日本血吸蟲（中國(guó)大陸株）尾蚴的性別鑒定

1、登記序號(hào) 項(xiàng)目編號(hào) 科研設(shè)計(jì)書項(xiàng)目名稱： 日本血吸蟲尾蚴性別鑒定應(yīng)用技術(shù)的研究承擔(dān)單位： 單位地址： 郵政編碼： 開 戶 行： 帳 號(hào)： 1103021109000077488項(xiàng)目負(fù)責(zé)人： 電 話： 職務(wù)職稱： 填報(bào)日期 2004年7月28日江蘇省地方病協(xié)會(huì)二四年制立項(xiàng)依據(jù)：血吸蟲是一具有兩性染色體的吸蟲，有8對(duì)染色體，其中雌性性染色體為異配子體（ZW），雄性為同配子體（ZZ）。盡管雌性和雄性成蟲階段具有明顯的性別二態(tài)性，可用肉眼區(qū)別，但在幼蟲階段即毛蚴、胞蚴和尾蚴階段，無(wú)明顯的性別二態(tài)性，肉眼難以區(qū)別。傳統(tǒng)動(dòng)物感染方法，是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取感染了血吸蟲的鼠或其它嚙齒類動(dòng)物的肝、腸或糞便收集蟲卵，孵

2、化毛蚴，用單只毛蚴感染單只釘螺，養(yǎng)殖篩選陽(yáng)性釘螺，獲得單性尾蚴，用以感染嚙齒動(dòng)物，待其發(fā)育至成蟲階段，解剖動(dòng)物收集成蟲，用肉眼或在解剖顯微鏡下根據(jù)形態(tài)學(xué)的差異，確定感染尾蚴性別。然而，單性雌性尾蚴不能發(fā)育到完全成熟的成蟲，給鑒別帶來(lái)一定困難。同時(shí)常規(guī)方法需要花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，日本血吸蟲從尾蚴感染動(dòng)物到發(fā)育成熟至少需3周。采用分子生物學(xué)的方法，可快速鑒定尾蚴的性別。代表性差異分析（RDA）方法是基于遞減雜交法，用于發(fā)現(xiàn)兩DNA基因組群間差異，是一種改良的扣除雜交法，并可用于分離基因組間差異性片段。由于血吸蟲為兩性染色體的吸蟲，其雄性為同性配子體（ZZ），而雌性為異性配子體（ZW）。RDA方法從宏觀上看

3、，系用雄蟲染色體ZZ去扣除雌蟲染色體中的Z，從而獲得W染色體。Drew A.C.等（1995）采用此方法分離出兩段曼氏血吸蟲雌性特異性序列，并將其制備成探針，用Southern blot 方法證實(shí)只與曼氏血吸蟲雌性基因組DNA特異性雜交。W1重復(fù)序列作為雌性特異性序列，存在于曼氏血吸蟲波多黎各株生活史的各個(gè)階段。并根據(jù)曼氏血吸蟲雌性該特異性序列W1設(shè)計(jì)出一對(duì)引物W1a和W1b。直接加入該引物對(duì)單個(gè)尾蚴作PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果雌性尾蚴呈現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-W1條帶，雄性尾蚴不呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶。此方法能快速、可靠地用來(lái)鑒定曼氏血吸蟲尾蚴的性別?；诼涎x尾蚴性別鑒定的現(xiàn)有方法，為探索適合日

4、本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法提供了理論和方法依據(jù)。利用代表性差異分析（RDA）方法，分離出日本血吸蟲雌性特異性序列，將此特異性序列制備成DNA探針，用Southern blot 方法鑒定日本血吸蟲尾蚴性別。也可對(duì)此特異性序列進(jìn)行測(cè)序，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)單個(gè)尾蚴的DNA作PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，則雌性尾蚴呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶，雄性則不呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶，從而用PCR方法可快速鑒定日本血吸蟲單個(gè)尾蚴的性別。研究日本血吸蟲尾蚴的性別鑒定技術(shù)，建立日本血吸蟲尾蚴快速鑒定應(yīng)用技術(shù)有助于血吸蟲幼蟲階段生物學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究；對(duì)血吸蟲病疫苗評(píng)價(jià)方法的標(biāo)準(zhǔn)化、遺傳學(xué)的研究；及其流行病學(xué)、感染診斷和病理學(xué)研究結(jié)果的正確評(píng)價(jià)；

5、不同性別尾蚴的易感性和感染比率以及減蟲率（減雌率）和減卵率的正確評(píng)估等均具有重要的意義。同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)適合我國(guó)國(guó)情的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定試劑盒打下基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)：研究?jī)?nèi)容1.1 用代表性差異分析方法獲得日本血吸蟲雌性基因組DNA特異性序列。1.2 對(duì)特異性序列測(cè)序，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增。1.3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立一種簡(jiǎn)單、快速的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。關(guān)鍵技術(shù)2.1 日本血吸蟲雄蟲、雌蟲基因組DNA的提取2.2 代表性差異分析方法（RDA）和PCR。2.3 低熔點(diǎn)凝膠回收雌性特異性片段2.4 大腸桿菌E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞的制備技術(shù)、DNA的重組和克隆篩選、重組D

6、NA的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒DNA的提取。2.5 DNA探針的制備和Southern blot 驗(yàn)證方法2.6 雌性特異性序列測(cè)序和引物設(shè)計(jì)。目標(biāo)建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。研究方法及技術(shù)路線1. 用傳統(tǒng)方法確定尾蚴的性別，獲取單性尾蚴樣本 以逸蚴法篩選出陰性釘螺用于感染，所有用于實(shí)驗(yàn)的螺均篩選3次。1.2 以單只毛蚴感染單只釘螺；螺感染后在光照培養(yǎng)箱中養(yǎng)殖90天或在春夏季室溫條件下養(yǎng)殖100天。逸蚴法篩選出陽(yáng)性釘螺，取單性尾蚴感染小鼠，35天后剖殺，取成蟲確定尾蚴的性別。并分別收集單性尾蚴分別編號(hào)保存于-70液氮備用。2. 用代表性差異分析方法分離日本血吸蟲雌性特異性序列2.1

7、 感染家兔4只，每只約用1500-1800條尾蚴。45天后剖殺家兔，收集成蟲，在解剖鏡下將成蟲雌雄分開，分別保存于-70液氮中備用。2.2 取雌蟲、雄蟲各200條用基因組DNA提取試劑盒分別提取雌蟲和雄蟲的基因組DNA。2.3 用限制性內(nèi)切酶Hind對(duì)雌蟲、雄蟲DNA進(jìn)行酶切。將酶切產(chǎn)物與兩條適配子（R Hind24,5-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3和R Hind12,5-AGCTTGCGGTGA-3）組成的接頭用T4連接酶進(jìn)行連接。2.4 以連接物為摸板，做PCR擴(kuò)增；并瓊脂糖凝膠電泳看連接情況。2.5 擴(kuò)增子的純化 對(duì)雌蟲、雄蟲DNA的PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純

8、化，限制性內(nèi)切酶Hind酶切。將酶切后的PCR產(chǎn)物過(guò)交聯(lián)葡聚糖G-50柱去除適配子接頭R Hind24和R Hind12。如此制備的雌蟲DNA為檢測(cè)子，雄蟲DNA為驅(qū)動(dòng)子。2.6 扣除雜交法及PCR2.6.1 取以上的檢測(cè)子1ug連接新的適配子接頭（J Hind24 5-ACCgACgTCgACTATCCATgAACA-3和J Hind12 5-AgCTTgTTCATg-3）；然后取0.5ug帶有新接頭的檢測(cè)子與40ug的驅(qū)動(dòng)子溶于4ul的3EE緩沖液中，加入1ul的5M的NaCL，扣除雜交，67、20小時(shí)；并做PCR和瓊脂糖凝膠電泳。2.6.2 將RDA的第一輪PCR產(chǎn)物酶切后，過(guò)交聯(lián)葡聚糖

9、G-50柱去除適配子接頭J Hind24和J Hind12，連接下一個(gè)新的適配子接頭（N Hind24 5-AggCAgCTgTggTATCgAgggAgA-3和N Hind12 5-AgCTTCTCCCTC-3），取檢測(cè)子0.1ug與40ug驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行第二輪RDA，PCR和瓊脂糖凝膠電泳。2.6.3 同上，酶切后過(guò)交聯(lián)葡聚糖G-50柱去除適配子接頭N Hind24和N Hind12，再連接適配子接頭J Hind24和J Hind12，取400pg檢測(cè)子與40ug驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行第三輪扣除雜交，PCR和瓊脂糖凝膠電泳。2.7 將獲得的特異性DNA片段進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收，PCR純化試劑盒純化。2

10、.8.1 制備大腸桿菌E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)以E.coli TG1菌株為受體細(xì)胞，用氯化鈣處理是受體菌處于感受狀態(tài)。2.8.2 DNA的重組和克隆篩選：將獲得特異性DNA片段連接到載體質(zhì)粒pUC19制得重組質(zhì)粒；經(jīng)-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選（藍(lán)白斑篩選）方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選。2.8.3 重組DNA的轉(zhuǎn)化：用電擊轉(zhuǎn)化的方法，設(shè)定電擊儀參數(shù)（電脈沖25uF、電壓2.5KV、電阻200）；吸取一定量的感受態(tài)細(xì)胞和重組質(zhì)粒pUC19，加入預(yù)冷的電擊杯，放入樣品池，按以上設(shè)定參數(shù)啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的電脈沖，儀器會(huì)顯示4-5ms具有12.5KV/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度，脈沖結(jié)束后，將細(xì)胞取出加入到1mlSOC培養(yǎng)液

11、中復(fù)蘇1h，接種于特制平板上，37培養(yǎng)。2.8.4 挑選培養(yǎng)出的單個(gè)白色菌落，接種于液體培養(yǎng)；用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。2.9 Southern-blot 方法驗(yàn)證：利用DIG DNA Labeling andDetection Kit制備DNA探針和Southern-blot驗(yàn)證。3. 將經(jīng)Southern-blot方法驗(yàn)證出的雌蟲特異性序列進(jìn)行測(cè)序，并設(shè)計(jì)引物。4. 根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物，對(duì)提取的成蟲基因組DNA和已知性別的尾蚴DNA作PCR，瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行證實(shí)。5. 根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物，采用直接法（不提取DNA）對(duì)單個(gè)尾蚴作PCR，瓊脂糖凝膠電泳，來(lái)確定此尾蚴的性別。6日本血

12、吸蟲尾蚴性別鑒定PCR法操作條件優(yōu)化研究?，F(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：1 工作基礎(chǔ)本實(shí)驗(yàn)室是江蘇省寄生蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寄生蟲學(xué)為江蘇省135重點(diǎn)學(xué)科，擁有清潔級(jí)小鼠動(dòng)物房，從事寄生蟲免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究二十余年，在儀器設(shè)備上完全具備進(jìn)行寄生蟲免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究以及動(dòng)物試驗(yàn)的的條件。有一定的專業(yè)技術(shù)和專業(yè)人員隊(duì)伍，人員配置合理。儀器設(shè)備主要包括溫控設(shè)備：4、-20、-70冰箱、THZ-95型恒溫振蕩器、SCS-24型搖床、光照培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、微波爐等；凈水設(shè)備：MilliQ水純化設(shè)備；消毒設(shè)備：高壓蒸氣滅菌鍋；計(jì)量設(shè)備：各種精密度天平、量筒、移液管及各種規(guī)格的可調(diào)試微量移液器、PH計(jì)、紫外分光光度計(jì)等；離心設(shè)備：各種不同規(guī)格的普通、高速冷凍離心機(jī)；蛋白核酸分析設(shè)備：DY-A瓊脂糖凝膠電泳儀、多功能蛋白電泳儀（Bio-Rad）、核苷酸序列分析儀（Bio-Rad）、核酸蛋白測(cè)定儀(BECKMAN)、快速蛋白液相層析系（Pharmacia）等；其它分子生物學(xué)儀器：PCR儀、超聲儀、電穿孔轉(zhuǎn)基因儀、干膠儀、酶標(biāo)儀、凝膠掃描儀、影像密度掃描儀等。計(jì)劃進(jìn)度：總期限一年：1-3月 采購(gòu)釘螺，并篩選陰性釘螺。2-4月 購(gòu)陽(yáng)性釘螺并感染家兔，剖殺家兔收集成蟲和蟲卵。4-5月 單只毛蚴感染單只釘螺.4-5月 訂購(gòu)試劑5-11月 分離雌蟲特異性序列，并測(cè)序和設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行尾蚴性別鑒定。11-1