臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)：第六章 沉淀反應(yīng)

1、第六章 沉淀反應(yīng)chapter 16 PrecipitaonImmunology .免疫學(xué)沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)。1897年Kraus發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)液與相應(yīng)抗血清混合時(shí)可發(fā)生沉淀反應(yīng)。1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其上，發(fā)現(xiàn)沉淀反應(yīng)可在凝膠中進(jìn)行。1946年Oudin報(bào)告試管免疫擴(kuò)散技術(shù)。1965年Mancini建立單向免疫擴(kuò)散技術(shù)。20世紀(jì)70年代免疫比濁法出現(xiàn)，沉淀反應(yīng)快速、微量和自動(dòng)化建立第一節(jié) 液相沉淀反應(yīng)liquuid phase precipitation液相沉淀試驗(yàn)是指可溶性抗原與相應(yīng)的抗體在含電解質(zhì)的液體介質(zhì)中反應(yīng)，

2、形成肉眼可見的沉淀物的試驗(yàn)。分為：絮狀沉淀試驗(yàn)、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、免疫濁度分析。一、絮狀沉淀反應(yīng)原理：將抗原抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原于抗體結(jié)合，形成絮狀沉淀物。 技術(shù)類型： 1.抗原稀釋法（Dean-Webb 法） 2.抗體稀釋法（Ramon 法） 3.棋盤格法（Checkerboard 法)1.抗原稀釋法（Dean-Webb ）抗原稀釋法（DeanWebb法）是將抗原作一系列稀釋，與恒定濃度的抗血清等量混合，室溫或37反應(yīng)后，形成的沉淀物的量隨抗原量變化而不同。離心沉淀后，分別測定沉淀物總量和上清中游離的抗體或抗原量。沉淀物產(chǎn)生量最多，上清中無反應(yīng)過剩物的AbAg比例，即為最適比

3、。表16-1系以牛血清白蛋白為例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表表16-12.抗體稀釋法抗體稀釋法（Ramon法）是將恒定量抗原與不同程度稀釋的抗體反應(yīng)。計(jì)算結(jié)果同上法，得出的是抗體結(jié)合價(jià)和抗體最適比。3.棋盤格法為了同時(shí)取得抗原與抗體的最佳比例，可將以上兩法結(jié)合，即抗原和抗體同時(shí)稀釋，稱為棋盤格法（亦稱方陣法），找出最佳配比。舉例見表16-2。表16-2 最適比的方陣測定法二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)原理：將抗原溶液疊加在細(xì)小玻璃管中抗體溶液上面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結(jié)合，形成白色沉淀環(huán)。Ascoli 1902年創(chuàng)立抗原抗體沉淀環(huán) 方法學(xué)評(píng)價(jià)：該方法操作簡便、快速。敏感性低（3-20mg/L)，只能定性。主要用

4、于鑒定微量抗原，如鑒定血跡，診斷炭疽?，F(xiàn)在很少使用。第二節(jié) 凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)Gel phase precipitation凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)是將可溶性抗原和相應(yīng)抗體分別放入凝膠內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，兩者在比例合適的位置形成肉眼可見的沉淀環(huán)或沉淀線。常見的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠。凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)類型一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)（single gel diffusion) 1.試管法 2.平板法二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)(double gel diffusion) 1.免疫電泳 2.對流免疫電泳 3.火箭免疫電泳 4.免疫固定電泳一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)1.試管法 1946年Oudin首次報(bào)道。將抗血清或純化抗體混入約5

5、0oC的0.7%瓊脂糖溶液中，注入小口徑試管內(nèi)，帶凝固后，在凝膠上面加入抗原溶液，讓抗原自由擴(kuò)散入凝膠內(nèi)，在抗原與抗體比例恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。 本法多用于排泄物和組織均勻漿中的細(xì)菌、寄生蟲、螺旋體等抗原的檢測。沉淀線 圖16-1 2種抗血清形成的沉淀線示意圖AgAb一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)二、平板法 1.原理：待測抗原從局部含有相應(yīng)定量抗體的凝膠內(nèi)自由向周圍擴(kuò)散，抗原抗體特異性結(jié)合，在兩者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原的濃度呈正相關(guān)。2.技術(shù)要點(diǎn)：將抗體或抗血清混入0.9%的瓊脂糖內(nèi)，未凝固前傾注呈平板，凝固后在瓊脂板上打孔（直徑約3-5mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37oC

6、讓其向四周擴(kuò)散，2448后可見孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。3.數(shù)據(jù)處理1.Mancini曲線：適用于大分子抗原和長時(shí)間擴(kuò)散（48h)的結(jié)果處理。使用方格計(jì)算紙劃線，擴(kuò)散環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C/d2=K3.數(shù)據(jù)處理2.Fahey曲線：適用于小分子抗原和較短時(shí)間（24h)擴(kuò)散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)紙劃線，濃度的對數(shù)與擴(kuò)散圈的直徑之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC/d=KlogC4.臨床應(yīng)用常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量測定。二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)1.原理：將抗原和抗體溶液分別放在凝膠不同的對應(yīng)孔中，讓兩者在凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，濃度比例適當(dāng)處形成可見的白色沉淀線

7、。 2.技術(shù)要點(diǎn)將加熱融化的瓊脂傾注一均勻的凝膠薄層，待瓊脂凝固后，在瓊脂膠板上打孔，在相對應(yīng)的孔中分別加入抗原或抗體，置室溫或37 18-24小時(shí)，觀察沉淀線。3.方法評(píng)價(jià)是抗原抗體鑒定的最基本的方法之一。本試驗(yàn)是一種穩(wěn)定、簡便的方法，不需要特殊儀器設(shè)備，重復(fù)性好，但靈敏度稍差（1.25mg/L)。4.臨床應(yīng)用1.抗原或抗體的存在與否及其相對含量的估算 出現(xiàn)沉淀線，表明存在相應(yīng)的抗原和抗體，不出現(xiàn)沉淀線則表明抗原或抗體的缺乏。沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致，沉淀線靠近抗原孔，提示抗體含量高；靠近抗體孔，提示抗原含量較多。出現(xiàn)多條沉淀絨，則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，雙向免疫

8、擴(kuò)散可用于鑒定抗原或抗體的純度。2分析抗原或抗體的相對分子量 抗原或抗體在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散的速度受分子量的影響。分子量大擴(kuò)散慢，擴(kuò)散圈小，局部濃度則較大，因此形成的沉淀線彎向分子量大的一方。如二者分子量相等，則形成直線（圖16-5）?？贵w多為IgG，分子量約150kD，據(jù)此可粗略估計(jì)未知抗原的分子量。圖16-53用于抗原性質(zhì)的分析 兩種受檢抗原的性質(zhì)可完全相同、部分相同或完全不同。在一塊瓊脂板上打三個(gè)孔，二個(gè)孔中加入抗原，一個(gè)孔中加入抗體，擴(kuò)散后通過沉淀線的形態(tài)可鑒定兩種抗原的性質(zhì)（圖16-6）。這種技術(shù)作為抗原的分析，是免疫化學(xué)中較常用的鑒定技術(shù)之一。圖16-64用于抗體效價(jià)的滴定 雙向擴(kuò)散技術(shù)是

9、抗血清抗體效價(jià)滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原、抗體雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴(kuò)散，形成沉淀線。出現(xiàn)沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價(jià)。圖16-7第三節(jié) 免疫電泳技術(shù)免疫電用技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。兩大優(yōu)點(diǎn)：1.加快了沉淀反應(yīng)的速度； 2.將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，在分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳技術(shù)（immunoelectrophoresis technique）是將免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種免疫學(xué)分析技術(shù)。由Grabar與Williams于1953年創(chuàng)立，此項(xiàng)技術(shù)由于既有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又有電泳分離技術(shù)的快速，靈敏

10、和高分辨力，至今仍是免疫學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，在?jīng)典的免疫電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，又派生出很多新的技術(shù)和方法。一、免疫電泳是區(qū)帶電泳與免疫雙擴(kuò)散的結(jié)合。1953年Grabar和Williams首先報(bào)道。根據(jù)各蛋白所出的電泳位置，可分為白蛋白區(qū)、球蛋白a1區(qū)、a2區(qū)、b區(qū)、區(qū)。圖16-8其基本原理是將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，樣品中不同的抗原成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，電泳遷移率各異，而被分離成肉眼不可見的若干區(qū)帶。停止電泳后，在與電泳方向平行的瓊脂槽內(nèi)加入相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者比

11、例合適處形成肉眼可見的弧形沉淀線。 圖16-8血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標(biāo)準(zhǔn)（或正常）抗原、抗體形成的沉淀線比較，即可對樣品中所含成分的種類及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分二、對流免疫電泳原理 在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測抗原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽極側(cè)。通電后，帶負(fù)電荷的抗原泳向陽極側(cè)，而抗體籍電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在二者之間或抗體的另一側(cè)（抗原過量時(shí)）形成沉淀線。+三、火箭電泳(Rocket immunoelectrophoresis)RIE:又稱為單向擴(kuò)散免疫沉淀技術(shù)。操作：在含抗體的瓊脂板一端打一

12、排抗原孔；加入待測標(biāo)本后，將抗原置陰極端，用橫距23mA/cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳?？乖鞠蜿枠O，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭。用途：抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原呈正比，用已知量標(biāo)準(zhǔn)佐對照，可以測定未知標(biāo)本中的抗體含量。火箭電泳示意圖三、火箭電泳操作時(shí)的注意事項(xiàng)：1.所用瓊脂要選擇無電滲或電滲很小的，否則，火箭形狀不規(guī)則。2.注意電泳終點(diǎn)時(shí)間，如火箭電泳頂部呈部清晰的云霧狀或圓形皆提示未達(dá)到終點(diǎn)。3.標(biāo)本數(shù)量多時(shí)，電泳板應(yīng)先置電泳槽上，搭橋并開啟電源（電流要?。┖笤诩訕印７駝t易形成寬底峰形，使定量不準(zhǔn)。4.作IgG定量時(shí)，由于抗原和抗體的性

13、質(zhì)相同，火箭峰因電滲呈紡錘狀。以甲醛（與IgG上的氨基結(jié)合）甲酰化IgG糾正。四、免疫固定電泳（Immunofixation electrophpresis, IFE）IFE：將抗血清直接加于電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，或?qū)⒔锌寡宓臑V紙貼于其上，抗原與對應(yīng)抗體直接發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物嵌于固相支持物中。將未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則出現(xiàn)被結(jié)合固定的某種蛋白。區(qū)帶電泳支持物選用濾紙、醋酸纖維薄膜、瓊脂或聚丙烯酰胺皆可。常用于M蛋白的鑒定。法國SEBIA 全自動(dòng)電泳儀HYDRASYS HYDRAPLUS 2 樣品稀釋準(zhǔn)備系統(tǒng) 電泳儀第四節(jié) 免疫濁度分析技術(shù)Immunoturbidimetry20世紀(jì)

14、70年代建立。它是將液相內(nèi)的沉淀試驗(yàn)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)分析技術(shù)。當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)的抗體特異結(jié)合，在二者比例合適、并有一定濃度的電解質(zhì)存在時(shí)，可以形成不溶性的免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用肉眼或儀器測知，并可通過濁度推算出復(fù)合物的量，即抗原或抗體的量。免疫濁度測定是定量測定微量抗原物質(zhì)一種高靈敏度、快速的自動(dòng)化免疫分析技術(shù),其應(yīng)用廣泛。免疫濁度分析方法類型一、透射免疫比濁法二、速率抑制免疫比濁法三、散射免疫比濁法四、免疫膠乳濁度測定法一、透射免疫濁度測定法原理：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液過量時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量

15、的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出受檢物質(zhì)的含量。技術(shù)要點(diǎn):1）抗原參考品及待測標(biāo)本作適當(dāng)稀釋；2）將待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原液（5個(gè)濃度）與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處檢測各管吸光度；（3）以劑量-反應(yīng)曲線求得標(biāo)本中抗原的濃度。入射光透射光散射光方法評(píng)價(jià)：本法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，能用全自動(dòng)化或半自動(dòng)化儀器進(jìn)行分析。靈敏度低于散射比濁法，但比單擴(kuò)散法高5-10倍?？贵w用量較大，檢測需抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，耗時(shí)較長。不宜用于藥物半抗原的檢測。二、散射免疫比濁法 1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的抗原抗體復(fù)合物微

16、粒上時(shí)，部分光線發(fā)生散射的原理，通過測量散射光的強(qiáng)度來得知待測抗原的量，這種比濁測定法稱為散射比濁法（nephelometry）。1977年Sternberg進(jìn)一步發(fā)展建立了速率散射比濁法（rate nephelometry），使微量抗原的定量測定得以快速靈敏地進(jìn)行?；驹?散射比濁法是指沿水平軸照射的一定波長的光，通過溶液時(shí)光線被免疫復(fù)合物粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。反應(yīng)溶液中的懸浮分子，無論是固體或膠體粒子都可以是散射中心。當(dāng)入射光通過時(shí)，如果顆粒直徑比入射光的波長小很多（入射光波長的1/101/20），則散射光在各個(gè)方向上的分布比較均勻，稱為Rayleigh散射；粒徑與入射光的

17、比例增大，正向散射光強(qiáng)度趨于增強(qiáng)，當(dāng)粒徑略小于入射光波長時(shí)，稱為Debye散射；如果顆粒直徑接近或大于入射光波長時(shí)，則散射光呈明顯的不均勻分布，稱為Mile散射。式中I為與入射光成角度處散射光的強(qiáng)度；和I0 分別為入射光的波長和強(qiáng)度；r為焦點(diǎn)至檢測器的距離；N為散射粒子數(shù)（抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量）；V為粒子的體積；n為粒子的折射率；n0為溶劑的折射率；為入射光與散射光的夾角。入射光波長越小，散射光越強(qiáng)；散射光強(qiáng)度與粒子的濃度和體積成正比；散射光強(qiáng)度隨焦點(diǎn)至檢測器距離的平方和而下降。 因此，在散射比濁中，增加抗原抗體復(fù)合物的體積，減少入射光的波長，將檢測點(diǎn)盡可能地接近散射源并選擇合適的檢測夾角，都

18、可使檢測的靈敏度增加。由于散射比濁法測定的是散射光的信號(hào)，避免了透射光中所含有的透射、散射甚至折射等雜信號(hào)成分的影響，因此，散射比濁法的靈敏性和特異性均好于透射比濁法。散射比濁法類型終點(diǎn)散射比濁法（end-point nephelomtry）速率散射比濁法（rate nephelometry）（一）終點(diǎn)散射比濁法抗原、抗體相遇后免疫沉淀反應(yīng)立即開始，但反應(yīng)達(dá)到平衡通常需1030min。免疫濁度測定應(yīng)在復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進(jìn)行，否則光散射值降低，影響測定結(jié)果。因此，終點(diǎn)散射比濁通常是在免疫反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間時(shí)測量其濁度，故亦可稱為定時(shí)散射比濁(fixed time nephelometry

19、)。（二）速率散射比濁法速率散射比濁法是一種先進(jìn)的動(dòng)力學(xué)測定法，1977年由Sternberg首先用于免疫學(xué)測定。所謂速率是指單位時(shí)間內(nèi)抗原與抗體反應(yīng)的速度。抗原與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的速度，在每個(gè)單位時(shí)間內(nèi)是不相同的，在抗體過量的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，免疫復(fù)合物的總量逐漸增加，通常在25s時(shí)出現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)最快的速率峰。峰值與抗原量呈正相關(guān)。圖16-13 抗原抗體反應(yīng)的速率變化time散射光強(qiáng)度到達(dá)峰值時(shí)間三、速率抑制免疫比濁法rate inhibition immunoturbidimetry本法是一種競爭性結(jié)合或競爭性抑制試驗(yàn)，主要用于測定半抗原和藥物等小分子物質(zhì)。試劑中的特異性抗體

20、是由半抗原與載體蛋白偶聯(lián)后，免疫動(dòng)物制備而成。 試驗(yàn)時(shí)先將一定量的已知半抗原-載體（大分子）與限量的特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，生成的免疫復(fù)合物可形成一定的速率散射峰值。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)加入待檢標(biāo)本時(shí)，其中所含的半抗原（小分子）與抗體競爭結(jié)合，使大分子的半抗原-載體-抗體復(fù)合物的形成受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程度與標(biāo)本中的待測半抗原（或藥物）成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出標(biāo)本中待測物質(zhì)的含量。四、免疫膠乳濁度測定法immunolatex turbidimetry原理： 將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗原時(shí)，則使乳膠顆粒發(fā)生凝集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)不阻礙光線透過，兩

21、個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)，則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳凝集的程度呈正比，當(dāng)然也與待測抗原量呈正比。五、免疫濁度分析的影響因素 抗原抗體反應(yīng)的比例 抗體試劑的質(zhì)量 抗原抗體反應(yīng)的溶液 增濁劑的作用 （一）抗原抗體反應(yīng)的比例濁度法中的免疫反應(yīng)遵循抗原抗體反應(yīng)的一般規(guī)律。免疫濁度測定的反應(yīng)體系中必須始終保持抗體過量，以保證免疫復(fù)合物的生成量與濁度的改變一致，這是免疫濁度測定的基本原則?？贵w過剩必須適量，因此實(shí)驗(yàn)中掌握抗體的濃度是個(gè)關(guān)鍵。 為了減少非特異性濁度（“偽濁度”）的出現(xiàn)，還應(yīng)對抗原（待測樣品）進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?。（二）抗體試劑的質(zhì)量 1抗體的質(zhì)量：免疫比濁測定法要求抗體的特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)。2抗體的類型 ：根據(jù)抗血清來源的動(dòng)物種類不同，抗體可分為R型（rabbit type）和H型（horse type）。 R型抗體是用于免疫比濁測定的