第一節(jié)定量分析方法的分類與特點(diǎn) 2022/8/44一、容量分析法二、光譜分析法 三、色譜分析法 優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用于應(yīng)用容量分析操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，耐用性高，相對(duì)誤差=0.2%缺乏專屬性對(duì)準(zhǔn)確度和精密度要求高的樣品化學(xué)原料藥光譜分析簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，具有一定

2、準(zhǔn)確度，相對(duì)誤差2%-5%缺乏專屬性對(duì)靈敏度要求高，樣本量大的樣品制劑定量檢查色譜分析高靈敏度，高專屬性，一定準(zhǔn)確度需對(duì)照品對(duì)專屬性和靈敏度要求高的復(fù)雜樣品制劑含量測(cè)定2022/8/45定量分析方法比較一、容量分析法2022/8/46(一) 特點(diǎn)與適用范圍 (1) 方法簡(jiǎn)便易行 (2) 方法耐用性高 (3) 測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確 (4) 方法專屬性差 適用于原料藥含量測(cè)定(二) 有關(guān)計(jì)算:1. 滴定度與滴定度計(jì)算2. 含量計(jì)算 (1) 直接滴定法 (2) 間接滴定法 生成物滴定法 剩余量滴定法 也稱滴定法: 將已知濃度滴定液滴加至 被測(cè)藥物溶液中,至滴定終點(diǎn),根據(jù)滴 定液的濃度,體積和滴定度,計(jì)算含量

3、 容量分析法自動(dòng)電位滴定儀2022/8/47(二) 相關(guān)計(jì)算2022/8/48每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)藥物的質(zhì)量, mg 1. 滴定度每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6 1. 滴定度2022/8/49 溴酸鉀法測(cè)定異煙肼(C6H7N3O=137.14)的含量, 溴酸鉀滴定液濃度為0.01667mol/L (KBrO3為單元) 反應(yīng)式: 每1ml溴酸鉀滴定液(0.01667mol/L) 相當(dāng)于3.429mg的異煙肼(C6H7N3O) 滴定度計(jì)算2. 含量測(cè)定2022/8/410 直接滴定法 生成物滴定法 剩余量滴定法 (1)(2)(3)(1) 直

4、接滴定法2022/8/411注意掌握滴定反應(yīng)的原理, 藥物與滴定劑在反應(yīng)中的摩爾比正確計(jì)算滴定度和百分含量 (2) 生成物滴定法2022/8/412注意摩爾比的替換藥物與A作用生成B, 用滴定液滴定B百分含量計(jì)算方法與直接滴定法相同 (2) 生成物滴定法2022/8/413滴定度 葡萄糖酸銻鈉含量測(cè)定: 本品約0.3g, 加水100ml、鹽酸15ml與碘化鉀試液10ml,暗處放置10分鐘,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定每1ml硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于6.088mg銻(Sb)反應(yīng)式:(3) 剩余量滴定法(回滴法)2022/8/414加入定過(guò)量滴定液A, 用滴定液B滴

5、定剩余的A注意: 滴定度為滴定液A的滴定度無(wú)空白進(jìn)行空白校正(3) 剩余量滴定法2022/8/415 司可巴比妥鈉含量測(cè)定: 本品約0.1g, 加水10ml溶解, 精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml, 再加鹽酸5ml, 放置15分鐘, 加碘化鉀試液10ml, 用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定, 滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正 W=0.1022g; 硫代硫酸鈉滴定液 F=1.038; 供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液15.73ml;空白23.21ml (3) 剩余量滴定法2022/8/416滴定度司可巴比妥鈉M=260.27, 與溴摩爾比為1:1 (3) 剩余量滴定法2022/8/417

6、 滴定液A與滴定液B濃度是相當(dāng)?shù)?溴滴定液(0.05mol/L)與硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng) 因?yàn)殇?Br2)等摩爾轉(zhuǎn)化為碘(I2), 而碘(I2)與硫代硫酸鈉(Na2S2O3)反應(yīng)的摩爾比為1:2, 所以溴滴定液與硫代硫酸鈉滴定液的濃度比也是1:2 滴定液A與滴定液B經(jīng)濃度校正后的消耗體積(V=VF)是相當(dāng)?shù)亩⒐庾V分析法2022/8/418定義分類 UV-Vis 利用物質(zhì)的光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法光譜分析法 IR AA FluorFP(flame photometry)(一) 特點(diǎn)與適用范圍2022/8/419F-IR(一) 紫外-可見(jiàn)分光光度法2022/8/420

7、1. 特點(diǎn)與適用范圍 (1) 方法簡(jiǎn)便易行 (2) 方法靈敏度高 (3) 結(jié)果準(zhǔn)確度較高 (4) 方法專屬性較差 制劑含量測(cè)定與定量檢查2. 儀器校正和檢定 (1) 波長(zhǎng) (2) 吸光度的準(zhǔn)確度 (3) 雜散光 3. 測(cè)定法 對(duì)照品比較, 吸收系數(shù) 計(jì)算光譜, 比色法基于對(duì)紫外光區(qū)(200400nm)和可見(jiàn)光區(qū)(400760nm)單色光吸收特性的分析方法 原理: UV-Vis(1) 對(duì)照品比較法2022/8/421原料藥 制劑 氟康唑片溶出度檢查: 取本品(規(guī)格:100mg), 鹽酸溶液(91000)1000ml為溶出介質(zhì), 經(jīng)45分鐘時(shí), 取溶液濾過(guò); 取續(xù)濾液, 在261nmm波長(zhǎng)處測(cè)定吸

8、光度; 另取氟康唑?qū)φ掌愤m量, 精密稱定, 加溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg 的溶液, 同法測(cè)定, 計(jì)算每片的溶出量溶液濃度 (2) 吸收系數(shù)法2022/8/422原料藥 制劑溶液濃度 鹽酸氯丙嗪注射液(規(guī)格：xx ml : xx mg)的含量測(cè)定：精密量取適量(V ml, 相當(dāng)于鹽酸氯丙嗪50mg), 置200ml量瓶中, 用鹽酸溶液(91000)稀釋至刻度, 搖勻; 精密量取2ml, 置100ml 量瓶中, 用鹽酸溶液稀釋至刻度, 搖勻, 在254nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度, 按吸收系數(shù)( )為915計(jì)算 (二) 熒光分析法2022/8/4231. 特點(diǎn) (1) 高靈敏度

9、 (2) 熒光自熄滅 (3) 易受干擾 (4) 線性范圍窄 (RXRXb)/(RrRrb)=0.52 2. 消除干擾 (1) 溶劑:空白對(duì)照 (2) 溶液:稀,凈,充氮,pH (3) 器皿:潔凈,無(wú)機(jī)清潔液3. 測(cè)定法: 對(duì)照品比較物質(zhì)受UV或Vis照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光; 激發(fā)光停止照射, 熒光隨之消失; 激發(fā)和發(fā)射光譜用于定性, 熒光強(qiáng)度用于定量 Fluor三、色譜分析法2022/8/424特點(diǎn)與應(yīng)用分類 依據(jù)分離原理：(1) 高靈敏度:ng-g/ml(2) 高專屬性:選擇性檢測(cè)(3) 高效能與高速度 吸附;分配;離子交換;分子排阻色譜法 復(fù)方制劑含量測(cè)定的首選方法 依據(jù)分

10、離方式：紙色譜;薄層色譜;柱色譜;氣相色譜;高效液相色譜法 2022/8/425F-IR(一) 高效液相色譜法2022/8/4261. 儀器(RP-HPLC) (1) 色譜柱: ODS最常用; 粒徑一般在3-10m; 溫度40 (2) 檢測(cè)器: UV(DAD,PDA); Fluor, ELSD, RID, ECD, MS (3) 流動(dòng)相: 首選甲醇-水(末端波長(zhǎng)檢測(cè):乙腈-水), 有機(jī)相5%; pH2-8 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) (1) 色譜柱的理論板數(shù)(n) (2) 色譜峰的分離度(R) (3) 色譜系統(tǒng)的重復(fù)性(RSD%) (4) 色譜峰的拖尾因子(T)3. 測(cè)定法 (1) 內(nèi)標(biāo)法 (2)

11、外標(biāo)法不得改變：固定相種類,流動(dòng)相組分,檢測(cè)器類型可以改變：色譜柱內(nèi)徑, 長(zhǎng)度, 載體粒度 流動(dòng)相流速, 混合流動(dòng)相各組分的比例 柱溫; 進(jìn)樣量; 檢測(cè)器的靈敏度HPLC2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)2022/8/427分離度(R): 用于評(píng)價(jià)組分的分離程度; 關(guān)鍵指標(biāo)重復(fù)性: 用于評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣系統(tǒng)響應(yīng)的重復(fù)性能 拖尾因子(T): 用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性理論板數(shù)(n): 用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能n=(tR/)2=16(tR/W)2; n=5.54(tR/Wh/2)2;RSD 1.5% 3. 測(cè)定法與計(jì)算2022/8/428(2) 外標(biāo)法氨酚待因片(I)的含量測(cè)定取本品20片, 精密稱定, 研細(xì), 精密稱

12、取適量, 置250ml量瓶中, 加水溶解并稀釋至刻度, 濾過(guò), 取續(xù)濾液10l進(jìn)樣; 另精密稱取磷酸可待因與對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品適量, 加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含磷酸可待因0.03mg和對(duì)乙酰氨基酚2mg的溶液, 同法測(cè)定(1) 內(nèi)標(biāo)法(二) 氣相色譜法2022/8/429檢測(cè)器FID進(jìn)樣方式 (1) 溶液直接進(jìn)樣: 不超過(guò)數(shù)微升(l); 毛細(xì)管柱分流 (2) 頂空進(jìn)樣: 供試液于密閉小瓶中, 加熱至待測(cè)組分達(dá)到液-氣平衡, 進(jìn)樣器自動(dòng)吸取一定體積的頂空氣進(jìn)樣 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 同HPLC3. 測(cè)定法 (1),(2) 同HPLC (3) 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法 對(duì)照品溶液適量, 精密加入到

13、供試品溶液中, 測(cè)定含量, 扣除加入的對(duì)照品溶液含量即得 色譜柱：常用毛細(xì)管柱熔融石英或玻璃 內(nèi)徑一般為0.25mm,0.32mm或0.53mm; 柱長(zhǎng)560m 內(nèi)壁或載體經(jīng)交聯(lián)或涂漬固定液; 固定液膜厚0.15.0m 固定液: 甲基聚硅氧烷, 苯基甲基聚硅氧烷, 聚乙二醇 GC第二節(jié)樣品分析的前處理方法2022/8/430一、不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法 二、經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法(一) 水解法; (二) 還原法(一) 干法破壞; (二) 濕法破壞一、不經(jīng)有機(jī)破壞的方法 2022/8/4311.酸水解法水難溶性含金屬有機(jī)藥物與礦酸(鹽酸)共熱: 十一烯酸鋅測(cè)定 回流有機(jī)結(jié)合的待測(cè)元素原子離解,

14、轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)鹽(離子)2. 堿水解法含鹵素有機(jī)藥物(脂肪碳鏈)與氫氧化鈉溶液回流:三氯叔丁醇測(cè)定 適用于: 結(jié)合不牢固的 含金屬或含鹵素有機(jī)藥物(一)水解法2022/8/432不經(jīng)有機(jī)破壞的酸水解一、不經(jīng)有機(jī)破壞的方法2022/8/433碘他拉酸測(cè)定:氫氧化鈉試液與鋅粉回流后, 用硝酸銀滴定 回流堿性溶液中加鋅粉回流, 使碳-碘鍵還原轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)碘化物碘番酸膽影酸膽影葡胺注射液泛影酸泛影酸鈉泛影葡胺注射液 適用于: 結(jié)合牢固的含碘有機(jī)藥物 (直接與芳環(huán)連接) (二)還原法2022/8/434不經(jīng)有機(jī)破壞的還原法二、經(jīng)有機(jī)破壞的方法2022/8/435(一) 濕法破壞 適用于含氮有機(jī)藥物分析的前處理

15、 硫酸作為分解劑, 氧化劑(硝酸,高氯酸)輔助分解劑 凱氏定氮法 (二) 干法破壞高溫?zé)胱品?用于含鹵素藥物的鑒別 無(wú)水碳酸鈉,硝酸鎂,氫氧化鈣,氧化鋅等輔助灰化 2. 氧瓶燃燒法適用于: 含金屬, 鹵素, 氮, 硫, 磷等 有機(jī)藥物 (待測(cè)原子與碳原子結(jié)合牢固者)2022/8/436凱氏定氮法舉例2022/8/437凱氏燒瓶一 消化 二 蒸餾 常量的凱氏定氮法 2022/8/438半微量的凱氏定氮法 一 消化 2022/8/439改進(jìn)的微量凱氏定氮法 1. 凱氏定氮法 2022/8/440(2) 消解劑與助劑: 硫酸-硫酸鉀-硫酸銅 (3) 操作法供試品: 常量法含氮2530mg; 半微量法

16、: 1.02.0mg消解: 溶液成澄明的綠色, 繼續(xù)加熱30min蒸餾與接收: 40%氫氧化鈉堿化, 水蒸氣蒸餾, 2%硼酸溶液吸收 滴定: 甲基紅-溴甲酚綠指示液, 硫酸滴定液(0.05mol/L), 灰紫色 (1) 儀器裝置 (4) 應(yīng)用范圍: 含有氨基或酰氨(胺)結(jié)構(gòu) 1. 凱氏定氮法 2022/8/441撲米酮的含量測(cè)定取本品約0.2g, 精密稱定, 照氮測(cè)定法測(cè)定; 每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于10.91mg的撲米酮(C12H14N2O2) 關(guān)鍵步驟: 消解試劑作用: 硫酸-消解劑; 硫酸鉀-提高沸點(diǎn); 硫酸銅-催化劑; 硼酸-固氮(NH3H3BO3)(5) 示例與

17、討論C12H14N2O2 = 218.26干法破壞適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物，主要是含鹵素、硫、磷等有機(jī)藥物分析；亦用于某些藥物中硒及砷鹽的檢查。1高溫?zé)胱品?不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞2氧瓶燃燒法2022/8/4422022/8/443干法破壞中的高溫?zé)胱品z測(cè)鹵素或磷2022/8/444氧瓶燃燒法2. 氧瓶燃燒法 2022/8/445儀器裝置鉑絲: 1mm; 2/3瓶: 硬質(zhì)玻璃(石英玻璃)10-20mg500ml200mg1000-2000ml含待測(cè)元素的有機(jī)藥物在充滿氧氣的燃燒瓶中充分燃燒有機(jī)結(jié)構(gòu): 徹底分解為CO2和H2

18、O待測(cè)元素: 轉(zhuǎn)化為不同價(jià)態(tài)的氧化物(或無(wú)氧酸)被吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?多以酸根離子形式存在) 2. 氧瓶燃燒法 2022/8/446(2)燃燒產(chǎn)物與吸收液氟HF:水氯HCl:水-氫氧化鈉溴Br2+HBr:水-氫氧化鈉-二氧化硫碘I2(+HIO):水-氫氧化鈉(二氧化硫)硫SO3(+SO2):水-過(guò)氧化氫磷P2O5H4P2O7,(HPO3)n:水-硝酸(煮沸)2. 氧瓶燃燒法 2022/8/447(3) 碘苯酯的含量測(cè)定 20mg,氫氧化鈉試液2ml與水10ml為吸收液吸收液,加溴-醋酸10ml,加甲酸1ml,并通空氣3min加碘化鉀2g,用硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)滴定摩爾比為1

19、:6, T=416.34(1/6)0.02=1.388(mg) C19H29IO2 = 416.34 2. 氧瓶燃燒法 測(cè)定氟尿嘧啶時(shí)，樣品前處理采用氧瓶燃燒法，需要的實(shí)驗(yàn)材料有： A 玻璃制燃燒瓶 B 石英制燃燒瓶 C 定性濾紙 D 無(wú)灰濾紙 E 氫氣第三節(jié)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證 2022/8/449需驗(yàn)證的項(xiàng)目驗(yàn)證的內(nèi)容準(zhǔn)確度 定量限防腐劑溶出度,釋放度鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)檢查含量測(cè)定精密度 專屬性 檢測(cè)限 線性 范圍 耐用性重復(fù)性中間精密度重現(xiàn)性 一、準(zhǔn)確度2022/8/450(一) 含量測(cè)定方法 (二) 雜質(zhì)定量測(cè)定 加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)試 (三) 數(shù)據(jù)要求 9個(gè)測(cè)定結(jié)果3個(gè)不同濃度(80,

20、100,120)每個(gè)濃度各3份 準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與 真實(shí)值或參考值接近的程度 一般用回收率(%)表示 定義二、精密度2022/8/4511.重復(fù)性 同一分析人員連續(xù)測(cè)定所得結(jié)果的精密度; 也稱批內(nèi)精密度或日內(nèi)精密度 2.中間精密度 不同時(shí)間不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度 批/日間精密度 3.重現(xiàn)性 在不同實(shí)驗(yàn)室不同人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度 法定標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法進(jìn)行 同一均勻供試品多次取樣測(cè)定所得 結(jié)果之間的接近程度 標(biāo)準(zhǔn)偏差(s,SD);相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)數(shù)據(jù)要求同“準(zhǔn)確度”定義三、專屬性2022/8/452(一) 鑒別反應(yīng) 空白, 結(jié)構(gòu)相似物或有關(guān)物質(zhì)呈負(fù)反應(yīng)(

21、三) 含量與雜質(zhì)測(cè)定 含雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣中各峰能獲得分離 在其他成分(雜質(zhì),降解產(chǎn)物,輔料等)可能 存在下,方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的特性 鑒別,雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定方法 定義與應(yīng)用四、檢測(cè)限2022/8/453 適用于可用目視法直接評(píng)價(jià)結(jié)果的 分析方法, 非儀器分析法 鑒別的顯色法;雜質(zhì)檢查的TLC適用于能直觀顯示信號(hào)與基線噪聲 水平的分析方法, 如HPLC法 信噪比S/N=3(2)時(shí)的相應(yīng)濃度或量 適用于不能直觀比較信噪比的儀器 分析方法, 如UV-Vis法 檢測(cè)限(limit of detection, LOD)是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量LOD是一種限度檢驗(yàn)效能指標(biāo),反映方法靈敏度 1.目視法 2.信噪比法 3.標(biāo)準(zhǔn)偏差法 五、定量限2022/8/454雜質(zhì)和降解產(chǎn)物用定量方法研究時(shí), 應(yīng)確定LOQ LOQ的測(cè)定方法與LOD相同相應(yīng)的系數(shù)(倍數(shù))不同, 如信噪比S/N=10定量限(limit of quantitation, LOQ )是指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量;反映方法的靈敏度測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度 六、線性與范圍2022/8/455范圍系指方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間在試驗(yàn)研究開(kāi)始前確定驗(yàn)證的范圍和方法在范圍內(nèi)應(yīng)能達(dá)到一定精密度,準(zhǔn)確度和線性線性系指在設(shè)計(jì)的“范圍”內(nèi), 響應(yīng)值(y)與被測(cè)物濃