瓦楞子及其活性物質(zhì)研究進(jìn)展課件

1、瓦楞子及其活性物質(zhì)研究進(jìn)展瓦楞子簡(jiǎn)介瓦楞子，中藥名。為蚶科動(dòng)物毛蚶Arca subcrenata Lischke、泥蚶Arca granosa Linnaeus或魁蚶Arca inflata Reeve的貝殼。秋、冬至次年春捕撈，洗凈，置沸水中略煮，去肉，干燥。具有消痰化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，制酸止痛的功效。用于頑痰膠結(jié)，黏稠難咯，癭瘤，瘰疬，癥瘕痞塊，胃痛泛酸1。1.瓦楞子飲片J.光明中醫(yī),2016,31(06):834.瓦楞子的炮制方法及現(xiàn)代研究瓦楞子作為礦物類中藥需經(jīng)過炮制以后才可在臨床應(yīng)用中發(fā)揮療效。其炮制方法主要以法為主，相應(yīng)炮制規(guī)格為煅瓦楞子：取凈瓦楞子，照明煅法煅至酥脆；另有醋粹瓦楞子，

2、即在將瓦楞子煅燒后立即放入米醋中降溫。譚曉梅等3研究發(fā)現(xiàn)煅瓦楞子藥材飲片的平均煎出率 2. 37% ，煎出物中鈣平均質(zhì)量分?jǐn)?shù) 25. 85% ，其煎出物中的微量元素濃度均高于飲片，因此臨床用藥需要對(duì)其進(jìn)行煎煮。因此，馬愛華等4進(jìn)一步考察了粉碎度、煎煮用量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)對(duì)瓦楞子煎出率的影響，研究結(jié)果表明瓦楞子的煎出率以 60 目為最好，最大用量以 16 20 g 為宜，煎煮時(shí)間以 60 min 為佳，煎煮數(shù)以 3 次為宜。由于瓦楞子中的鈣離子易被機(jī)體吸收，其作 為 促 凝 血 劑，可增強(qiáng)止血作用。2陶明寶,張樂,王智磊,陳林,劉友平,陳鴻平.瓦楞子炮制歷史沿革及現(xiàn)代研究進(jìn)展J.中國實(shí)驗(yàn)方劑

3、學(xué)雜志,2017,23(05):216-221.3譚曉梅，王新雨，張明明，等 5 種貝殼類動(dòng)物藥及其煎出物中微量元素含量測(cè)定J 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17( 1) : 61-634馬愛華 粉碎度對(duì)石決明、珍珠母、牡蠣、瓦楞子煎出率的 影 響J 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，20 ( 3 ) :20-21瓦楞子古代臨床應(yīng)用瓦楞子性平，味咸，歸肺經(jīng)、胃經(jīng)、肝經(jīng)，具有消痰化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、制酸止痛的功效。屬化痰止咳平喘藥下屬分類的清化熱痰藥。傳統(tǒng)中醫(yī)常用其治療頑痰積結(jié)、黏稠難咯、癭瘤、瘰疬、癥瘕痞塊、胃痛泛酸。瓦楞子現(xiàn)代臨床應(yīng)用現(xiàn)代臨床中，瓦楞子多用于胃部疾病的治療。張冰教授5在臨床中對(duì)于泛酸實(shí)

4、證者常以瓦楞子配合桑螵蛸輔以理氣行滯之品，胃陰虛者輔以養(yǎng)陰清熱之品，若檢查提示潰瘍者則加白及等藥止血生新，均獲良效。此外還可用于皮膚外科疾病如凍瘡的治療。黃旺根6在瓦楞子用于 治療氣滯血痕 及消化道潰瘍窟血 阻滯者效果較好的啟發(fā)下,分析凍瘡的病因主要是由于血液微循環(huán)不暢即氣滯血疲引發(fā)的疾病,將瓦楞子散用于 治療凍瘡, 結(jié)果療效令人滿意, 不論是凍瘡初起紅腫還是 已潰爛流膿者,均取得明顯功效。5劉春紅,張冰.張冰運(yùn)用藥對(duì)治療脾胃疾病經(jīng)驗(yàn)J.湖南中醫(yī)雜志,2016,32(04):22-23.6黃旺根,徐錦池.瓦楞子散治凍瘡J.時(shí)珍國藥研究,1996(05):81.J2-C2是從Arca infla

5、ta的可食用部分分離出分子量為27,153.0Da的新型體外抗腫瘤蛋白（J2-C2）。使用物理化學(xué)和儀器分析表征J2-C2的物理和結(jié)構(gòu)特性。凝膠電泳分析顯示J2-C2是均一的單體蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為6.3。通過RP-HPLC測(cè)定，分離的天然J2-C2的純度 99。瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分J2-C28Zhu, J., Xu, J., Wang, Y., Li, C., Chen, Z., Song, L., . & Yu, R. (2017). Purification and structural characterization of a novel anti-tumor protein f

6、rom Arca inflata. International journal of biological macromolecules, 105, 103-110.從分子量為16.0和20.5 kDa的A. subcrenata獲得的兩種蛋白質(zhì)對(duì)人腫瘤細(xì)胞系顯示出高的抗增殖活性9-10和從A. inflata分離的20.5 kDa多肽具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞系11。 體外抗腫瘤活性。 通過ESI-MS / MS分析測(cè)定的J2-C2的分子量為27,153.0Da。瓦楞子的活性物質(zhì)研究9L.Y. Song, S.F. Ren, R.M. Yu, C.Y. Yan, T.F. Li, Y. Zhao

7、Purification, characterization and in vitro anti-tumor activity of proteins from Arca subcrenata Lischke Mar. Drugs, 6 (2008), pp. 418-43010L.L. Chen, L.Y. Song, T.F. Li, J.H. Zhu, J. Xu, Q. Zheng, R.M. YuAn antiprolifertive and antioxidant peptide isolated from Arca subcrenataMar. Drugs, 11 (2013),

8、 pp. 1800-181411J. Xu, Z.Y. Chen, L.Y. Song, L.L. Chen, J.H. Zhu, S.S. Lv, R.M. YuA new in vitro anti-tumor polypeptide isolated from Arca inflataMar. Drugs, 11 (2013), pp. 4773-4787多肽成分J2-C2使用MTT測(cè)定法在三種人癌細(xì)胞系中研究了J2-C2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。 用各種濃度的J2-C2處理所有測(cè)試的細(xì)胞。 如表所示，順鉑顯示出對(duì)A549，HepG2和SPC-A-1細(xì)胞系的抗增殖活性，IC50值分別為2.37,6

9、.10和3.42M。 J2-C2顯示出對(duì)A549，HepG2和SPC-A-1細(xì)胞系的抗增殖活性，IC50值分別為42.38,45.64和48.73M。 因此，發(fā)現(xiàn)J2-C2比從家蠶蛹中分離的天蠶素B肽對(duì)肺細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)的抗增殖活性12，并且對(duì)NCI-H520和NCI-的IC50值為58.8和100M。 分別為H661細(xì)胞系。瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分J2-C212J.M. Wu, P.S. Jan, H.C. Yu, H.Y. Haung, H.J. Fang, Y.I. Chang, J.W. Cheng, H.M. ChenStructure and function of a custo

10、m anticancer peptide, CB1aPeptides, 30 (2009), pp. 839-848研究人員從Arca inflata的可食用部分中純化出具有抗氧化和抗菌活性的多肽成分（J2-C4），認(rèn)為是A. inflata中一種新的肌漿鈣結(jié)合蛋白樣蛋白。體外抗氧化試驗(yàn)表明，J2-C4對(duì)ABTS +（EC50為145.80g/ mL）和DPPH（EC50455.62g/ mL）具有良好的清除活性。 J2-C4對(duì)銅綠假單胞菌（MIC：375g/ mL），大腸桿菌（MIC：187.5g/ mL）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MIC：750g/ mL）具有抗菌活性。結(jié)果表明，J2-C

11、4可能是一種潛在的食品添加劑13。瓦楞子的活性物質(zhì)研究13Wang, W., Shi, H., Zhu, J., Li, C., Song, L., & Yu, R. (2018). Purification and structural characterization of a novel antioxidant and antibacterial protein from Arca inflata. International journal of biological macromolecules, 116, 289-298.多肽成分J2-C4通過Bradford方法測(cè)定，J2-C4的

12、蛋白質(zhì)濃度為99.0（w / w）。通過比色苯酚 - 硫酸方法的改進(jìn)版本未檢測(cè)到碳水化合物。 RP-HPLC分析中蛋白質(zhì)的峰值是單一且對(duì)稱的，峰面積比率為97.62。結(jié)果表明，J2-C4可能是一種不含碳水化合物的天然蛋白質(zhì)瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分J2-C4SDS用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量分離和分析蛋白質(zhì)14,15，而IEF是鑒定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的有價(jià)值技術(shù)。 這兩種電泳技術(shù)可用于進(jìn)一步研究功能蛋白的基礎(chǔ)。 在該研究中，通過SDS測(cè)定J2-C4的亞基構(gòu)成。 SDS顯示J2-C4中的一條帶約為20kDa。 IEF也顯示單一條帶，等電點(diǎn)為5.18。 結(jié)果顯示J2-C4是單體的均質(zhì)蛋白質(zhì)。瓦楞子的活性物質(zhì)

13、研究14U.K. Laemmli Most commonly used discontinuous buffer system for SDS electrophoresisNature, 227 (1970), pp. 680-68815N.K. Singh, K.W. Shepherd, G.B. Cornish A simplified SDSprocedure for separating LMW subunits of glutenin J. Cereal Sci., 14 (1991), pp. 203-208多肽成分J2-C4FT-IR光譜學(xué)是一種提供蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)信息的

14、有力工具16。 J2-C4的FT-IR光譜如圖6所示。有一個(gè)寬的弱帶約3448.10cm-1，這是羥基伸縮振動(dòng)的特征吸收。 在1643.05cm-1處吸收的強(qiáng)峰是酰胺I的特征，并且表明在J2-C4中高百分比的-螺旋。 1376.93cm -1處的吸收應(yīng)該是酰胺中CN鍵伸縮振動(dòng)的特征。 因此，所有數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了J2-C4是一種蛋白質(zhì)。瓦楞子的活性物質(zhì)研究16H.B. Shen, Z.Q. Gu, K. Jian, J. Qi In vitro study on the binding of gemcitabine to bovine serum albumin J. Pharm. Biomed

15、. Anal., 75 (2013), pp. 86-93多肽成分J2-C4DPPH是即使在室溫下也保持穩(wěn)定的自由基之一。 它可以通過接受氫原子或電子來清除，導(dǎo)致517nm處的吸光度降低。 由于存在質(zhì)子供體物質(zhì)，溶液的顏色從深紫色變?yōu)辄S色17。 J2-C4的清除活性在最終實(shí)驗(yàn)濃度下是劑量依賴性的，EC50值為455.62g/ mL。 低于雞蛋蛋白水解物18的PSYV（17.0mg / mL），Katsuwonus pelamis暗肌38的WEGPK（4.438mg / mL）和GVPLT（4.541mg / mL），以及FIMGPY（2.60mg） / mL）來自Raja porosa軟骨的蛋

16、白質(zhì)水解產(chǎn)物19。 因此，目前的結(jié)果表明J2-C4是DPPH抑制劑。瓦楞子的活性物質(zhì)研究17H. Zhuang, N. Tang, Y. Yuan Purification and identification of antioxidant peptides from corn gluten meal J. Funct. Foods, 5 (2013), pp. 1810-1821C.F. Chi, F.Y. Hu, B. Wang, Z.R. Li, H.Y. Luo18Influence of amino acid compositions and peptide profiles on

17、antioxidant capacities of two protein hydrolysates from skipjack tuna (Katsuwonus pelamis) dark muscle Mar. Drugs, 13 (2015), pp. 2580-260119Preparation and identification of antioxidant peptides from protein hydrolysate of skate (Raja porosa) cartilage J. Funct. Foods, 25 (2016), pp. 220-230多肽成分J2-

18、C4使用盤擴(kuò)散法初步檢測(cè)了J2-C4對(duì)三種革蘭氏陽性菌和兩種革蘭氏陰性菌的抗菌活性。 將抑制區(qū)的直徑與陽性對(duì)照（環(huán)丙沙星）的直徑進(jìn)行比較以評(píng)估抗菌活性。 J2-C4對(duì)不同菌株顯示出不同程度的抗菌活性。 顯然，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌更敏感。 對(duì)大腸桿菌的抗菌活性優(yōu)于粗蛋白J2 20。 它也優(yōu)于來自A. subcrenata 21的PGC和從A. inflata中純化的血紅蛋白。 此外，J2-C4對(duì)MRSA也有抑制作用。瓦楞子的活性物質(zhì)研究20C.L. Li, J.H. Zhu, Y.Q. Wang, Y.Y. Chen, L.Y. SongAntibacterial activity of

19、AI-hemocidin 2, a novel N-terminal peptide of hemoglobin purified from Arca inflata Mar. Drugs, 15 (2017), p. 20521Y.Y. Chen, C.L. Li, J.H. Zhu, W.S. Xie, X.J. Hu, L.Y. Song, J.C. Zi, R.M. YuPurification and characterization of an antibacterial and anti-inflammatory polypeptide from Arca subcrenata

20、Int. J. Biol. Macromol., 96 (2017), pp. 177-184多肽成分J2-C4J2-C3為從Arca inflata Reeve中分離出一種新的體外抗腫瘤多肽，通過3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）測(cè)定法測(cè)定J2-C3對(duì)人腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用，并且J2-C3的IC50值為分別對(duì)A549，HT-29和HepG2細(xì)胞系分別為65.57,93.33和122.95g/ mL。因此，J2-C3可能被開發(fā)為潛在的抗腫瘤劑22。瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分J2-C322Xu, J., Chen, Z., Song, L., Chen, L.

21、, Zhu, J., Lv, S., & Yu, R. (2013). A new in vitro anti-tumor polypeptide isolated from Arca inflata. Marine drugs, 11(12), 4773-4787.將粗蛋白進(jìn)行苯基瓊脂糖凝膠CL-4B疏水層析獲得J2-C3，通過ESI-MS / MS測(cè)定的準(zhǔn)確分子量為20,538.0Da。 體外抗腫瘤活性的評(píng)估結(jié)果表明，J2-C3在所有組分中具有最強(qiáng)的抗增殖活性，對(duì)A549和HT-29細(xì)胞的IC50值分別為65.57和93.33g/ mL。 瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分J2-C3根據(jù)比色苯酚

22、 - 硫酸法的修改版23，J2-C3不是糖肽，該化合物中沒有任何糖類。 J2-C3的氨基酸組成顯示J2-C3中存在16種氨基酸，包括Glx（Gln + Glu），Lys和Asx（Asp + Asn）。瓦楞子的活性物質(zhì)研究23Yamazaki, M.; Kimura, K.; Kisugi, J.; Muramoto, K.; Kamiya, H. Isolation and characterization of a novel cytolytic factor in purple fluid of the sea hare, Aplysia kurodai. Cancer Res. 1989

23、, 49, 38343838.多肽成分J2-C3隨著J2-C3濃度的增加，J2-C3對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)。類似地,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率明顯增加。因此，J2-C3對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用以時(shí)間和濃度依賴性方式存在。 在48小時(shí)和72小時(shí)，J2-C3的IC50值分別為63.86和35.19g/ mL。瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分J2-C3通過磷酸鹽提取和離子交換層析從Arca inflata的外殼中純化出血紅蛋白（Hb-1）的抗菌亞基。使用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一種衍生自Hb-1的新型抗菌肽AI-hemocidin 2。它在廣譜微生物上顯示出抗菌活性，可能是解決抗生素抗性細(xì)

24、菌的潛在候選藥物24。瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分AI-Hemocidin 224Li, C., Zhu, J., Wang, Y., Chen, Y., Song, L., Zheng, W., . & Yu, R. (2017). Antibacterial Activity of AI-Hemocidin 2, a Novel N-Terminal Peptide of Hemoglobin Purified from Arca inflata. Marine drugs, 15(7), 205.通過BLAST搜索，A.inflata中的Hb-I與Scapharca inaequival

25、vis，Arca subcrenata和Tegillarca granosa的血紅蛋白亞基I具有高度相似性，但與脊椎動(dòng)物的血紅蛋白相關(guān)抗菌肽幾乎沒有相似性。一些研究表明脊椎動(dòng)物血紅蛋白具有明顯的抗菌活性25-28。然而，很少關(guān)注無脊椎動(dòng)物血紅蛋白和血紅蛋白的抗菌作用。與血紅蛋白亞基相比，血球蛋白具有更強(qiáng)的抗菌活性和穩(wěn)定性29-30，因此有可能成為有效的抗菌藥物。瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分AI-Hemocidin 225Zhang, Q.H.; Xu, Y.Z.; Wang, Q.; Hang, B.L.; Sun, Y.W.; Wei, X.X.; Hu, J.H. Potential of

26、 novel antimicrobial peptide p3 from bovine erythrocytes and its analogs to disrupt bacterial membranes in vitro and display activity against drug-resistant bacteria in a mouse model. Antimicrob. Agents Chemother. 2015, 59, 28352841.26Coates, C.J.; Decker, H. Immunological properties of oxygen-trans

27、port proteins: Hemoglobin, hemocyanin and hemerythrin. Cell. Mol. Life Sci. 2017, 74, 293317.28Zhuang, J.; Coates, C.J.; Zhu, H.; Zhu, P.; Wu, Z.; Xie, L. Identification of candidate antimicrobial peptides derived from abalone hemocyanin. Dev. Comp. Immunol. 2015, 49, 96102. 29Froidevaux, R.; Krier,

28、 F.; Nedjar-Arroume, N.; Vercaigne-Marko, D.; Kosciarz, E.; Ruckebusch, C.; Dhulster, P.; Guillochon, D. Antibacterial activity of a pepsin-derived bovine hemoglobin fragment. FEBS Lett. 2001, 491, 159163.30Pakdeesuwan, A.; Araki, T.; Daduang, S.; Payoungkiattikun, W.; Jangpromma, N.; Klaynongsruang

29、, S. In vivo wound healing activity of crocodile (crocodylus siamensis) hemoglobin and evaluation of antibacterial and antioxidant properties of hemoglobin and hemoglobin hydrolysate. J. Microbiol. Biotechnol. 2016, 27, 2635.瓦楞子的活性物質(zhì)研究多肽成分AI-Hemocidin 2Hb-1和AI-血友汀的抗菌活性如表3所示.Hb-1表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的足夠的抗

30、菌活性。在AI- hemocidins中，AI-hemocidin 2顯示出對(duì)測(cè)試菌株的高活性，除糞腸球菌外。金黃色葡萄球菌對(duì)AI- hemocidin 2的敏感性最高，MIC值為37.5g/ mL（22.77M）。與Hb-I相比，AI- hemocidin 2的抗菌作用增強(qiáng)。瓦楞子的活性物質(zhì)研究P2是一種來自重要漁業(yè)資源Arca subcrenata的海洋多肽組分。 基礎(chǔ)研究表明P2可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生以及人宮頸癌HeLa細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-的分泌7。 7Wu, Yu, et al. The inhibitory effect of a novel polypeptide fraction from Arca subcrenata on ca