日本血吸蟲（中國大陸株）尾蚴的性別鑒定

1、登記序號 項目編號 科研設計書項目名稱： 日本血吸蟲尾蚴性別鑒定應用技術的研究承擔單位： 單位地址： 郵政編碼： 開 戶 行： 帳 號： 1103021109000077488項目負責人： 電 話： 職務職稱： 填報日期 2004年7月28日江蘇省地方病協(xié)會二四年制立項依據(jù)：血吸蟲是一具有兩性染色體的吸蟲，有8對染色體，其中雌性性染色體為異配子體（ZW），雄性為同配子體（ZZ）。盡管雌性和雄性成蟲階段具有明顯的性別二態(tài)性，可用肉眼區(qū)別，但在幼蟲階段即毛蚴、胞蚴和尾蚴階段，無明顯的性別二態(tài)性，肉眼難以區(qū)別。傳統(tǒng)動物感染方法，是在實驗室內取感染了血吸蟲的鼠或其它嚙齒類動物的肝、腸或糞便收集蟲卵，孵

2、化毛蚴，用單只毛蚴感染單只釘螺，養(yǎng)殖篩選陽性釘螺，獲得單性尾蚴，用以感染嚙齒動物，待其發(fā)育至成蟲階段，解剖動物收集成蟲，用肉眼或在解剖顯微鏡下根據(jù)形態(tài)學的差異，確定感染尾蚴性別。然而，單性雌性尾蚴不能發(fā)育到完全成熟的成蟲，給鑒別帶來一定困難。同時常規(guī)方法需要花費時間長，日本血吸蟲從尾蚴感染動物到發(fā)育成熟至少需3周。采用分子生物學的方法，可快速鑒定尾蚴的性別。代表性差異分析（RDA）方法是基于遞減雜交法，用于發(fā)現(xiàn)兩DNA基因組群間差異，是一種改良的扣除雜交法，并可用于分離基因組間差異性片段。由于血吸蟲為兩性染色體的吸蟲，其雄性為同性配子體（ZZ），而雌性為異性配子體（ZW）。RDA方法從宏觀上看

3、，系用雄蟲染色體ZZ去扣除雌蟲染色體中的Z，從而獲得W染色體。Drew A.C.等（1995）采用此方法分離出兩段曼氏血吸蟲雌性特異性序列，并將其制備成探針，用Southern blot 方法證實只與曼氏血吸蟲雌性基因組DNA特異性雜交。W1重復序列作為雌性特異性序列，存在于曼氏血吸蟲波多黎各株生活史的各個階段。并根據(jù)曼氏血吸蟲雌性該特異性序列W1設計出一對引物W1a和W1b。直接加入該引物對單個尾蚴作PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳。結果雌性尾蚴呈現(xiàn)擴增產物PCR-W1條帶，雄性尾蚴不呈現(xiàn)擴增條帶。此方法能快速、可靠地用來鑒定曼氏血吸蟲尾蚴的性別?；诼涎x尾蚴性別鑒定的現(xiàn)有方法，為探索適合日

4、本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法提供了理論和方法依據(jù)。利用代表性差異分析（RDA）方法，分離出日本血吸蟲雌性特異性序列，將此特異性序列制備成DNA探針，用Southern blot 方法鑒定日本血吸蟲尾蚴性別。也可對此特異性序列進行測序，設計一對引物，對單個尾蚴的DNA作PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，則雌性尾蚴呈現(xiàn)擴增條帶，雄性則不呈現(xiàn)擴增條帶，從而用PCR方法可快速鑒定日本血吸蟲單個尾蚴的性別。研究日本血吸蟲尾蚴的性別鑒定技術，建立日本血吸蟲尾蚴快速鑒定應用技術有助于血吸蟲幼蟲階段生物學和生理學實驗的研究；對血吸蟲病疫苗評價方法的標準化、遺傳學的研究；及其流行病學、感染診斷和病理學研究結果的正確評價；

5、不同性別尾蚴的易感性和感染比率以及減蟲率（減雌率）和減卵率的正確評估等均具有重要的意義。同時為進一步開發(fā)適合我國國情的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定試劑盒打下基礎。主要研究內容、關鍵技術、目標：研究內容1.1 用代表性差異分析方法獲得日本血吸蟲雌性基因組DNA特異性序列。1.2 對特異性序列測序，設計引物，PCR擴增。1.3 實驗室內建立一種簡單、快速的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。關鍵技術2.1 日本血吸蟲雄蟲、雌蟲基因組DNA的提取2.2 代表性差異分析方法（RDA）和PCR。2.3 低熔點凝膠回收雌性特異性片段2.4 大腸桿菌E.coli TG1感受態(tài)細胞的制備技術、DNA的重組和克隆篩選、重組D

6、NA的轉化及質粒DNA的提取。2.5 DNA探針的制備和Southern blot 驗證方法2.6 雌性特異性序列測序和引物設計。目標建立一種簡單、快速、靈敏的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。研究方法及技術路線1. 用傳統(tǒng)方法確定尾蚴的性別，獲取單性尾蚴樣本 以逸蚴法篩選出陰性釘螺用于感染，所有用于實驗的螺均篩選3次。1.2 以單只毛蚴感染單只釘螺；螺感染后在光照培養(yǎng)箱中養(yǎng)殖90天或在春夏季室溫條件下養(yǎng)殖100天。逸蚴法篩選出陽性釘螺，取單性尾蚴感染小鼠，35天后剖殺，取成蟲確定尾蚴的性別。并分別收集單性尾蚴分別編號保存于-70液氮備用。2. 用代表性差異分析方法分離日本血吸蟲雌性特異性序列2.1

7、 感染家兔4只，每只約用1500-1800條尾蚴。45天后剖殺家兔，收集成蟲，在解剖鏡下將成蟲雌雄分開，分別保存于-70液氮中備用。2.2 取雌蟲、雄蟲各200條用基因組DNA提取試劑盒分別提取雌蟲和雄蟲的基因組DNA。2.3 用限制性內切酶Hind對雌蟲、雄蟲DNA進行酶切。將酶切產物與兩條適配子（R Hind24,5-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3和R Hind12,5-AGCTTGCGGTGA-3）組成的接頭用T4連接酶進行連接。2.4 以連接物為摸板，做PCR擴增；并瓊脂糖凝膠電泳看連接情況。2.5 擴增子的純化 對雌蟲、雄蟲DNA的PCR產物用PCR純化試劑盒純

8、化，限制性內切酶Hind酶切。將酶切后的PCR產物過交聯(lián)葡聚糖G-50柱去除適配子接頭R Hind24和R Hind12。如此制備的雌蟲DNA為檢測子，雄蟲DNA為驅動子。2.6 扣除雜交法及PCR2.6.1 取以上的檢測子1ug連接新的適配子接頭（J Hind24 5-ACCgACgTCgACTATCCATgAACA-3和J Hind12 5-AgCTTgTTCATg-3）；然后取0.5ug帶有新接頭的檢測子與40ug的驅動子溶于4ul的3EE緩沖液中，加入1ul的5M的NaCL，扣除雜交，67、20小時；并做PCR和瓊脂糖凝膠電泳。2.6.2 將RDA的第一輪PCR產物酶切后，過交聯(lián)葡聚糖

9、G-50柱去除適配子接頭J Hind24和J Hind12，連接下一個新的適配子接頭（N Hind24 5-AggCAgCTgTggTATCgAgggAgA-3和N Hind12 5-AgCTTCTCCCTC-3），取檢測子0.1ug與40ug驅動子進行第二輪RDA，PCR和瓊脂糖凝膠電泳。2.6.3 同上，酶切后過交聯(lián)葡聚糖G-50柱去除適配子接頭N Hind24和N Hind12，再連接適配子接頭J Hind24和J Hind12，取400pg檢測子與40ug驅動子進行第三輪扣除雜交，PCR和瓊脂糖凝膠電泳。2.7 將獲得的特異性DNA片段進行低熔點瓊脂糖凝膠回收，PCR純化試劑盒純化。2

10、.8.1 制備大腸桿菌E.coli TG1感受態(tài)細胞：本實驗以E.coli TG1菌株為受體細胞，用氯化鈣處理是受體菌處于感受狀態(tài)。2.8.2 DNA的重組和克隆篩選：將獲得特異性DNA片段連接到載體質粒pUC19制得重組質粒；經(jīng)-互補現(xiàn)象篩選（藍白斑篩選）方法對重組質粒進行篩選。2.8.3 重組DNA的轉化：用電擊轉化的方法，設定電擊儀參數(shù)（電脈沖25uF、電壓2.5KV、電阻200）；吸取一定量的感受態(tài)細胞和重組質粒pUC19，加入預冷的電擊杯，放入樣品池，按以上設定參數(shù)啟動對細胞的電脈沖，儀器會顯示4-5ms具有12.5KV/cm的電場強度，脈沖結束后，將細胞取出加入到1mlSOC培養(yǎng)液

11、中復蘇1h，接種于特制平板上，37培養(yǎng)。2.8.4 挑選培養(yǎng)出的單個白色菌落，接種于液體培養(yǎng)；用質粒DNA提取試劑盒提取質粒DNA。2.9 Southern-blot 方法驗證：利用DIG DNA Labeling andDetection Kit制備DNA探針和Southern-blot驗證。3. 將經(jīng)Southern-blot方法驗證出的雌蟲特異性序列進行測序，并設計引物。4. 根據(jù)設計好的引物，對提取的成蟲基因組DNA和已知性別的尾蚴DNA作PCR，瓊脂糖凝膠電泳來進行證實。5. 根據(jù)設計好的引物，采用直接法（不提取DNA）對單個尾蚴作PCR，瓊脂糖凝膠電泳，來確定此尾蚴的性別。6日本血

12、吸蟲尾蚴性別鑒定PCR法操作條件優(yōu)化研究?，F(xiàn)有工作條件和基礎：1 工作基礎本實驗室是江蘇省寄生蟲分子生物學重點實驗室，寄生蟲學為江蘇省135重點學科，擁有清潔級小鼠動物房，從事寄生蟲免疫學和分子生物學研究二十余年，在儀器設備上完全具備進行寄生蟲免疫學和分子生物學研究以及動物試驗的的條件。有一定的專業(yè)技術和專業(yè)人員隊伍，人員配置合理。儀器設備主要包括溫控設備：4、-20、-70冰箱、THZ-95型恒溫振蕩器、SCS-24型搖床、光照培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、微波爐等；凈水設備：MilliQ水純化設備；消毒設備：高壓蒸氣滅菌鍋；計量設備：各種精密度天平、量筒、移液管及各種規(guī)格的可調試微量移液器、PH計、紫外分光光度計等；離心設備：各種不同規(guī)格的普通、高速冷凍離心機；蛋白核酸分析設備：DY-A瓊脂糖凝膠電泳儀、多功能蛋白電泳儀（Bio-Rad）、核苷酸序列分析儀（Bio-Rad）、核酸蛋白測定儀(BECKMAN)、快速蛋白液相層析系（Pharmacia）等；其它分子生物學儀器：PCR儀、超聲儀、電穿孔轉基因儀、干膠儀、酶標儀、凝膠掃描儀、影像密度掃描儀等。計劃進度：總期限一年：1-3月 采購釘螺，并篩選陰性釘螺。2-4月 購陽性釘螺并感染家兔，剖殺家兔收集成蟲和蟲卵。4-5月 單只毛蚴感染單只釘螺.4-5月 訂購試劑5-11月 分離雌蟲特異性序列，并測序和設計引物，進行尾蚴性別鑒定。11-1