同核核磁實驗方法

1、第六章 同核核磁實驗方法通常所謂同核核磁譜指的是1H 同核譜，因為一般有機物富含氫，而1H 的天然豐度達99.98% ，而且 1H 的旋磁比最大，因而核磁信號最強。其他核的核磁信號的檢測相對來講都比較困難，尤其是蛋白質(zhì)中有意義的如 13C， 15N 的天然豐度分別只有1.11%和 0.36%,相對1H 的檢測靈敏度只有0.0159 和 0.00104， 因此要檢測蛋白質(zhì)中的 13C 及 15N 一定要有同位素標記才行，而且還需長時間累加。一般同核譜可研究的蛋白質(zhì)分子量的上限在 1 萬左右，當(dāng)然還要求蛋白質(zhì)在溶液中有足夠的溶解度，化學(xué)位移的分布比較分散。蛋白質(zhì)中質(zhì)子的化學(xué)位移基本上是random

2、 coil的化學(xué)位移加上不同構(gòu)象的影響。如 折疊多的蛋白質(zhì)同 螺旋多的蛋白質(zhì)相比，化學(xué)位移更為分散，譜峰也更容易解析；同種氨基酸殘基多的蛋白質(zhì)，即使分子量較小，由于化學(xué)位移可能會比較密集，譜峰解析可能比稍大一些的蛋白質(zhì)還要困難。已經(jīng)發(fā)表的脈沖序列有上百，但通?？梢钥醋鞒Ｒ?guī)實驗的為數(shù)不多。6.1 一維氫譜在記錄二維譜或三維譜等之前均需要記錄一維氫譜，通常蛋白質(zhì)溶于水或適當(dāng)?shù)木彌_液，加5-10%的 D2O 作為鎖場介質(zhì)。一維氫譜可用于檢查樣品是否有足夠濃度，通常1632 次采樣要能得到足夠信噪比的譜圖，甲基由于快速旋轉(zhuǎn)呈現(xiàn)窄峰，而酰胺質(zhì)子由于化學(xué)交換及14N 的標量弛豫呈現(xiàn)寬峰；一維氫譜還可用于檢

3、查樣品的共振峰寬是否合理，蛋白質(zhì)在高濃度下容易聚集從而增寬譜線，嚴重時甚至1H 譜上看不到明顯的峰，樣品在這種條件下顯然無法進行核磁研究；一維氫譜還可用于判別樣品的化學(xué)位移分布情況，可判別樣品是否變性，同時也對研究工作的難度提供一些預(yù)測。864201H(ppm)上圖顯示ubiquitin （一種蛋白質(zhì)，76個殘基）的一維譜：a水溶液中，b箭頭所指甲基區(qū) 的放大，c 8M尿素溶液中，顯示變性譜。蛋白質(zhì)的一維氫譜一般不應(yīng)該有非常尖的峰，若出現(xiàn)這種峰，往往是殘留的小分子雜質(zhì)，當(dāng)然蛋白質(zhì)的末端及 100P區(qū)由于分子運動較快也會出現(xiàn)一些較尖的峰。當(dāng)樣品條件不佳時，一維譜（以及若干信號強的二維譜）可用來探

4、索適合的樣品條件。6.2 COSY型實驗COSYA COSY（correlated spectroscopy）,是人們發(fā)明的第一種二維譜，同時也是研究蛋白質(zhì)的最有 用的二維譜之一。二個有J偶合的核在COSY上可產(chǎn)生一個交叉峰，由于蛋白質(zhì)（包括多數(shù)其他有機物）中有 J偶合意味著這兩個核最多通過3個共價鍵連接，所以 COSY譜對于分子結(jié)構(gòu)的拓撲連接可提供非常有價值的信息。12左圖是COSY的脈沖序列，只由 2個90度 脈沖組成，兩脈沖之間是演化期，理想脈沖本身不產(chǎn)生其他雜信號，故不需相循環(huán)抑制：因此基本的相循環(huán)為：1 =X； 2=X； ref=X實際上由于演化期的弛豫以及第一個90度脈沖的不準確會

5、產(chǎn)生軸峰，需要用2步循環(huán)抑制：第一個脈沖及接收機相位同時反轉(zhuǎn) 通常還加上CYCLOPS循環(huán)以抑制硬件不平衡產(chǎn)生的其他雜信號 這樣形成8步循環(huán)：1= 0 2 1 3 2 0 3 12= 0 0 1 1 2 2 3 3ref= 0 2 1 3 2 0 3 1二維譜有幅度譜和相敏譜之分，由于相敏譜的分辨率高，通常要盡量用相敏譜。B以下是可以在 Bruker核磁譜儀上用于記錄蛋白質(zhì)COSY譜的脈沖程序，脈沖序列在Bruker譜儀上稱作微程序： ;cosyprst.WJH#include p2=p1*2d0= in0/2-p1*4/3.14159 d11=30m”d12=20ud13=3ul3=(td1

6、/2)zed11d11d12 pl9:f1 d1 cw:f1 d13 do:f1 d12 pl1:f1p1 ph1 d0p1 ph2go=2 ph31d11 wr #0 if #0 ip1 zd lo to 3 times 2d11 id0lo to 4 times l3 exitph1= 0 2 2 0 1 3 3 1 ph2= 0 0 2 2 1 1 3 3ph31=0 2 2 0 1 3 3 1C脈沖序列分析a二自旋體系 考慮相循環(huán)的第一步I(/ItiI izI iyI 1 y COS( iti ) 11 x sin( iti )cos( iti )(Iiy cos( Ji2ti ) 2

7、Iixl2zSin( J12G )sin( iti)(hcos( Ji2ti) 2Iiyl2zSin( J12G )11 y cos( 1 ti )cos( Ji2ti )21ixl2zcos( iti)sin( Ji2ti )I1xsin( 1t )cos( J12t1 )2Iiyl2zSin(也)sin( J12G )(2)xIizcos( 1tI )cos( J12tI )2hl2ycos( iti )sin( Ji2ti)11x sin( 1t1 )cos( J12t1 )2Iizl2y sin( iti )sin( J12G )第一項為縱向磁化，第二項為多量子項，均不能被觀測到；第三

8、項仍然是第一核的橫向磁化，在檢測期的頻率同演化期類似，均是第一核的，對 應(yīng)于對角峰；第四項是第二核的反向磁化，在檢測期的頻率為第二核的化學(xué)位移，與演化期不同， 對應(yīng)于交叉峰，這是二維譜最有意義的峰。進一步將后兩項的系數(shù)分解：1sin( 1t1 )cos( J12t1) -sin(1.，sin( iti)sin( Ji2ti) 一 cos(可見，對角峰在 Fi維位于而交叉峰在Fi維也位于 i 正弦調(diào)制，另一個為余弦調(diào)制， 者不能同時調(diào)相成吸收型信號。itiitiJ12t1)sin( 1tlJi2ti ) cos( itiJi2ti )Ji2ti )1 ,同相裂分成兩個成分，距離 2 Ji2； ，

9、但反相裂分成兩個成分，距離也是2 對角峰信號與交叉峰信號在相位上相差J12。由于一個信號為 90度，故在Fi維兩2 Ji2；2 Ji2o由于注意的問題。而交叉峰與對角峰在相位相差 影響。90度，對于譜圖在對角線附近的質(zhì)量有重要的再看F2維，對角峰為同向磁化I僅，在檢測期呈現(xiàn)同相裂分，距離交叉峰在F2維為反向磁化2112 12y，在檢測期呈現(xiàn)反相裂分，距離也是個信號在x方向，另一個在y方向，兩者在相位上也相差 90度，故在F2維兩者也不能同時 調(diào)相成吸收型信號。COSY的交叉峰為反相峰，這一點非常重要，決定了 COSY型實驗采樣及處理時需要b多自旋體系 考慮Ii和I2間的交叉峰，類似的計算可得其

10、系數(shù)為： Ksin( iti )sin( Ji2ti)cos( Jikti)k 3其中的余弦項表明在 Fi維第一核相對除第二核(稱為主動偶合)外的其他核(稱為被動偶合)呈現(xiàn)同相裂分；同樣在F2維由于交叉峰的密度算符為第二核相對第一核的反相磁化，其中沒有出現(xiàn)被動偶合核的算符，即相對于被動偶合核為同相磁化，因此也呈現(xiàn)同相 裂分。pascal三角形描述；反相峰用反pascal三角形描述。Pascal triangleantiphase Pascal triangle111213311-110-111-1-1D實驗方案同其他二維譜相同處如確定譜寬，照射頻率，測定90度脈寬，選擇循環(huán)延遲時間等反相譜的特

11、殊處1由于兩維的交叉峰均是反相峰，因此兩維都要有足夠的分辨率，否則正負兩部分的信號 產(chǎn)生部分重疊，而使信號減弱；CTYPf： EXPt：RIMLN|5F1維的數(shù)據(jù)點數(shù)也越大，而實驗時間與2交叉峰的觀測信號包含 sin( J12t1 )sin( J12t2)， 由于同核偶合常數(shù)不大，通常幾Hz至十幾Hz,因.1 一 1此t1及t2的最大值要達到 至,這樣才能4J12 2J12獲得足夠強度的信號，這相當(dāng)于62-125ms (假定4Hz的偶合常數(shù))。對于 t2一般不成問題，但 t1則不然： 因為t1的增量由譜寬確定，t1的最大值越大意味著 Fi維點數(shù)成正比。對一般蛋白質(zhì)而言，通常置照射頻率在水峰處，

12、譜寬大致10ppm,接近5000Hz,因此t1的增量為0.2ms,若F1維點數(shù)取512, t1的最大值可達50ms左右；若Fi維點數(shù)取1024, t1的最大值可達100ms左右。因此一般 Fi維點數(shù)取512至1024。左圖顯示不同F(xiàn)i維點數(shù)的QCHAPTER 6 EipfrimfwtLh NMR Method 效果：a t1max=69ms,NS=16;b t1max=34.5ms,NS=32;c t1max=17.2ms,NS=648.1 8.0& f 8.0An/Gi fr峰班qilK 卜 A.4 WpfI；門也曦 nf Hw 1口國_：口曰f VXCV當(dāng)其中一個核為甲基時，由于磁全同的緣

13、故，出現(xiàn)多重裂分：同相峰可用E數(shù)據(jù)處理通常交叉峰總是調(diào)相成吸收線型，此 時對角峰呈色散線型。由于色散峰的 長拖尾對靠近對角線的交叉峰產(chǎn)生干 擾，所以必須加適當(dāng)?shù)拇昂瘮?shù)，通常 以不帶相移或略有相移的正弦函數(shù)或 正弦平方函數(shù)。左圖顯示不同相移的正弦窗函數(shù)作用 于Fi維的效果：a 30 度；b 20 度；c 10 度；d 5 度F應(yīng)用在高場區(qū)由于化學(xué)位移的簡并， 譜峰的重疊，對角峰的干擾，通常不 容易由COSY辨認整個自旋系統(tǒng)，在 蛋白質(zhì)COSY特別有用處是用于檢查 所謂的指紋區(qū)特別是酰胺質(zhì)子與質(zhì)CHAPTEH hNNMA MtncoosFhjUW Ilk ihc 皿 llit OiSV /現(xiàn)ruw

14、加方唾邛rml仃5小24，蛋白質(zhì)COSY上的幾個主要區(qū)域子的交叉峰。在這個區(qū)域，脯氨酸由 于沒有氨基沒有交叉峰；甘氨酸有兩 個 質(zhì)子故有兩個交叉峰 （除非兩者的 化學(xué)位移相同）；N端殘基上的NH由 于與水交換快也沒有交叉峰。除特殊情況外，對于不大的蛋白質(zhì)，所有的峰都應(yīng)該能找到。唱瓦M TFL LAleucine,isoleucine,valine 側(cè)鏈交叉峰alanine,threonine 甲基區(qū)T9 T55T7 門 T22n 跑sH6ES暗口時其9。 巳仰皿 &。G J偶合常數(shù)的測量在沒有被動偶合時，COSY的精細結(jié)構(gòu)可以用于測定 J偶合常數(shù)，但直接由譜峰的裂分 得到的值有較大的誤差。11

15、日颼6J0 osscr汨依3 Ummami plasc 即，dmbl jig1副 pu,t pUTiiwP 四篇 4d t-iTi(iwn a lifKY.nJl kI 屆 Jjjfealijj n Imts、e $膽舊刷 w : 4，閡axRih qU adid cid 生胤策IUZ. All nirvCK 01”四式 wll llw *line 劃上版t 1帕濁 1 ofinjly顯示表觀裂分與線寬的關(guān)系7.97.8797.8Fa (ppm)H COSY的變型COSY- 第二個90度脈沖用小于90度的脈沖代替，其結(jié)果是：對角峰被減弱多核體系中被動偶合產(chǎn)生的某些交叉峰被減弱，導(dǎo)致精細結(jié)構(gòu)的變

16、化，起到簡化圖譜 的作用COSY-Type likPLRiMtMs上圖比較 COSY-35 同普通COSY的圖 譜，GLY 的 1HN-1H 交叉峰結(jié)構(gòu)發(fā)生變 化，因而有利于 J 偶合常數(shù)的測定2 pre-TOCSYCOSY 預(yù)飽和同時抑制接近水峰的 H信號，因而從 H到其他質(zhì)子特別是 NH的交叉峰 減弱甚至消失，而NH到H的交叉峰往往淹沒在水峰產(chǎn)生的 ti噪聲中。在pre-TOCSY COSY 中，在COSY序列前插入一個短時間的 TOCSY混合脈沖，使其他質(zhì)子的信號先傳遞給 H,這樣可部分恢復(fù) H到其他質(zhì)子的信號。.2.2 Relayed COSY(R-COSY)A所謂接力譜，COSY的一

17、種擴展，在 COSY的二個脈沖后加一個延遲，使反向磁化進 步傳遞給第三個核，最后一個 90度脈沖完成第二核至第三核的相干傳遞，這樣觀測的第一核同第三核的交叉峰，雖然兩者可能并沒有 旋同屬一個自旋系統(tǒng)。ref1P12 P24 P40 ,即J偶合。顯然，接力譜中的交叉峰表明兩個自左圖為R-COSY的脈沖序列，基本相循環(huán)為8步：1= 0 2 0 2 0 2 0 22= 0 0 0 0 2 2 2 23= 0 0 0 0 0 0 0 04= 0 0 2 2 0 0 2 2ref= 0 2 0 2 0 2 0 2整個循環(huán)由二步1,二步2,二步4組成，而ref= 1,選擇條件變成2 P24 P4 0,由于

18、三者均是完整的二步循環(huán)，因此得選擇的相干傳遞1( Pl 1)途徑為：p產(chǎn) 1； P2=0, 2； P4=0, 2需要時可加上 CYCLOPS擴展成32步循環(huán)B脈沖序列分析考慮三核體系，1, 2核間以及2, 3核間有J偶合，而1, 3核間無J偶合。同樣只考 慮第一步相循環(huán)。經(jīng)過前二個脈沖作用，第一核產(chǎn)生的信號如COSY中所計算，在回波序列的作用下：22IxSin(也)cos( J12L ) 2IM2ysim 1L )sin( J12L ) xIxcos( J12 ) 2I1yl2zSin( J12 )sin(小)cos( J5)21zl2ycos( J23 ) 4l1zl2xl3zSin( J23 )sin(冷)sin( JJ1 )cos( J12 )12xcos( J23 ) 2l2yl3zSin( J23 )sin(小)sin( J12L )sin( J12 )最后一個90度脈沖產(chǎn)生：IxCOS( J12 ) 2I1zI2ysim J12 )sin(也)cos( J12G )211yl2zcos( J23 ) 41樂 sin( J23 )sin(也)sin( J12G )cos( J12 )12xcos( J23 ) 2