家畜繁殖新技術(shù)

1、家畜繁殖新技術(shù)繁殖新技術(shù)產(chǎn)生的源由：動物繁殖學(xué)為動物科學(xué)的專業(yè)基礎(chǔ)課程動物繁殖學(xué)三大組成部分繁殖生理：生殖激素生殖生理配種受精妊娠分娩繁殖技術(shù)：人工授精同期發(fā)情胚胎移植體外受精等繁殖疾?。翰挥辉猩痴系K影響繁殖技術(shù)發(fā)展的因素繁殖學(xué)是整個畜牧學(xué)科應(yīng)用技術(shù)與理論研究發(fā)展最快的一門學(xué)科，繁殖技術(shù)又是現(xiàn)代生物工程技術(shù)(Biotechnology)的基礎(chǔ)。前者體現(xiàn)在生殖內(nèi)分泌的研究進(jìn)一下丘腦對生殖的調(diào)控作用，后者突出表現(xiàn)在核移植技術(shù)的成功六次革命人類作出了三大創(chuàng)舉：曼哈頓計劃阿波羅登月計劃人類基因組計劃生物工程技術(shù)的概念：利用生物體系應(yīng)用先進(jìn)的生物學(xué)和工程技術(shù)加工或不加工底物原料以提供所需的各種產(chǎn)品或

2、達(dá)到某種目的的一門新型的生物科學(xué)技術(shù)。生物工程技術(shù)的作用：可大大提高動物的繁殖效率提高生長速度降低生產(chǎn)成本可改變畜產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)可培育人們需要的新的動物品種可用動物代替生物反應(yīng)器繁殖新技術(shù)的內(nèi)容生物工程技術(shù)在家畜繁殖上的應(yīng)用基因重組利用技術(shù)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞融合利用技術(shù)嵌合體胚胎與核移植技術(shù)核移植組織培養(yǎng)利用技術(shù)體外受精細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)胚胎干細(xì)胞生物反應(yīng)堆與酶技術(shù)酶工程胚胎分割的生理基礎(chǔ)：胚胎發(fā)育早期的卵裂球具全能性即發(fā)育成一完整個體的能力胚胎分割的意義在于：可使可用胚胎數(shù)成倍生長、可獲得遺傳上幾乎完全相同的后代、可作為生物學(xué)研究模型胚胎分割的方法歸納為四種：1、Willadsen的分割法程序：分割移入空

3、透明帶雙層瓊脂包埋中間受體同種受體2、Williams的分割法程序：分割移入空透明帶同種受體3、玲木分割法程序：透明帶內(nèi)分割注入大分子物質(zhì)溶液同種移植4、簡易分割法胚胎分割的應(yīng)用前景與胚胎移植結(jié)合可提高受胎率可得到同卵雙生后代在牛避免孿生母犢不育可作為理想的試驗研究材料為胚胎性別鑒定提供了條件胚胎分割存在的一些問題體重并非完全相同毛色和斑紋往往有差異生出的動物出現(xiàn)異常與畸形嵌合體：兩個或兩個以上受精卵發(fā)育的復(fù)合個體嵌合體的制作：一、聚合法1、胚胎聚合法（程序）：1）采集胚胎2）除去透明帶3）洗滌4）配對5）融合化學(xué)融合法（聚乙二醇法.仙臺病毒法.外源凝集素法）-電融合法6）培養(yǎng)7）移植2、卵裂

4、球聚合法（程序）（同胚胎聚合法）將兩枚或兩枚以上胚胎在除去透明帶后將離散的分裂球按需要取出共同放入一空透明帶內(nèi)PHA集合瓊脂包埋移植二、囊胚注入法又稱向囊胚內(nèi)注入細(xì)胞法優(yōu)點(diǎn)：1）對著床需透明帶的動物十分有利2）既可制造ICM嵌合體又可使TR成為嵌合體三、囊胚重組法嵌合體的標(biāo)記標(biāo)記物必需滿足的條件1）固定在細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)不能跑到細(xì)胞外2）穩(wěn)定存在于最初標(biāo)記的細(xì)胞及因分裂而增殖的細(xì)胞3）發(fā)育期間普遍存在于機(jī)體外組織4）應(yīng)當(dāng)容易識別5）在胚胎中應(yīng)處于中性標(biāo)記方法1）人工標(biāo)記-活體染色素或油等珠狀物放射性物質(zhì)等2）遺傳標(biāo)記-反應(yīng)生物個體或群體特征的某些性狀物質(zhì)體外受精：將動物的精子與卵子置于體外在人工條

5、件下完成受精的過程稱為體外受精體外受精的優(yōu)點(diǎn)：基礎(chǔ)研究方面1能直接觀察到受精的動態(tài)過程2可以得到難以得到的一些動物的受精卵應(yīng)用研究方面3可以作為治療不孕癥的一種方法4可為其它新技術(shù)的應(yīng)用提供更多的胚胎來源體外受精的程序配子獲得輸卵管卵+體內(nèi)獲能的精子輸卵管卵+體外獲能的精子卵泡卵+體內(nèi)獲能的精子卵泡卵體+外獲以能的精子卵子的采取非激素處理法激素處理法精子的采取屠宰法射出的精子2配子培養(yǎng)培養(yǎng)基單純培養(yǎng)基復(fù)合培養(yǎng)基配子處理與培養(yǎng)系統(tǒng)精子處理1）Percoll密度梯度離心法2）精子上游分離法精子孵育誘發(fā)獲能+體液（卵泡液、血清等）+限定培養(yǎng)液或合成培養(yǎng)液方法1）高PH孵育法2）鈣離子載體法3）肝素鈣

6、孵育法培養(yǎng)系統(tǒng)：開放式培養(yǎng)系統(tǒng)、封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)和滴培養(yǎng)滴培養(yǎng)：培人皿-培養(yǎng)液-卵子-沖洗-石臘油-CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（動物有特定溫度表）卵子成熟的標(biāo)志卵丘細(xì)胞的成熟判別：1）卵丘細(xì)胞的分散程度2）卵丘細(xì)胞內(nèi)空泡變大3）卵丘細(xì)胞異染色質(zhì)增多、核孔明顯、核空泡化卵母細(xì)胞核的成熟判別：4）核遷移至動物極質(zhì)膜下成為生發(fā)泡（GerminalVesicle,GV）卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟判別：5）胞內(nèi)皮質(zhì)顆粒由勻散狀態(tài)向質(zhì)膜下遷移6）高爾基復(fù)合體由核周圍移向皮質(zhì)遷移-消失7）線粒體由核周圍皮質(zhì)區(qū)核周圍8）早期粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）豐富成熟時RER減少授精（分配卵子到精子懸浮液中）過程看到的現(xiàn)象：1、在透明帶表面可以看

7、到很多精子2、多精子受精頻率增加3、精子超活化現(xiàn)象受精的標(biāo)準(zhǔn)1）少數(shù)動物卵母細(xì)胞內(nèi)可見到精子2）卵母細(xì)胞質(zhì)中有膨脹的精子頭部3）卵周隙內(nèi)存在第二極體或明確的第一極體4）卵子激活排出第二極體5）雌雄原核形成并融合6）卵周隙變大有時見到精子影響受精的因素：溫度精子數(shù)培養(yǎng)的條件牛體外受精操作程序：1配制配子洗滌液、培養(yǎng)液、受精液2采集處理配子3授精體外受精液中有關(guān)成分的作用犢牛血清和血白蛋白乳酸丙酮酸咖啡因和肝素3FSH和PMSG精子注射：把精子直接注射到透明帶下卵周隙中或注意到卵細(xì)胞質(zhì)中有人將前者稱為精子轉(zhuǎn)移或精子植入，后者稱為精子注射精子注射處理與要求：注入細(xì)胞質(zhì)的精子可以是不活動的精子或精核注

8、入卵周隙的精子應(yīng)為活動的已獲能的和已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子才能獲得較高的受精率為避免精子在注射針內(nèi)移動必需限制精子活動：一是將精子加入含有甲基纖維素的粘稠培養(yǎng)液中二是將精子冷卻到10oC三是為便于精子注射可設(shè)法加大卵周隙：生精細(xì)胞顯微受精生精細(xì)胞顯微受精是利用變態(tài)前的球形精子細(xì)胞（次級精母細(xì)胞或初級精母細(xì)胞）與不同發(fā)育時期的卵母細(xì)胞進(jìn)行受精它包括透明帶下授精和卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)受精3.1意義與作用：揭示雌雄配子間的相互作用和受精本質(zhì)保護(hù)和挽救瀕危珍稀動物品種利用初情期以前幼年動物繁殖后代治療老齡與先天性異常引起的雄性動物不育癥若用精細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因所得的后代一定是全部攜帶目的基因的個體將分離到體外的精細(xì)胞

9、移植到睪丸中沒有精細(xì)胞的小鼠曲精細(xì)管內(nèi)可獲得移植精細(xì)胞發(fā)育的后代3.2方法電融合法卵胞質(zhì)內(nèi)注射法3.3技術(shù)研究與應(yīng)用細(xì)胞周期與卵激活差異正常受精卵子停滯于第二次減數(shù)分裂中精子已完成減數(shù)分裂顯微受精顯微受精成功的動物與存在問題成功的動物：小鼠劉靈等侖鼠兔存在的問題：2/3的雄原核較小但不影響胚胎進(jìn)一步發(fā)育ICSI與IFV比較25%受精卵不能同步形成雌雄原核7%受精卵可能形成3個原核體外受精胚胎在體外的發(fā)育往往不能與子宮完全同期化，在囊胚移植時需要做輔助脫出透明帶處理，而且體外受精的結(jié)果不同。核移植1、概念：借助顯微操作和細(xì)胞融合技術(shù)把遺傳型不同的胚胎細(xì)胞核和卵細(xì)胞質(zhì)相結(jié)合重組成新的合子的過程得到

10、的胚胎稱為重組胚（reconstitutedembryos）或核移植胚2目的：1）查明胚胎細(xì)胞核和體細(xì)胞核是否保持合子細(xì)胞核的全部遺傳信息2）體細(xì)胞核是否能代替合子核所起的作用3）轉(zhuǎn)移供體核基因生產(chǎn)多個同基因動物4）作為動物和人類疾病模型5）作為生產(chǎn)藥物的天然工廠現(xiàn)代生物學(xué)中克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”它經(jīng)歷三個發(fā)展階段：1）微生物克隆2）生物技術(shù)克隆3）動物克隆克隆技術(shù)發(fā)展的過程哺乳動物核移植的起始人Mcgranth和Solter第一個報道成功的是Illmensee和Hope核移植必須具備的條件顯微操作設(shè)備2制作吸管裝置3體外培養(yǎng)系統(tǒng)核移植的方法核供/受體細(xì)胞來源與當(dāng)前需要解決的問題核供體

11、：胚胎細(xì)胞：目前主要是用桑椹期前的卵裂球成體細(xì)胞：胎兒的成纖維細(xì)胞乳腺上皮細(xì)胞輸卵管細(xì)胞卵丘細(xì)胞孤雌生殖細(xì)胞成體細(xì)胞從增殖的角度可分為三類：1）連續(xù)分裂細(xì)胞2）休眠細(xì)胞3）分化細(xì)胞核受體：處于中期II的卵母細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的方法其一采用人工捕獲的方法，即通過限制細(xì)胞培養(yǎng)基中某些成份，從而使大部分細(xì)胞滯留在細(xì)胞周期的某一階段；其二通過選擇細(xì)胞類型來獲得當(dāng)前需要解決的問題：遠(yuǎn)緣細(xì)胞核移植受體細(xì)胞選擇關(guān)于核供體和核受體細(xì)胞質(zhì)的協(xié)調(diào)性重構(gòu)胚的卵裂速度與供核體細(xì)胞的發(fā)育速度一致與生殖系統(tǒng)關(guān)系越密切的細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育潛力越大核質(zhì)重構(gòu)后代性狀主要與供體相似或為核質(zhì)混合狀態(tài)性別控制方法X和Y精子的分離X和Y精子

12、的分離方法A沉降法B密度梯度離心法：C電泳法D流式細(xì)胞分選法性別鑒定1非損害性方法1）測定與X染色體相關(guān)聯(lián)的酶的活性2）免疫法（HY抗原法或單克隆抗體法）方法：免疫動物選擇（高度近交系）制備抗血清HY抗原檢測A細(xì)胞毒性分析法B免疫熒光分析法C囊胚形成抑制法；損害性方法1）細(xì)胞遺傳學(xué)分析（又稱核型鑒定）特點(diǎn)準(zhǔn)確率100%獲得高質(zhì)量的中期染色體分裂相難取樣滋養(yǎng)層細(xì)胞卵裂球分割半胚2）分子生物學(xué)分析法（DNA探針（原位雜交技術(shù)FISH）方法以待檢測的核酸序列為模板用TAQ酶催化引物限制DNA合成經(jīng)變性退火延伸三個步驟可使擴(kuò)增片斷以2N的指數(shù)積累即在2小時內(nèi)使待檢測的核酸擴(kuò)展數(shù)百萬倍特點(diǎn)特異好靈敏度高

13、簡便快速難點(diǎn)分離Y染色體序列分離SRY序列確定序列位置及拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因是將特定的外源基因?qū)雱游锸芫鸦蚺咛ナ怪€(wěn)定整合于動物的染色體組并能遺傳給后代的技術(shù)。能檢測出導(dǎo)入新DNA的動物就稱為轉(zhuǎn)基因動物。通過使用實驗手段將外源基因?qū)雱游锏纳臣?xì)胞并由此發(fā)育成個體且整合外源基因又能向后代遺傳的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。攜帶外源基因并能表達(dá)遺傳的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物而外源基因可能只整合入動物部分組織、細(xì)胞的基因組，稱為嵌合體動物。轉(zhuǎn)基因的意義經(jīng)典育種方法的限制性遺傳信息只能在同種或親緣關(guān)系很近的種間才有可能交換重組選擇的條件是變異或突變自然變異的比例不足1%可在沒有親緣關(guān)系的種間進(jìn)行遺傳信息交換和重組可在很

14、短時間產(chǎn)生服從于人們需要的突變具體表現(xiàn)在：可作為生命現(xiàn)象解密的工具1）轉(zhuǎn)基因動物疾病模型可用來進(jìn)行疾病發(fā)病學(xué)和治療性研究；2）可以提高家畜的經(jīng)濟(jì)性狀3）可從遺傳上改變畜產(chǎn)品的組成結(jié)構(gòu)4）以家畜為宿主生產(chǎn)有用的生理活性物質(zhì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：可以培育出生產(chǎn)性狀優(yōu)良的超級動物群可以制備出高增殖的蛋白和激素類藥物可以按人的需求提供動物產(chǎn)品二家畜轉(zhuǎn)基因的方法原生質(zhì)體融合法重組病毒感染法微細(xì)胞介導(dǎo)法高速冷凍法細(xì)胞融合法顯微注射法精子載體法胚胎細(xì)胞介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒法等乳腺暫態(tài)表達(dá)家畜轉(zhuǎn)基因的方法顯微注射法（microinjection）在顯微鏡下借助玻璃微吸管將外源基因注射進(jìn)細(xì)胞的一種方法。這種方法是建立得

15、最早也是最有效的方法其最大的優(yōu)點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移率高不需原核載體DNA片段導(dǎo)入外源基因長度可達(dá)100kb精子載體法既往精子作載體所采用的方法為體外孵育法，如今有采用體內(nèi)轉(zhuǎn)染法：這其中可將外源基因直接導(dǎo)入精細(xì)管，可直接導(dǎo)入附睪管。胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法這種方法的優(yōu)點(diǎn)：囊胚腔易于注射整合率高（50%）可在體外對靶細(xì)胞進(jìn)行基因的定位插入整合可對目的基因型干細(xì)胞進(jìn)行克隆難點(diǎn)：EK/ES細(xì)胞株的建立原始生殖細(xì)胞介導(dǎo)法原始生殖細(xì)胞（PrmordialGermCell,PGCs）介導(dǎo)法與ES法技術(shù)原理和方法相似。5逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法（Retrovirusts）方式：1）48細(xì)胞胚胎先去除透明帶與反轉(zhuǎn)錄病毒共培養(yǎng)病毒感染胚

16、細(xì)胞病毒的RNA被逆轉(zhuǎn)錄成病毒DNA這樣DNA就可能被整合到胚胎細(xì)胞中去體外培養(yǎng)1624小時移入受體。2）將濃縮的病毒或產(chǎn)生病毒的細(xì)胞注射到48細(xì)胞的透明帶下同上。優(yōu)點(diǎn)：無需顯微操作感染率高宿主范圍廣可以同時處理大量胚胎外源基因為單拷貝整合可直接進(jìn)行囊胚腔注射。缺點(diǎn)：1）得到的大部分是嵌合體外源基因遺傳給后的很少2）每一基因都要構(gòu)建一個重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體3）這種載體容量小通常為7kb大于9.4kb就不穩(wěn)定6、非病毒載體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法：脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉?；驹?利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞

17、內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。受體介導(dǎo)法體細(xì)胞核移植法（轉(zhuǎn)基因克?。⑼庠椿?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植（把體細(xì)胞核植入一個去了核的卵母細(xì)胞中，融合并激活），將重組胚進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動物的輸卵管。乳腺暫態(tài)表達(dá)乳腺基因?qū)氲姆椒ㄓ袃煞N：乳頭管導(dǎo)入法乳腺直接導(dǎo)入法不同轉(zhuǎn)基因方法技術(shù)效果比較1顯微注射法優(yōu)點(diǎn)：外源DNA大小基本不受限制（l-50kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高;缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對操作人員有較高的技術(shù)要求低效率（尤其是大家畜）對卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨

18、機(jī)性轉(zhuǎn)基因沉默2胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難；維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易；所得個體為嵌合體；逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法優(yōu)點(diǎn)：受精卵攜帶外源基因的陽性率高；外源基因多單拷貝整合；操作簡單，避免注射法對卵子的損害；宿主范圍廣；可同時感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高；缺點(diǎn)：容納大小有限；潛在致癌性,載體復(fù)雜；整合率不高,胚胎自我保護(hù)機(jī)制對其有抗性；與微注射相比，對插入序列的容量有限，總長大于9.4Kb，就不穩(wěn)定或很難成活,通常為7

19、Kb。通過這種方法引入的DNA的表達(dá)取決于內(nèi)部的啟動子。體細(xì)胞核移植法優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因效率顯著超過顯微注射可以方便的建立生產(chǎn)畜群可以預(yù)測基因表達(dá)水平可以使用定點(diǎn)整合目標(biāo)基因的技術(shù)YAC法利用酵母人工染色體（YAC）作為載體制作轉(zhuǎn)基因動物的方法。酵母人工染色體（YAC）載體是近年來發(fā)展起來的新型載體，能克隆百萬對堿基的大片段DNA。優(yōu)點(diǎn)：保證大片段DNA的完整性保證較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中的整合率高保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性,因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)。因此YAC介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因動物具有廣闊的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)基因的整合和表達(dá)外源基因的整合的機(jī)制目前尚不清楚,整合效率與DNA

20、的濃度,結(jié)構(gòu)形式,以及卵母細(xì)胞來源都有一定關(guān)系外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的表達(dá)主要有三種方式：A、細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)，大多為這種方式，表達(dá)量與內(nèi)源基因相似；B、外源基因在所有器官顯著表達(dá)，改變了動物表型和原來形狀；C、外源基因在動物發(fā)育的適當(dāng)時期與內(nèi)源基因一起激活。大部分轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的表達(dá)比較低的,之前對這種現(xiàn)象的解釋是轉(zhuǎn)基因受位置效應(yīng)的影響?，F(xiàn)在認(rèn)為之所以不表達(dá)是由于多拷貝重復(fù)序列導(dǎo)致了該區(qū)域異染色質(zhì)化,從而使轉(zhuǎn)基因沉默。培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家畜的技術(shù)問題第一是技術(shù)本身的問題：理論基礎(chǔ)積累不足和技術(shù)不完全，結(jié)果隨機(jī)整合，且整合率低；家畜的外源基因的整合率低于實驗動物。一般是高度近交系品種整合具有穩(wěn)定

21、性。表達(dá)率不高,產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物效率低。不了解基因表達(dá)的發(fā)育控制和組織特異性控制。第二是家畜本身的問題：排卵數(shù)的差異，卵細(xì)胞透明度差，采集原核期胚胎的準(zhǔn)確時間難以把握，妊娠期長產(chǎn)仔數(shù)少費(fèi)時耗資大。六基因敲除和基因嵌入技術(shù)基因敲除簡單的說基因敲除是指將目標(biāo)基因從基因組中刪除基因嵌入（geneknockin）又稱基因置換，它是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個置換內(nèi)源基因。干細(xì)胞：是具有自我復(fù)制和多項分化潛能的原始細(xì)胞胚胎干細(xì)胞簡稱ES/EK細(xì)胞，是一種從早期胚胎ICM或原始生殖細(xì)胞（PrimodialGarmCellsPGCs）圖，經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離和克隆得到的具全

22、能性的細(xì)胞（圖6-3）。2干細(xì)胞的類型（表6-1）成體干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞（全能性多能性多向分化/跨系分化單向）一研究進(jìn)展1958年Stevens最早發(fā)現(xiàn)畸胎瘤細(xì)胞（EmbryoniccarcinomacellEC）,他通過把小鼠早期胚胎移植到129只小鼠精巢或腎臟的被膜下得到EC細(xì)胞。這些細(xì)胞可在體外進(jìn)行培養(yǎng)，被用作研究動物胚胎發(fā)育與遺傳，以及細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗?zāi)Ｐ团c正常胚胎的未分化細(xì)胞極為相似胚獎體。注入囊胚可形成嵌合體（但常會形成腫瘤或?qū)е屡咛ニ劳觯┯信咛ゼ?xì)胞發(fā)育的多能性在體外能不斷增殖并保持不分化的狀態(tài)多數(shù)EC細(xì)胞不具正常的二倍體核型，染色體數(shù)也不完整ES細(xì)胞的特征：全能性和相當(dāng)于4.5日

23、齡的胚胎細(xì)胞；具胚胎細(xì)胞特征核型，為正常二倍體；具外分化能力，皮下接種可產(chǎn)生畸胎瘤。目前研究的側(cè)重點(diǎn)在于：1）ES細(xì)胞系的建立條件2）影響因素的探討3）細(xì)胞核型的穩(wěn)定性及變異4）ES細(xì)胞系的利用途徑用PGCS建立干細(xì)胞系雖然由于其遷移特性導(dǎo)致貼壁率較低但來源比較豐富一存在問題：不同細(xì)胞系和同一細(xì)胞系不同亞系之間細(xì)胞的多能性和注射到胚胎腔后參與生殖系典型嵌合的能力不同分離到的ES細(xì)胞在以后的培養(yǎng)中由于實驗室的條件不同或培養(yǎng)條件中某些不良因子作用和積累以及倍增水平的增加ES細(xì)胞的染色體也會出現(xiàn)不穩(wěn)定。胞質(zhì)對后代的影響還有待研究克隆胚的培養(yǎng)冷凍及重復(fù)克隆仍有待改進(jìn)和提高體細(xì)胞克隆其技術(shù)還待完善和提高

24、成功率大型動物克隆還有亟待解決的問題二建立ES細(xì)胞系的方法與步驟1建立ES細(xì)胞系的條件使ES細(xì)胞成千上萬倍的克隆而不分化STO（小鼠成纖維細(xì)胞無限系）成纖維細(xì)胞PMEF（原始成纖維細(xì)胞）前者國外已商品化飼養(yǎng)層細(xì)胞具上述作用的原因：這兩面類細(xì)胞可釋放出成纖維細(xì)胞生長和分化抑制因子，如白血病抑制因子2飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備用STO或胎兒成纖維細(xì)胞試驗表明后者優(yōu)于前者方法：1）取適齡的胎兒一去頭內(nèi)臟及血管一剪粹一蛋白酶消化一取細(xì)胞液一置DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長后胰蛋白酶消化分離細(xì)胞培養(yǎng)2）生長抑制處理一是輻照二是加絲裂霉素ES細(xì)胞的分離：ES細(xì)胞取自附植前的胚胎措施：一要選擇適當(dāng)胚齡的胚胎二要采用正確的

25、分化抑制物方式一是免疫外科手術(shù)法消化透明帶、滋養(yǎng)層細(xì)胞以暴露內(nèi)細(xì)胞團(tuán)二是直接機(jī)械剝離法將胚胎培養(yǎng)至孵出囊胚階段然后用機(jī)械方法直接撿出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞前一種方法，分離率高，所得細(xì)胞的數(shù)量多，但復(fù)雜繁瑣；后一種方法簡單易行，但滋養(yǎng)層細(xì)胞不易去除干凈。如何確定內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的全能性：目前多采用AKP和SSEA1進(jìn)行檢測三是熱休克法四是延緩著床法ES細(xì)胞的培養(yǎng)ES細(xì)胞在經(jīng)處理的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)液是DMEM其中還要添加血清、巰基乙醇、四種核苷酸及少量必須氨基酸抗菌素等值得注意的是：1）培養(yǎng)時及時定期更換培養(yǎng)液2）細(xì)胞系生成后要及時轉(zhuǎn)移消化、克隆傳代或冷凍保存5ES細(xì)胞系的驗證明體外細(xì)胞形態(tài)特征體積大小一致細(xì)胞

26、核大胞質(zhì)胞漿少細(xì)胞排列緊密邊緣整齊完整核型上可見核和核仁與完整的染色體數(shù)和整倍體核型在沒有飼養(yǎng)層的情況下體外懸浮培養(yǎng)能分化成多種組織體內(nèi)將ES細(xì)胞注射至皮下產(chǎn)生畸胎瘤或與正常胚胎嵌合構(gòu)成嵌合體三應(yīng)用前景探討早期胚胎發(fā)育的條件研究早期胚胎組織分化的發(fā)生與誘導(dǎo)用ES細(xì)胞與正常胚胎細(xì)胞嵌合在體外重建胚胎三種方法核移植法細(xì)胞聚合法囊胚注射法重組前可根據(jù)目的和試驗設(shè)計需要對ES細(xì)胞進(jìn)行處理得到特殊用途的動物ES細(xì)胞體外定位整合外源DNA對于研究有關(guān)早期胚胎發(fā)育與表達(dá)中基因的活動及其功能有十分重要的意義：利用ES細(xì)胞體外定位整合外源DNA通過對特定基因的滅活或修復(fù)得到轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)中觀察其細(xì)

27、胞生理及生化性質(zhì)變化引入動物種系后可間接了解基因的功能與作用機(jī)理可通過動物模型對人類的某些遺傳疾病進(jìn)行模擬定位，整合的原理是DNA的同源重組其程序：構(gòu)建同源序列（靶序列）一一引入ES細(xì)胞產(chǎn)生同源重組（即外源DNA取代與其同源的染色體DNA片斷而進(jìn)入受體基因組）引入的方法：病毒感染法顯微注射法電穿孔導(dǎo)入法基因打靶：1）選定要改造的基因2）克隆該基因的全部或部分DNA序列（靶序列）3）克隆靶序列的載體（靶載體）插入或目的基因靶序列從靶載體上切下來篩選整合外源DNA的ES細(xì)胞構(gòu)建嵌合體關(guān)于ES細(xì)胞的研究在人類疾病的治療具有重要的潛在價值干細(xì)胞又一個重要的潛在用途是生產(chǎn)細(xì)胞和組織，它們可用于所謂的“細(xì)

28、胞療法”。許多疾病及功能失調(diào)往往是由于細(xì)胞功能障礙或組織破壞所致。雖然這項研究有著極為誘人的前景，但要使其成為現(xiàn)實，尚有許多工作和技術(shù)挑戰(zhàn)等著我們?nèi)ソ鉀Q。首先我們必須做些基礎(chǔ)研究，以理解導(dǎo)致人體中細(xì)胞特化的細(xì)胞事件，從而能夠指導(dǎo)這些多能干細(xì)胞發(fā)育成移植所需的特殊組織類型。其次，在利用這些細(xì)胞進(jìn)行移植之前，還必須克服免疫排斥問題。由于來自胚胎或胎兒組織的人體多能干細(xì)胞與移植受者在遺傳上有差異，因此將來的研究將集中于改變?nèi)梭w多能干細(xì)胞，將組織不相容性降到最低，或是創(chuàng)建具有通用組織類型的組織庫。ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)原則上應(yīng)滿足兩個條件：1促進(jìn)ICM細(xì)胞增殖1）培養(yǎng)基DMEM適用于生長速度快貼壁性差的細(xì)

29、胞Evans和Kaufman2）添加劑的運(yùn)用非必需氨基酸檸檬酸核苷酸硒酸鈉丙酮酸鈉等（作為蛋白質(zhì)合成原料或提供能量物質(zhì)）3）血清供給營養(yǎng)促進(jìn)DNA合成（血清質(zhì)量影響組織培養(yǎng)）4）生長因子對胚胎保持最佳生長速度有一定作用胰島素樣生長因子胰島素表皮生長因子轉(zhuǎn)鐵蛋白成纖維細(xì)胞生長因子抑制ES細(xì)胞分化的因素：1）胚齡的選擇用于分離ES細(xì)胞的胚胎，胎齡越小，分化程度越低，越具有全能性目前，各種動物一般采用囊胚期的胚胎來分離ES細(xì)胞。2）飼養(yǎng)層選擇胚胎成纖維細(xì)胞用來制作飼養(yǎng)層后，能夠抑制ES細(xì)胞的分化，其原理一般認(rèn)為是飼養(yǎng)層能夠分泌白血病抑制因子和aFGF、bFGF。目前采用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有3種：STO（已建